판막병 내피 세포의 분리

본 비디오 프로토콜에서는 대동맥판막으로부터 상주성 간질 세포와 측면 특이적 내피 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 판막 엽을 심장에서 채취하여 차가운 식염수에 넣습니다. 내피층은 콜라겐분해효소 용액에 담긴 조직을 면봉으로 부드럽게 밀어내어 판막 엽의 양측면 모두에서 제거할 수 있으며, 측면 특이적 분리를 위해 판막 엽을 파라핀 베드에 고정하여 내피 표면이 노출되도록 합니다.

그 후 차가운 collagenase 몇 방울을 판막 엽에 첨가하고, 판막 엽을 5~10분 동안 배양합니다. collagenase 배양 후, 조직을 부드럽게 깎아내어 부위별 내피세포층을 제거합니다. 그 다음 면봉을 사용하여 분리된 내피세포를 수집하고, 세척 후 플레이트에 도말합니다.

남은 엽(leaflet)은 하룻밤 동안 소화시켜 간질 세포를 분리한 다음, 이를 수집하고 세척합니다. 분리된 모든 세포를 배양하여 국소적인 기계적 및 생물학적 신호에 반응하는 심장 판막의 복구 및 재형성 과정에서 이들이 수행하는 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Russell Gould입니다.

저는 이곳 코넬 대학교 의생명공학과 Butcher 연구실에 있습니다. 오늘은 판막 내피세포를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술의 활용 범위는 거주 내피세포가 기계적 및 생물학적 신호에 반응하여 어떻게 지속적으로 복구하고 재형성하는지를 이해하는 데까지 확장됩니다.

그럼 시작하겠습니다. 먼저, 지역 도축장에서 돼지를 확보하고 무균 상태에서 대동맥근을 절제하십시오. 대동맥근에 묻은 혈액을 철저히 헹궈냅니다.

차가운 멸균 DPBS를 사용하여 판막 내피세포(VEC)의 사멸과 세균 오염을 제한하기 위해 가능한 한 빨리 모든 혈액 성분을 제거하는 것이 필수적입니다. 항생제와 항진균제는 세포에 잠재적으로 유해할 수 있으므로 이 단계에서는 권장되지 않습니다. 다음으로, root three에서 직접 분리하십시오.

각 판막의 판막엽을 수집합니다. 판막륜 조직이 섞이면 세포 집단이 오염될 수 있으므로 판막엽을 분리할 때 주의하십시오. 분리한 판막엽을 차가운 DPBS 12 mL가 들어 있는 멸균 15 mL 원추형 튜브에 넣습니다.

찌꺼기를 제거하기 위해 여러 번 흔들어준 다음, 신선한 DPBS로 다시 채웁니다. 마지막으로, 밸브 엽(leaflet)을 얼음에 실어 실험실로 운반합니다. 실험실에 도착하면 조직이 담긴 용기를 멸균 후드 내에 두고 내피층 분리를 진행하며, 톱니 모양 조직 핀셋, 조직 가위, 면봉을 덮개가 있는 기구 트레이에 넣어 오토클레이브로 멸균합니다.

또한 동반된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 멸균된 콜라게나아제 용액, 혈관 내피 세포 배지와 간질 세포 배지를 준비하십시오. 멸균된 35 millimeter 디쉬에 밸브당 3 milliliters의 차가운 콜라게나아제 용액을 채우고, 15 milliliter 튜브에 들어 있는 3개의 엽(leaflet)을 모두 디쉬에 넣으십시오.

조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다. 그다음, 건조된 멸균 면봉을 표면에 대고 회전시켜 리플렛(leaflet) 양측의 내피세포층을 조심스럽게 제거합니다. 회전 방향과 가해지는 전단력의 정도는 샘플의 순도에 결정적인 영향을 미칩니다.

면봉의 회전 방향은 면봉을 쥔 손의 직선 운동 방향과 반대여야 합니다. 이를 통해 내피세포를 조직에서 떼어낼 수 있는 제어된 전단력이 발생합니다. 가해지는 힘은 조직의 저항이 느껴질 정도여야 하지만, 기저막을 관통하지 않아야 합니다. 세포가 면봉 팁의 섬유에서 떨어져 나올 수 있도록 가끔씩 콜라게나제(collagenase) 용액에 면봉을 살짝 찍어줍니다.

