Name: 판막병 내피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 학습하세요 대동맥 판막에서 판막 내피 세포를 분리하는 방법을. 콜라게나아제 용액과 면봉을 사용하여 양면의 내피층을 부드럽게 박리하고 순수한 세포 집단을 얻습니다. 이 기술은 심혈관 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NSF 경력 수상, 하트웰 재단, 그리고 미국 심장 협회 (# 0830384N)에 의해 지원됩니다.

1. 준비 <ol><li> 대상 기기에 압력솥은 다음 항목을 트레이 : <ol><li> 톱니 모양의 조직 포셉 - 전단지 조직을 처리 </li><li> 조직 가위 (8cm) - 전단지 조직 및 cusps을 트리밍을 위해 </li><li> 면화 면봉 - 전단지 또는 끝에서 내피 레이어를 격리 시킨것에 대한 </li></ol></li><li> 무균 collagenase 솔루션을 확인하십시오 <ol><li> 18 MΩ 물 250 ML에 가루 DMEM의 4.0 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염의 1.11 g을 추가합니다. </li><li> (600 U / ML) collagenase의 180,000 단위를 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (3mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 270 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 태아 소 혈청의 10 % (30mL) 추가합니다. </li></ol></li><li> 무균 내피 세포 미디어 만들기 <ol><li> 18 MΩ 물 400 ML에 가루 DMEM의 6.7 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염의 1.85 g을 추가합니다. </li><li> (50 U / ML) 헤파린의 25,000 단위를 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (5mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 450 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 태아 소 혈청의 10 % (50mL)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 무균 중간 세포 미디어를 확인 <ol><li> 18 MΩ 물 800 ML에 가루 DMEM의 13.37 g을 추가합니다. </li><li> 나트륨 중탄산염 3.7 g을 추가합니다. </li><li> 1퍼센트 (10mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다. </li><li> 900 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독. </li><li> 무균 소 혈청의 10 % (100mL)를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 심장 밸브 전단지의 분리 <ol><li> 희생 후 마음에서 즉시 무균 엑사이스 대동맥 루트. </li><li> 철저하게 추위 무균 DPBS과 혈액의 대동맥 뿌리를 씻어. 그것은 VEC의 죽음과 박테리아 오염을 제한하는 모든 혈액 구성 요소를 가능한 한 빨리를 제거하는 필수적입니다. 그들은 VEC에 잠재적으로 해로운 있기 때문에 항생제와 antimycotics이 단계에서 권고하지 않습니다. </li><li> 바로 12 ML 감기 DPBS 가득한 살균 15 ML 원뿔 관에 뿌리와 장소에서 밸브 전단지 (3 밸브 당) 분리. 신선한 DPBS와 파편과 리필을 제거하기 위해 여러 번 흔들어. </li><li> 얼음에있는 실험실로 이송합니다. </li><li> 실험실에 도착하자마자, 멸균 후드 아래에있는 조직과 용기를 놓습니다. </li></ol> 3. 내피 층의 분리 <ol><li> 밸브마다 감기 collagenase 솔루션 (3 전단지)을 3mL와 살균 35mm 요리를 입력합니다. </li><li> collagenase 솔루션 가득 그릇에 15 ML 관에서 세 전단지를 놓습니다. </li><li> 37 5-10분에 대한 조직을 품어 ° C. </li><li> 부드럽게 전단지의 표면에 건조한 멸균 면봉을 돌려 내피 층을 제거합니다. 전단 적용의 회전과 금액의 방향은 샘플의 순도를 위해 중요합니다. 면봉의 회전이 제어 전단을 만드는 손의 직선 운동에 반대 방향으로해야합니다. 이 전단은 조직에서 내피 세포 리프트 무엇입니까. 강제 적용의 금액은 조직의 저항을 느낄하지만, 지하 막에 침투하지 않도록 충분해야합니다. </li><li> 때때로 소량의 collagenase 솔루션 내에서 면봉은 팁 섬유에서 세포를 이동시키다 수 있습니다. 보라고가 완료되면, 내피 층의 질감보다 약간 부드러워지는 느낌한다. