Name: 전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 학습하세요 전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아에 대한 기공 반응을 평가하는 방법을. 프로피듐 요오드 염색과 형광 현미경을 활용하여 실시간으로 수비세포 운동을 관찰하고, 식물-병원체 상호작용 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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본 연구는 보건 국립 연구소에서 그랜트와 알링턴 텍사스 대학 MM에 기금을 설치하여 지원했다.

1. 성장하는 식물과 박테리아 준비 <ol><li> V : 성장 매체의 V 혼합물 (Redi - 지구 플러그 앤 세들링 믹스, 일요일 Gro), 고급 vermiculite와 펄라이트이 절차를 시작하려면 1시 1분 1초 V에 Arabidopsis 씨를 뿌리다. </li><li> 성장 챔버 (22 ° C, 100 μmol / mm 2 / 초 매일 가벼운 65 12 시간의 ± 5 % 습도)와 필요에 따라 물속에 식물을 성장. 식물들은 이전 탈당 젊은 완전히 확장 나뭇잎이있을 때 4~6주에서 사용할 준비가 된 것입니다. </li><li> 실험을 시작하기 전에 이틀 세균 문화를 준비합니다. 수정된 LB 매체 (10 G / L tryptone, 5 G / L 효모 추출물, 5 G / L NaCl 산도 7.0 및 1.5 %의 한천) 및 28에서 24 시간 동안 품어 ° C.에 글리세롤 주식의 리크 모나스 syringae inoculum를 준비하고 박테리아가 하위 culturing 후 적은 악성되면서 항상 글리세롤 주식의 문화 접시를 시작하는 새로운 문화를 사용합니다. </li><li> P.의 10 ML 액체 문화를 시작 접시에 자란 박테리아를 사용하여 50 ML Erlenmeyer 플라스크에 syringae. 28 밤새 문화를 품어 ° C가 0.8 일 사이에 600 nm의에서 광학 밀도 또는 OD에 도달할 때까지 활발한 떨고와 함께. </li><li> 600에서 OD를 측정하고 10 분 동안 1,360 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확. 최종 OD가 0.2이되도록 증류수에있는 세포를 Resuspend. 이 OD는 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ML에 해당합니다. 준비 박테리아와 나뭇잎을 준비하고 분석을 수행하기 위해 진행합니다. </li></ol> 2. 박테리아와 리프 스테 이닝과 부화 <ol><li> 단풍은 처음 20 μm의의 propidium 요오드화물의 또는 물에 PI 솔루션을 준비 얼룩하기​​ 위해서. 솔루션의 10 ML는 한 번에 세 작은 잎을 얼룩이 충분하다. </li><li> 세 젊은 완벽하게 확장 단풍 성장 챔버로부터 포셉 분리와 함께 식물을 검색할 수 있습니다. 5 분 PI 솔루션에있는 모든 나뭇잎을 담가. 그런 나뭇잎을 제거하고 증류수로 잠시 그​​들을 씻어. </li><li> 현미경 슬라이드에 아래로 직면하고있는 낮은 표면 다음 장소는 나뭇잎. 나뭇잎이 슬라이드 평면 낳는 있도록 중간 정맥을 제외한 네 조각으로 날카로운 면도날로 나뭇잎을 잘라. </li><li> 나뭇잎과 박테리아를 부화, 슬라이드에있는 잎 조각 아래의 세균 현탁액 300 μL를 추가합니다. 잎사귀의 낮은 표면 inoculum 접촉되어 있는지 확인합니다. </li><li> 식물을 성장하는 데 사용된 동일한 환경 조건에서 샘플을 품어. 현미경으로 나뭇잎을 관찰하기 위해 당시까지 직면 낮은 표면을 가진 새 슬라이드에 잎 조각을 전송할 수 있습니다. 슬라이드를 장착하면 커버 용지가 사용되지 않습니다. 같은 잎 샘플 부화하는 동안 여러 번 몇 군데있을 수 있으며 시간 과정은 연구 목적에 따라 설정할 수 있습니다. </li></ol> 3. 현미경, 측정 및 데이터 분석 <ol><li> 여기 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 (LSM 510 메타, 칼 자이스 혈구 주)는 나뭇잎을 검사하는 데 사용됩니다. PI (453 nm의 여기, 방사 543 및 620 nm의)의 형광을 감지하기 위해 나뭇잎의 낮은 표면을 관찰. </li><li> 같은 잎 샘플을 사용하면 시간이 지남에 따라 stomata의 이미지를 캡처합니다. stomatal 조리개의 넓이를 측정하기위한 이미지를 저장합니다. </li><li> LSM 이미지 브라우저를 사용하여 각 시점에서 각 치료를 위해 최소 60 stomata의 stomatal 조리개 너비를 측정합니다. </li><li> stomatal 개구 폭에 대한 평균과 표준 오차를 계산. 결과의 통계적 의의 2 - 꼬리, 이점 현명한 학생의 T - 테스트를 사용하여 계산하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 박테리아 배양에 Stomatal 답변 대표 이미지 <ol><li> 여기 밝은 필드 뷰 (그림 1)에 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 아래 Arabidopsis 잎 표면의 전형적인 미세한 이미지 (20x 목표를 사용)입니다. </li><li> Propidium 요오드화물 얼룩의 데이터 수집 (그림 2)에 대한 손상이 세포의 식별을 허용 이외에 경비 세포의 가시성을 증가 가능한 세포의 세포 벽. stomatal 구멍 구멍의 범위는 완전히 폐쇄 stomata에서 활짝 열려 stomata하려면 다음 micrographs에서 볼 수 있습니다. </li><li> 완전히 폐쇄 stomata은 경비 세포의 모양 (그림 3)에 의해 식별됩니다. 개구 폭 0 μm의 것으로 간주됩니다. </li><li> 오픈 stomata (그림 4)와 같이 조리개 너비가 stomatal 기공의 넓은 지역에 걸쳐 그려진 직선을 사용하여 측정됩니다. </li><li> 이들은이 stomatal 분석의 전형적인 실험 결과입니다. Arabidopis 단풍은 모나스 syringae의 세 가지 다른 변종과 함께 어둠 속에서 incubated되었습니다. 만이 세균은 PST DC3000은 박테리아 스트레인마다 무작위로 선택된 60 stomata (그림 5)의 개구 폭에 의해 측정 어두운 폐쇄 stomata를 열 수있었습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Arabidopsis 잎 표면의 현미경. 20x 목표를 사용 공촛점 현미경 (LSCM)를 스캐닝 레이저에서 잎 표면의보기 중 하나는 분야. propidium 요오드화물 얼룩 (그림 2)에 의해 주었 형광등 볼 수 비교할 때 stomatal 조리개과 같이 분명되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. propidium 요오드화물 - 스테인드 Arabidopsis 리프의 표면의 현미경. 20x 목표를 사용 공촛점 현미경 (LSCM)를 스캐닝 레이저에서 잎 표면의보기 중 하나는 분야. stomatal 기공 개방의 범위를합니다. 노란색 화살표는 완전히 stomata를 닫고 지적하고 녹색 화살표가 활짝 열려 stomata 지적하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 완전의 모양과 경비 세포 사이의 개방으로 식별 가까이 stomata가. 개구 폭은 0 μm의 것으로 간주됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. μm의에서 조리개 너비를 보여주는 오픈 stomata가. 측정은 stomatal 기공의 넓은 지역에 걸쳐 그린 직선에 따라 LSCM 브라우저를 사용하여 촬영되었다. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. .. 세 모나스 syringae PV 토마토의 변종과 함께 incubated Arabidopsis 나뭇잎의 Stomatal 조리개 : DC3118, DB29, 그리고 DC3000 공장은 실험 시간 동안 어둠 속에 보관했다. 결과는 의미로 표시됩니다 (N = 50-70) ± 표준 오차. 통계 중요성은 두 꼬리 학생의 T - 테스트를 발견했습니다. 실험과 유사한 결과를 세 번 반복되었다.