스와빙이 완료되면 내피층의 질감이 이전보다 약간 더 부드럽게 느껴져야 합니다. 콜라게나제 용액에 부유된 세포를 수집하여 새로운 멸균 15 ml 튜브로 옮깁니다. 판막엽에서 내피세포를 스와빙하여 제거한 후, 즉시 해당 판막엽을 간질세포 분리를 위해 10 ml의 콜라게나제 용액이 담긴 15 ml 튜브에 넣습니다.

분리된 세포를 침전시키기 위해 튜브를 상온에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 15 mL 튜브에 혈관내피세포 배양액 3 mL를 첨가합니다. 이전과 동일하게 다시 한번 원심 분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다.

이 두 번째 원심분리는 팁 섬유와 같은 불필요한 물질 일부를 걸러내는 데 도움이 됩니다. 원심분리된 혈관내피세포를 5 mL의 혈관내피세포 배지에 다시 현탁하고, 콜라겐이 사전 코팅된 T 25 플라스크에 세포를 분주합니다. 원심분리 튜브 하나당 플라스크 하나를 사용하여, 혈관내피세포 배지를 교체하기 전까지 세포를 최소 2~3일 동안 배양합니다.

이는 세포의 회복과 분열을 돕습니다. 분리 과정이 상당히 까다롭고 세포 수율이 낮을 수 있으므로, 세포가 거의 confluent 상태에 도달했을 때 계대 배양하는 것이 중요합니다. 접촉 저해로 인해 세포 변형이 일어날 수 있으므로, 내피 세포를 특정 측면에서 분리할 수도 있습니다.

이를 위해 먼저 파라핀 베드 층이 포함된 페트리 접시를 준비합니다. 알루미늄 호일을 깐 60 millimeter 유리 페트리 접시를 사용합니다. 소엽 하나당 유리 접시 두 개를 계산하여 준비하십시오.

알루미늄 호일은 페트리 접시를 재사용하기 위해 파라핀을 제거하는 데 도움을 줍니다. 다음으로 페트리 접시에 파라핀 비즈를 약 절반 정도 채우고 덮개를 덮어 오토클레이브 멸균을 진행합니다. 오토클레이브 과정이 끝나고 파라핀이 녹으면, 접시 묶음을 평평하고 시원한 표면으로 옮깁니다.

파라핀이 식으면서 굳어 바늘 찌르기를 지지할 수 있는 층이 형성됩니다. 60분 후, 멸균된 접시를 사용하여 판막 조직을 고정할 수 있습니다. 15 milliliter 튜브에서 분리된 판막 엽을 꺼내 파라핀 층 위에 놓으십시오.

심실 측이 파라핀 표면을 향해 아래로 가도록 엽(leaflet)을 조작하여 섬유화된 측이 노출되게 합니다. 엽의 가장자리를 핀으로 고정하여 내피층이 드러나게 합니다. 다음으로 위를 향한 각 내피 표면에 차가운 콜라게나아제(collagenase)를 몇 방울 떨어뜨리고, 조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다.

배양이 완료되면, 이전과 같이 건조한 멸균 면봉을 리플렛 표면에 대고 회전시켜 내피세포층을 부드럽게 제거합니다. 면봉 끝의 섬유에서 세포가 떨어져 나오도록 가끔 콜라게나제 용액에 면봉을 살짝 적십니다. 스와빙이 완료된 후, 내피세포층의 질감은 이전보다 약간 더 매끄럽게 느껴져야 합니다.

세포 현탁액을 수집하여 새로운 멸균 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 라벨에 측면 특이성을 표시하십시오. 동일한 판막에서 유래한 리플릿들은 함께 풀링할 수 있습니다. 고정된 판막을 차가운 DPBS 몇 방울로 헹구어 남아 있는 세포나 파편을 씻어냅니다.