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase를 수집하고 새로운 살균 15mL 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 펠렛 5 분 어떤 고립된 세포 1,000 RPM에서 튜브를 원심과 뜨는을 대기음. 뿐만 아니라 중간 세포를 분리하는 경우 이러한 세포가 centrifuged되고있는 동안, 그 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 내피 돼지의 매체 3 ML 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기하고, 기음 미디어. 이 초 원심 분리는 팁 섬유로 불필요한 자료의 일부를 필터링하는 데 도움이됩니다. </li><li> centrifuged 내피 세포가 콜라겐과 사전 코팅 T - 25 플라스크 (사용 원심 분리기 튜브 당 1 플라스크)에 내피 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포가 내피 매체를 변경하기 전에 최소한 2~3일 성장하자. 이것은 세포가 회복과 격리 프로세스가 매우 거칠고이고 세포 수율이 낮은 수 있기 때문에 나눌 수 있습니다. 연락처 억제가 세포 변형을 초래할 수 있으므로이 코플루엔스 근처 통로 세포에 중요합니다. </li></ol> 4. 사이드 특정 절연을위한 60mm 문화 요리의 준비 <ol><li> 알루미늄 호일 (와 라인 60mm 유리 배양 접시 당 leafle이 유리 요리T). 알루미늄 포일은 유리 페트리 접시는 다른 isolations 위해 재사 용할 수 있도록, 파라핀을 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 반쯤 찼다고에 대한, 요리 이내 파라핀 비즈를 삽입하고, autoclaving 커버. </li><li> autoclaving가 완료되고 파라핀이 녹아되면 시원한 평면으로 요리의 앙상블 이동합니다. 파라핀이 차가워지면서, 그것은 강화가되며 바늘 자국을 지원하는 레이어를 만들 수 있습니다. </li><li> 30 분 후에, 살균 요리는 다음 전단지 조직을 고정하기 위해 격리 챔버로 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 사이드 특정 내피 층의 분리 <ol><li> 측면 특정 격리 준비 60mm 문화 접시에있는 15mL 튜브 장소에서 전단지를 제거합니다. </li><li> ventricularis 측면이 fibrosa 측면이 노출 떠나는 파라핀 표면에 내려 얼굴 있도록 전단지를 조작. 내피 층을 노출하는 전단지의 가장자리를 핀. </li><li> 37 각 (이상 방향) 내피 표면에 감기 collagenase 몇 방울을 넣고 50-10분에 대한 조직을 품어 ° C. </li><li> 전처럼 부드럽게 전단지의 표면에 건조한 멸균 면봉을 돌려 내피 층을 제거합니다. 전단 적용의 회전과 금액의 방향은 샘플의 순도를 위해 중요합니다. 면봉의 회전이 제어 전단을 만드는 손의 직선 운동에 반대 방향으로해야합니다. 이 전단은 조직과 다른 아무것도에서 내피 세포 리프트 무엇입니까. 강제 적용의 금액은 조직의 저항을 느낄 수 있지만, 조직 내에 침투하지 않는 정도로해야합니다. </li><li> 때때로 소량의 collagenase 솔루션 내에서 면봉은 팁 섬유에서 세포를 이동시키다 수 있습니다. 보라고가 완료되면, 내피 층의 질감보다 약간 부드러워지는 느낌한다. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase를 수집하고 새로운 살균 15mL 튜브로 전송할 수 있습니다. 라벨 측면 특이성을 (같은 밸브의 전단지를 함께 풀링 수 있음)을 나타냅니다. </li><li> ventricularis 측면 이제 노출 및 반복 단계 (5.3-5.6)되도록 새로운 문화 요리에 전단지를 전송합니다. </li><li> 모든 세포 현탁액 / collagenase가 수집되면, 펠렛 어떤 격리 세포 오분 1,000 RPM에서 튜브를 원심과 뜨는을 대기음. 뿐만 아니라 중간 세포를 분리하는 경우 이러한 세포가 centrifuged되고있는 동안, 그 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 튜브에 내피 돼지의 매체 3 ML 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기, 그리고 미디어를 대기음. 이 초 원심 분리는 팁 섬유로 불필요한 자료의 일부를 필터링하는 데 도움이됩니다. </li><li> centrifuged 내피 세포가 합성 (원심 분리기 튜브마다 사용하는 한 플라스크)로 사전 코팅 T - 25 플라스크에 내피 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 세포가 내피 매체를 변경하기 전에 최소한 2~3일 성장하자. 이것은 세포가 회복과 격리 프로세스가 매우 거친이기 때문에 나눌 수 있습니다. 당신은 생산량이 매우 낮을 것으로 예고 경우, 세포 세포의 부착은 세포 성장을 촉진 때문에 작은 술병이나 잘 플레이트로 이동 고려해보십시오. 