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 다른 치료에 반응 stomatal 쉽게 평가 있도록 그대로 잎 조직에서 stomatal 조리개를 측정하는 직선 전달 절차를 제시합니다. 우리가 모델 시스템 Arabidopsis / 모나스 syringae를 사용하여 결과를 발표했지만, 손상 잎 stomatal 분석은 잠재적으로 어떤 식물 세균의 조합을 수행할 수 있습니다. 프로토콜은 쉽게 다른 식물과 세균성 병원균의 성장 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 전체 원칙과 절차는 동일하게 유지. 또한,이 방법은 미생물을 살아 경호 세포뿐만 아니라 출력의 기능을 연구하고자하는 연구자에게 도움이 될뿐 아니라 나뭇잎의 자연 환경을 유지 조건에서 다른 자극과 화학 약품에 있습니다. 전체 잎의 두께와 고르지 지형으로 인해 이미지에 어려울 수 있습니다. 이 문제는 그것이 평면 낳는 있도록 슬라이드에 나뭇잎의 중간 정맥을 제거하고 공촛점 현미경을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 그러나, 형광 현미경의 다른 종류는 잎 표면의 고해상도 이미지를 얻기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>트립톤(Tryptone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물(Yeast Extract)</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(Sodium Chloride)</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>한천(Agar)</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>식물 생장 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진탕 배양기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 주사 공초점 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 stomatal 응답을 평가