심실 측이 위로 노출되도록 리플렛을 새 배양 접시로 옮긴 후, 방금 보여드린 대로 혈관 내피세포를 수집합니다. G 리플렛에서 혈관 내피세포 스와빙을 완료하면, 즉시 리플렛을 10 mL의 콜라게나제 용액이 담긴 15 mL 튜브에 넣습니다. 혈관 내피세포의 비특이적 부위 분리 방법에서 보여드린 것과 같이 세포를 세척하고 재현탁하여 배양합니다.

세포 수율이 매우 낮은 경우에는 더 작은 플라스크로 옮기거나 웰 플레이트를 사용하는 것을 고려하십시오. 세포 간 접착은 세포 성장을 촉진하므로, 세포가 거의 confluence 상태에 도달했을 때 계대 배양해야 함을 유의하십시오. 접촉 저해는 세포 변형을 유발할 수 있으므로, 내피 세포를 원심 분리하는 동안 간질 세포 분리를 시작하며, 리플렛이 담긴 튜브를 약 12~18시간 동안 배양하십시오.

원하는 경우 가볍게 흔들어주며 콜라게나아제 용액에 넣습니다. 배양 기간이 끝나면, 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액이 균질해질 때까지 소화된 조직을 부드럽게 섞습니다. 이러한 균질화 과정은 조직을 분해하여 간질 세포를 방출하는 데 도움이 됩니다. 혈관 내피 세포의 경우와 마찬가지로 세포를 원심 분리하고 세척합니다.

간질 배지 현탁액 5 mL를 사용하는 대신, 원심분리된 간질 세포를 15 mL의 간질 배지에 부유시키고 원심분리 튜브 하나당 플라스크 하나를 사용하여 T 75 플라스크에 세포를 분주합니다. 간질 배지를 교체하기 전 최소 1~2일 동안 세포를 배양하며, 이때 내피 세포보다 더 많은 조직 파편이 발생할 수 있습니다. 또한, 간질 세포는 본래 내피 세포보다 더 빠르게 합류(confluence) 상태에 도달하며, 제시된 이미지에서와 같이 더 높은 세포 수율을 제공합니다.

배양된 V Cs 판막 내피세포와 판막 간질세포의 형태가 2~3일 차에 나타나 있습니다. Becs는 세포가 cobblestone 패턴을 보이며 군집을 형성하기 시작하는 전형적인 내피세포 형태를 나타냅니다.

VS.Exhibit의 형태는 세포가 일반적으로 방추형이며 합류율(confluency)까지 배양했을 때 밀도가 낮다는 점에서 근섬유아세포와 유사합니다. ECS는 세포가 자갈 모양(cobblestone pattern)을 이루고 성장이 접촉 저해되는 전형적인 내피세포 형태를 보입니다. VI CS는 세포가 일반적으로 방추형이며 접촉 저해가 일어나지 않는 근섬유아세포와 유사한 형태를 보입니다. VEC와 VIC 모두의 기능적 특성은 염색을 통해 추론할 수 있습니다. For a ated LDL uptake.

VEC 세포는 높은 수준의 아세틸화 LDL 흡수와 관련이 있습니다. 반면 VIC 세포는 낮은 수준의 아세틸화 LDL 흡수와 관련이 있으며, 여기에서는 VEC와 VIC의 세포 마커가 표시되어 있습니다. ECS는 von Willebrand factor에 대해 양성으로 염색되는 반면

von Willebrand factor 염색이 나타나지 않아야 합니다. 또한, V CS는 alpha smooth muscle actin에 대해 음성으로 염색되는 반면, V CS는 alpha smooth muscle actin에 대해 양성으로 염색됩니다. 오늘 저희의 분리 과정을 통해 많은 것을 배우셨기를 바랍니다.

하지만 혈관 내피 세포 기저막은 매우 취약하며, 하부 매트릭스의 손상은 흔히 조직의 나머지 부분으로부터 오염 세포를 유출시킨다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 성공적인 분리를 확인하기 위해서는 분리된 세포의 순도를 평가하는 특성 분석이 매우 중요합니다. 그럼 행운을 빕니다.