연락처 억제가 세포 변형을 초래할 수 있으므로 합류 근처에 통과해야합니다. </li></ol> 6. 중간 세포의 분리 <ol><li> 밸브마다 collagenase 솔루션 (3 전단지) 10 ML과 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브를 입력합니다. </li><li> 내피 세포의 전단지를 보라고 후, 즉시 collagenase 솔루션 해당 15mL 튜브에서 그들을 놓으십시오. </li><li> (원하는 경우 부드럽게 선동) 약 12​​-18시간위한 부화. </li><li> 세포 현탁액 / collagenase가 균질 될 때까지 serological 피펫과 함께 부드럽게 저하된 조직을 섞는다. 이 균질의 조직을 헤어지게하고 중간 세포를 출시하는 데 도움이됩니다. </li><li> 1,000 RPM에서 5 분 동안 소화 조직을 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. </li><li> 15mL 튜브 5 ML 중간 돼지의 매체를 추가, 두 번째 시간을 원심 분리기 및 supernate을 대기음. </li><li> centrifuged 내피 세포의 중간 돼지의 미디어 및 플레이트 세포 5 ML에 다시 중단 T - 75 플라스크 (원심 분리기 튜브 당 1 플라스크를 사용하여). </li><li> 세포는 중간 세포 매체를 변경하기 전에 최소한 1-2일 성장하자. 예상되는 내피 세포하지만,보다 많은 조직 파편있을 것입니다. 세포는 또한 빠른 때문에 세포 수율과 자연의 내피 세포보다 합류로 성장한다. </li></ol> 7. 대표 이미지 <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 2-3일 게시물 절연의 절연 세포의 형태. (A) VEC는 일반 내피 형태학 및 형태의 성장을 촉진하기 위해 클러스터를 나타냅니다. (B) VIC의 형태는 일반적으로 스핀들 모양과 술병에 걸쳐 균등하게 분산시키고 myofibroblasts 비슷합니다. 그림 2. confluency에서 분리된 세포의 형태. (A) VEC은 일반적으로 조약돌과 성장 접촉 저해하는 전형적인 내피 형태를 나타냅니다. (B) VIC의 형태는 일반적으로 스핀들 모양이 아니라 성장 접촉 저해 아르 myofibroblasts 비슷합니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 격리 세포의 기능 특성 6. (A) VEC는 acetylated LDL 이해 높은 수준의 (적색)과 연결되어 있습니다. (B) VIC는 acetylated LDL 이해의 낮은 수준과 관련됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 절연 세포 6 세포 마커. (A) VEC의 표현형는 본 Willebrand 팩터 (녹색), 파랑 (핵)에 대한 긍정적인 얼룩에 기여합니다. (B) VIC의 표현형는 본 Willebrand 팩터에 대한 부정적인 얼룩에 기여합니다. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 격리 세포의 세포 마커. (A) VEC의 표현형는 알파 SMA (녹색), 파랑 (핵)에 대한 부정적인 얼룩에 기여합니다. (B) VIC의 표현형는 알파 SMA에 대한 긍정적인 얼룩에 기여합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 해리 에이전트 </td><td> 분리 기술 </td><td> 셀 컬렉션 </td><td> 셀 수량 </td><td> 세포 퓨리티 </td><td> 오염 </td></tr><tr><td> CaCl 2없이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3mM) </td><td> 5, 20, 60 분. CaCl 2뿐만 아니라 전 </td><td> 20, 60, 120 분. 수령 전에 </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> CaCl 2없이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (6mM) </td><td> 5, 20, 60 분. CaCl 2뿐만 아니라 전 </td><td> 20, 60, 120 분. 수령 전에 </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / ML) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> -, +, + + </td><td> - + + + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / ML) </td><td> 5, 10, 15 분. 비활성화하기 전에 </td><td> 매체 즉시 수집 </td><td> +, + +, + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> 표 1. 예비 밸브 모양의 내피 세포 격리 프로토콜의 결과.