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata은 공장 내부와 환경 사이의 가스 교환에 책임이있는 식물 표피 자연 채용하고 있습니다. 그들은 빛의 강도, 이산화탄소 농도, 그리고 상대 습도 (RH)를 포함한 외부 요인에 대응 stomatal 기공을 닫으 수있는 경비 세포, 한 쌍의에 의해 형성된다. stomatal 기공은 나뭇잎으로 병원체 진입, 질병 개발을위한 중요한 단계의 주요 경로입니다. 최근 연구는 기공의 폐쇄가 Arabidopsis 식물의 세균성 질병 개발을 최소화에 효과적이라는 사실을 발표했습니다; 공장 타고난 면역의 중요한 부분을. 이전, 우리는 박테리아를 (. Melotto 외 2006) 생활 stomatal 반응을 평가하기 위해 표피 껍질을 사용한 적이 있지만 식물 표피 껍질을 세균 세포 모두에 유리한 환경 조건을 유지 도전했습니다. 잎 표피는 경비 세포 electrophysiological 실험 MES 버퍼 (10 MM KCl, 25 MM MES - 코, 산도 6.15)와 살아 있고 건강하게 만들어 줬어 수 있습니다. 그러나,이 버퍼가 박테리아 중지를위한 적합하지 않습니다. 한편, 세균 세포는 시간의 오랜 기간 동안 표피 껍질을 유지하기 위해 적절한되지 않습니다 물이 살아 보관하실 수 있습니다. 물 위에 표피 필 수레, 4 시간 이내에 건조 공기에 노출되어있는 껍질에있는 세포가 실험을 실시하는 시간을 제한하는 경우. 경비 세포에 특정 자극의 효과를 평가하기위한 이상적인 방법은 stomatal 생리학과 가능한 많은 식물의 자연 환경에 최소한의 간섭을 제시해야합니다. 우리는 그러므로, 잎 입힐 수있는 총알과 조작​​이 크게 쉽게 재현할하고 안정적​​인 stomatal 분석을 제공하는 목표로 최소화되는 박테리아를 살 stomatal 응답을 평가하는 새로운 방법을 개발했습니다. 프로토콜은 propidium 요오드화물의 (PI), 세균의 정지와 리프 얼룩의 부화하고, 공촛점 현미경 스캐닝 레이저에 따라 나뭇잎의 관찰과 함께 그대로 잎의 얼룩을 기반으로합니다. 마지막으로,이 방법은 밀접하게 식물이 병원균에 의해 공격하는 아래의 자연 조건을 모방 조건을 사용하여 오랜 기간에 걸쳐 동일한 라이브 잎 샘플의 관찰을 허용합니다.

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

기공은 식물 내부와 외부 환경 사이의 가스 교환을 담당하는 식물 표피의 자연 개구부입니다. 기공은 한 쌍의...