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
<li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+production+of+glycosaminoglycans%2C+prostacyclin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li>
<li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JHVD%22%5BJournal%5D)">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li>
<li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Bio%22%5BJournal%5D)">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li>
<li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li>
<li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences%3A+Influence+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li>
<li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial%2FMesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li>
<li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte%2Fmacrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

밸브 모양의 생물학의 이해는 분리 기술적인 문제 및 밸브 모양의 내피 세포의 culturing 순수 인구에 의해 장애인되었습니다. 일반 절연 기술 기본 기초 매트릭스 또는 내피 접착 채권 2,3의 화학 분해 효소의 소화를 포함. 예비 분리 실험은 질적으로 분리 직원과 부화 기간 변화에 의해 평가되었다. 이러한 실험의 결과는 최대 60 분 동안 그 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (또는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 부화가 dislodging 세포에 실패했습니다했다. 그러나, 50~10분위한 collagense의 소화는 순수한 밸브 모양의 내피 세포 (표 1)의 사용 가능한 번호를 검색하는 효과 입증. 기타 효소 솔루션은 이러한 dispase, 특히 기본 매트릭스 4의 주요 구성 요소입니다 콜라겐 유형 IV 및 fibronectin를 대상으로 수있는 metalloprotease과 보완으로 제안되었습니다. 해방 세포는 같은 clonal 확장이나 자기 선택 ...

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨염(Heparin Sodium Salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>콜라게나제 Type 2(Collagenase Type 2)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>쥐 꼬리 콜라겐(Rat Tail Collagen)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면봉(Critical Swabs)</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm 디쉬</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>60x15 유리 디쉬</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 매몰 왁스(Paraffin Embedding Wax)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>정밀 글라이드 바늘(Precision Glide Needles)</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Nalgene 필터</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>1L Nalgene 필터</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>조직 포셉(Tissue Forceps)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>FSC 핀셋 #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

판막병 내피 세포의 분리

Isolation of Valvular Endothelial Cells

심장 판막은 심장 혈관 시스템을 통해 단방향 혈액 흐름을 유지하는 책임은 전적으로 귀하에게 있습니다. 이 얇고 섬유질 조직들은 수명 동안 억 여러 번 열고 닫는 등 상당한 기계적 스트레스를 받게됩니다. 이러한 조직의 놀라운 인내력은 내피 거주 판막병 (VEC)와 중간 세포에 의한 (VIC)는 지속적으로 지방 기계 및 생물 학적 신호에 대한 응답으로 수리 및 개조. 최근 우리는 시험 관내 실험에서 중요한 역할을 담당해 왔습니다있는 이들 세포의 독특한 행동을 이해하기 시작했다. 특히 도전은 VEC의 격리와 문화입니다. 특별한주의는 순간부터 조직이 최종 도금을 통해 호스트에서 제거됩니다 사용해야합니다. 여기 우리는 직접적인 고립, 측면 구체적인 고립, 문화, VEC의 순수한 인구의 검증을위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 표면 세포를 이동시키다하는 부드러운 면봉 사장을 때릴 때의 기술 다음 효소 소화를 사용합니다. 이러한 세포는 다음 튜브에 수집하여 펠렛으로 centrifuged 있습니다. 펠렛은 다음 resuspended과 콜라겐 I 매트릭스 사전 코팅 문화 flasks로 도금입니다. VEC의 표현형가 접촉에 의해 확인하는 것은 성장과 같은 PECAM1 (CD31)로 내피 특정 마커의 표현을 저해, 폰 Willebrand 팩터 (vWF), 그리고 알파 - 부드러운 근육 굴지 (α - SMA)의 부정적인 표현. VEC의 기능적 특성은 acetylated LDL 높은 수준의와 관련된 있습니다. 혈관 내피 세포와는 달리, VEC는 일반적으로 배아 밸브 형성 한 동안 발생 mesenchyme로 변환하는 독특한 능력을했습니다. 이것은 또한 체외 문화에 크게 연장 게시물 합류하는 동안 발생할 수 있으므로주의가 합류 또는 가까운 통로로하여야한다. VEC 분리 후, VIC의 순수한 인구 그때 쉽게 취득하실 수 있습니다.

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

심장 판막은 심혈관계 전체에서 혈액의 단방향 흐름을 유지하는 유일한 역할을 담당합니다. 이 얇은 섬유성 조직은...