본 절차에서는 살아있는 박테리아 세포에 반응하는 공변세포의 움직임을 평가하기 위해 잎 이미징 기술을 사용합니다. 먼저, 글리세롤 스톡으로부터 박테리아를 배양하여 접종액을 준비합니다. 그런 다음, 건강한 어린 잎을 수집하여 propidium iodide로 염색합니다.염색된 잎을 절단하고, 절단된 잎 조각을 박테리아 현탁액 위에 올려 배양합니다. 마지막으로 현미경으로 잎 표면을 관찰하여 기공 개구부를 측정할 수 있습니다. 형광 현미경을 통해 얻은 결과는 박테리아에 반응하여 기공 개구부가 변화하는 것을 보여줍니다.표피 박리법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 박테리아와 접촉하는 잎이 손상되지 않은 상태로 유지되어 박테리아가 잎으로 침투하는 자연 조건과 유사하다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면 Arabidopsis 종자를 성장 배지, 질석, 그리고 Vermiculite를 1:1:1 비율로 혼합한 배지에 파종합니다. 식물을 성장 챔버에서 배양하며 필요에 따라 물을 줍니다.식물은 추대 전, 어린 잎이 완전히 전개된 4~6주 후에 사용할 준비가 됩니다. 실험 시작 2일 전에 박테리아 배양 스트리크를 준비합니다. glycerol stock에서 Pseudomonas ringe를 modified LB 배지에 스트리킹하고, 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다.접종균을 준비할 때는 신선한 배양물을 사용하고, 배양 플레이트는 항상 글리세롤 스톡으로부터 시작하십시오. 계대 배양 후에는 박테리아의 독성이 약해지므로, 플레이트에서 성장한 박테리아를 사용하여 10 mL의 pseudomona singe 액체 배양을 시작합니다. 50 mL 삼각 플라스크에 배양물을 넣고 28 °C에서 격렬하게 흔들어 밤새 배양하여, 600 nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.8에서 1 사이가 되도록 합니다.600 nm에서 OD를 측정하고, 1,360 ×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 최종 OD가 0.2가 되도록 증류수로 세포를 재현탁합니다. 이 OD 값은 mL당 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다.박테리아가 준비되면, 잎을 준비하고 잎을 염색하기 위한 분석을 진행합니다. 먼저, 증류수에 20 µM의 propidium iodide(PI) 용액을 준비합니다. 용액 10 mL이면 한 번에 작은 잎 세 장을 염색하기에 충분합니다.생장 챔버에서 식물을 꺼내고, 핀셋을 사용하여 완전히 확장된 어린 잎 3장을 떼어냅니다. 잎 전체를 PI 용액에 5분 동안 담급니다. 그 다음 잎을 꺼내어 증류수로 짧게 헹굽니다.다음으로, 잎의 뒷면이 아래로 향하도록 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 박테리아를 잎과 함께 배양할 수 있도록 잎이 슬라이드 위에 평평하게 놓이게끔, 중맥을 제외하고 날카로운 면도날로 잎을 네 조각으로 자릅니다. 슬라이드 위의 잎 조각들 아래에 300 µL의 박테리아 현탁액을 첨가하고, 잎의 뒷면이 접종물과 접촉하고 있는지 확인합니다.식물을 성장시킬 때 사용했던 것과 동일한 환경 조건에서 샘플을 배양합니다. 현미경으로 잎을 관찰할 때가 되면, 잎 조각을 새 슬라이드로 옮기되 잎의 하단면이 위를 향하게 합니다. 슬라이드 마운팅 시 커버슬립은 사용하지 않는다는 점에 유의하십시오.동일한 잎 샘플을 배양 기간 동안 여러 번 촬영할 수 있으며, 연구 목적에 따라 시계열 분석을 설정할 수 있습니다. 본 과정에서는 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 잎을 검사하고, 동일한 잎 샘플의 하표면을 관찰하여 PI의 형광을 검출하며, 시간에 따른 기공의 이미지를 캡처합니다. 기공 개구부의 너비를 측정하기 위해 이미지를 저장합니다.각 시간대별로 각 처리군에 대해 최소 60개 이상의 기공에 대해 기공 개구부 너비를 측정합니다. LSM 이미지 브라우저를 사용하여 기공 개구부 너비의 평균과 표준 오차를 계산합니다. 결과의 통계적 유의성은 양측 paired wise Student's t-test를 사용하여 계산할 수 있습니다.여기 T-test는 레이저 주사 공초점 현미경으로 관찰한 애기장대 잎 표면의 전형적인 현미경 이미지입니다. 명시야 뷰에서 propidium iodide는 생존 세포의 세포벽을 염색하여, 손상되지 않은 세포를 식별할 수 있게 함과 동시에 공변세포의 가시성을 높여줍니다. 이러한 마이크로그래프에서는 완전히 닫힌 기공부터 활짝 열린 기공까지 다양한 범위의 기공 개폐 상태를 확인할 수 있습니다.완전히 닫힌 기공은 공변세포의 모양으로 식별합니다. 열린 기공의 경우 기공 너비는 0 µm로 간주합니다. 표시된 기공 너비는 기공 구멍의 가장 넓은 영역을 가로지르는 직선을 사용하여 측정하였습니다.이것은 살아있는 잎 접종 분석의 전형적인 실험 결과입니다. Arabidopsis 잎을 세 가지 서로 다른 pseudomonas Cy Ringe 균주와 함께 암실에서 배양하였으며, 박테리아 균주당 무작위로 선택한 60개 기공의 개구부 너비를 측정한 결과 P-S-T-D-C 3000 박테리아만이 암조건의 기공을 열 수 있었습니다. 이 기술은 식물-박테리아 상호작용 분야의 연구자들이 식물 종의 병원균에 대한 초기 반응 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

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Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 infiltrative 설치 매체로 perfluorodecalin의 사용을 설명합니다. 이것이 영상의 깊이를 개선하기위한 간단한...

이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎

출처: Lee, H. et. al., 감염 중 박테리아로부터 전달되는 이펙터를 시각화하기 위한 녹색 형광 단백질 시스템 분할. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 공초점 현미경과 결합된 분할 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 상보를 사용하여 식물 세포에서 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 숙주 세포 세포질로의 이펙터 전좌를 정확하게 시각화할 수 있습니다.

식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

엽록체의 표면에서 뻗어 있는 스트로마로 채워진 세뇨관인 엽록체 스트로뮬의 역학을 조사하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

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전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

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