본 비디오 프로토콜에서는 대동맥판막으로부터 상주성 간질 세포와 측면 특이적 내피 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 판막 엽을 심장에서 채취하여 차가운 식염수에 넣습니다. 내피층은 콜라겐분해효소 용액에 담긴 조직을 면봉으로 부드럽게 밀어내어 판막 엽의 양측면 모두에서 제거할 수 있으며, 측면 특이적 분리를 위해 판막 엽을 파라핀 베드에 고정하여 내피 표면이 노출되도록 합니다.그 후 차가운 collagenase 몇 방울을 판막 엽에 첨가하고, 판막 엽을 5~10분 동안 배양합니다. collagenase 배양 후, 조직을 부드럽게 깎아내어 부위별 내피세포층을 제거합니다. 그 다음 면봉을 사용하여 분리된 내피세포를 수집하고, 세척 후 플레이트에 도말합니다.남은 엽(leaflet)은 하룻밤 동안 소화시켜 간질 세포를 분리한 다음, 이를 수집하고 세척합니다. 분리된 모든 세포를 배양하여 국소적인 기계적 및 생물학적 신호에 반응하는 심장 판막의 복구 및 재형성 과정에서 이들이 수행하는 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Russell Gould입니다.저는 이곳 코넬 대학교 의생명공학과 Butcher 연구실에 있습니다. 오늘은 판막 내피세포를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 기술의 활용 범위는 거주 내피세포가 기계적 및 생물학적 신호에 반응하여 어떻게 지속적으로 복구하고 재형성하는지를 이해하는 데까지 확장됩니다.그럼 시작하겠습니다. 먼저, 지역 도축장에서 돼지를 확보하고 무균 상태에서 대동맥근을 절제하십시오. 대동맥근에 묻은 혈액을 철저히 헹궈냅니다.차가운 멸균 DPBS를 사용하여 판막 내피세포(VEC)의 사멸과 세균 오염을 제한하기 위해 가능한 한 빨리 모든 혈액 성분을 제거하는 것이 필수적입니다. 항생제와 항진균제는 세포에 잠재적으로 유해할 수 있으므로 이 단계에서는 권장되지 않습니다. 다음으로, root three에서 직접 분리하십시오.각 판막의 판막엽을 수집합니다. 판막륜 조직이 섞이면 세포 집단이 오염될 수 있으므로 판막엽을 분리할 때 주의하십시오. 분리한 판막엽을 차가운 DPBS 12 mL가 들어 있는 멸균 15 mL 원추형 튜브에 넣습니다.찌꺼기를 제거하기 위해 여러 번 흔들어준 다음, 신선한 DPBS로 다시 채웁니다. 마지막으로, 밸브 엽(leaflet)을 얼음에 실어 실험실로 운반합니다. 실험실에 도착하면 조직이 담긴 용기를 멸균 후드 내에 두고 내피층 분리를 진행하며, 톱니 모양 조직 핀셋, 조직 가위, 면봉을 덮개가 있는 기구 트레이에 넣어 오토클레이브로 멸균합니다.또한 동반된 서면 프로토콜에 상세히 설명된 대로 멸균된 콜라게나아제 용액, 혈관 내피 세포 배지와 간질 세포 배지를 준비하십시오. 멸균된 35 millimeter 디쉬에 밸브당 3 milliliters의 차가운 콜라게나아제 용액을 채우고, 15 milliliter 튜브에 들어 있는 3개의 엽(leaflet)을 모두 디쉬에 넣으십시오.조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다. 그다음, 건조된 멸균 면봉을 표면에 대고 회전시켜 리플렛(leaflet) 양측의 내피세포층을 조심스럽게 제거합니다. 회전 방향과 가해지는 전단력의 정도는 샘플의 순도에 결정적인 영향을 미칩니다.면봉의 회전 방향은 면봉을 쥔 손의 직선 운동 방향과 반대여야 합니다. 이를 통해 내피세포를 조직에서 떼어낼 수 있는 제어된 전단력이 발생합니다. 가해지는 힘은 조직의 저항이 느껴질 정도여야 하지만, 기저막을 관통하지 않아야 합니다. 세포가 면봉 팁의 섬유에서 떨어져 나올 수 있도록 가끔씩 콜라게나제(collagenase) 용액에 면봉을 살짝 찍어줍니다.스와빙이 완료되면 내피층의 질감이 이전보다 약간 더 부드럽게 느껴져야 합니다. 콜라게나제 용액에 부유된 세포를 수집하여 새로운 멸균 15 ml 튜브로 옮깁니다. 판막엽에서 내피세포를 스와빙하여 제거한 후, 즉시 해당 판막엽을 간질세포 분리를 위해 10 ml의 콜라게나제 용액이 담긴 15 ml 튜브에 넣습니다.분리된 세포를 침전시키기 위해 튜브를 상온에서 1000 RPM으로 5분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 15 mL 튜브에 혈관내피세포 배양액 3 mL를 첨가합니다. 이전과 동일하게 다시 한번 원심 분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다.이 두 번째 원심분리는 팁 섬유와 같은 불필요한 물질 일부를 걸러내는 데 도움이 됩니다. 원심분리된 혈관내피세포를 5 mL의 혈관내피세포 배지에 다시 현탁하고, 콜라겐이 사전 코팅된 T 25 플라스크에 세포를 분주합니다. 원심분리 튜브 하나당 플라스크 하나를 사용하여, 혈관내피세포 배지를 교체하기 전까지 세포를 최소 2~3일 동안 배양합니다.이는 세포의 회복과 분열을 돕습니다. 분리 과정이 상당히 까다롭고 세포 수율이 낮을 수 있으므로, 세포가 거의 confluent 상태에 도달했을 때 계대 배양하는 것이 중요합니다. 접촉 저해로 인해 세포 변형이 일어날 수 있으므로, 내피 세포를 특정 측면에서 분리할 수도 있습니다.이를 위해 먼저 파라핀 베드 층이 포함된 페트리 접시를 준비합니다. 알루미늄 호일을 깐 60 millimeter 유리 페트리 접시를 사용합니다. 소엽 하나당 유리 접시 두 개를 계산하여 준비하십시오.알루미늄 호일은 페트리 접시를 재사용하기 위해 파라핀을 제거하는 데 도움을 줍니다. 다음으로 페트리 접시에 파라핀 비즈를 약 절반 정도 채우고 덮개를 덮어 오토클레이브 멸균을 진행합니다. 오토클레이브 과정이 끝나고 파라핀이 녹으면, 접시 묶음을 평평하고 시원한 표면으로 옮깁니다.파라핀이 식으면서 굳어 바늘 찌르기를 지지할 수 있는 층이 형성됩니다. 60분 후, 멸균된 접시를 사용하여 판막 조직을 고정할 수 있습니다. 15 milliliter 튜브에서 분리된 판막 엽을 꺼내 파라핀 층 위에 놓으십시오.심실 측이 파라핀 표면을 향해 아래로 가도록 엽(leaflet)을 조작하여 섬유화된 측이 노출되게 합니다. 엽의 가장자리를 핀으로 고정하여 내피층이 드러나게 합니다. 다음으로 위를 향한 각 내피 표면에 차가운 콜라게나아제(collagenase)를 몇 방울 떨어뜨리고, 조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다.배양이 완료되면, 이전과 같이 건조한 멸균 면봉을 리플렛 표면에 대고 회전시켜 내피세포층을 부드럽게 제거합니다. 면봉 끝의 섬유에서 세포가 떨어져 나오도록 가끔 콜라게나제 용액에 면봉을 살짝 적십니다. 스와빙이 완료된 후, 내피세포층의 질감은 이전보다 약간 더 매끄럽게 느껴져야 합니다.세포 현탁액을 수집하여 새로운 멸균 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 라벨에 측면 특이성을 표시하십시오. 동일한 판막에서 유래한 리플릿들은 함께 풀링할 수 있습니다. 고정된 판막을 차가운 DPBS 몇 방울로 헹구어 남아 있는 세포나 파편을 씻어냅니다.심실 측이 위로 노출되도록 리플렛을 새 배양 접시로 옮긴 후, 방금 보여드린 대로 혈관 내피세포를 수집합니다. G 리플렛에서 혈관 내피세포 스와빙을 완료하면, 즉시 리플렛을 10 mL의 콜라게나제 용액이 담긴 15 mL 튜브에 넣습니다. 혈관 내피세포의 비특이적 부위 분리 방법에서 보여드린 것과 같이 세포를 세척하고 재현탁하여 배양합니다.세포 수율이 매우 낮은 경우에는 더 작은 플라스크로 옮기거나 웰 플레이트를 사용하는 것을 고려하십시오. 세포 간 접착은 세포 성장을 촉진하므로, 세포가 거의 confluence 상태에 도달했을 때 계대 배양해야 함을 유의하십시오. 접촉 저해는 세포 변형을 유발할 수 있으므로, 내피 세포를 원심 분리하는 동안 간질 세포 분리를 시작하며, 리플렛이 담긴 튜브를 약 12~18시간 동안 배양하십시오.원하는 경우 가볍게 흔들어주며 콜라게나아제 용액에 넣습니다. 배양 기간이 끝나면, 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액이 균질해질 때까지 소화된 조직을 부드럽게 섞습니다. 이러한 균질화 과정은 조직을 분해하여 간질 세포를 방출하는 데 도움이 됩니다. 혈관 내피 세포의 경우와 마찬가지로 세포를 원심 분리하고 세척합니다.간질 배지 현탁액 5 mL를 사용하는 대신, 원심분리된 간질 세포를 15 mL의 간질 배지에 부유시키고 원심분리 튜브 하나당 플라스크 하나를 사용하여 T 75 플라스크에 세포를 분주합니다. 간질 배지를 교체하기 전 최소 1~2일 동안 세포를 배양하며, 이때 내피 세포보다 더 많은 조직 파편이 발생할 수 있습니다. 또한, 간질 세포는 본래 내피 세포보다 더 빠르게 합류(confluence) 상태에 도달하며, 제시된 이미지에서와 같이 더 높은 세포 수율을 제공합니다.배양된 V Cs 판막 내피세포와 판막 간질세포의 형태가 2~3일 차에 나타나 있습니다. Becs는 세포가 cobblestone 패턴을 보이며 군집을 형성하기 시작하는 전형적인 내피세포 형태를 나타냅니다.VS.Exhibit의 형태는 세포가 일반적으로 방추형이며 합류율(confluency)까지 배양했을 때 밀도가 낮다는 점에서 근섬유아세포와 유사합니다. ECS는 세포가 자갈 모양(cobblestone pattern)을 이루고 성장이 접촉 저해되는 전형적인 내피세포 형태를 보입니다. VI CS는 세포가 일반적으로 방추형이며 접촉 저해가 일어나지 않는 근섬유아세포와 유사한 형태를 보입니다. VEC와 VIC 모두의 기능적 특성은 염색을 통해 추론할 수 있습니다. For a ated LDL uptake.VEC 세포는 높은 수준의 아세틸화 LDL 흡수와 관련이 있습니다. 반면 VIC 세포는 낮은 수준의 아세틸화 LDL 흡수와 관련이 있으며, 여기에서는 VEC와 VIC의 세포 마커가 표시되어 있습니다. ECS는 von Willebrand factor에 대해 양성으로 염색되는 반면von Willebrand factor 염색이 나타나지 않아야 합니다. 또한, V CS는 alpha smooth muscle actin에 대해 음성으로 염색되는 반면, V CS는 alpha smooth muscle actin에 대해 양성으로 염색됩니다. 오늘 저희의 분리 과정을 통해 많은 것을 배우셨기를 바랍니다.하지만 혈관 내피 세포 기저막은 매우 취약하며, 하부 매트릭스의 손상은 흔히 조직의 나머지 부분으로부터 오염 세포를 유출시킨다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 성공적인 분리를 확인하기 위해서는 분리된 세포의 순도를 평가하는 특성 분석이 매우 중요합니다. 그럼 행운을 빕니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오 프로토콜은 인간의 탯줄에서 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 고립과 문화를 보여줍니다. 일단 이러한 세포도 휴스 연구소에 의해 입증 최적화된 섬유소 젤 비드 분석처럼 체외의 angiogenesis의 assays에서 사용할 수 있습니다 고립.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

이 비디오에서는 성인 마우스의 심장에서 대동맥 판막 간질 세포를 2단계 콜라겐분해효소 절차를 사용하여 분리하고 이후 소량의 성장 배지에서 배양하는 방법을 보여줍니다.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.

배아 심실 내피 세포의 분리

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

우리는 소화 완충제에서 순차적 조직 소화를 통해 쥐 심혼에서 내심 과 관상 관상 내피 세포의 격리를 위한 프로토콜을 제시하고, 재발하는 원심분리기 주기에서 세포 수집 및 반대로 쥐 CD31 마이크로비드를 사용하여 세포 정화.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.

단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리

어렵지만 폐 내피 세포의 분리는 폐 염증 연구에 필수적입니다. 본 프로토콜은 대혈관 및 미세혈관 내피 세포의 고수율, 고순도 단리를 위한 절차를 설명한다.

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

학습하세요 대동맥 판막에서 판막 내피 세포를 분리하는 방법을. 콜라게나아제 용액과 면봉을 사용하여 양면의 내피층을 부드럽게 박리하고 순수한 세포 집단을 얻습니다. 이 기술은 심혈관 질환 연구에 활용됩니다.

판막병 내피 세포의 분리

더 많은 동영상 탐색