전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

본 절차에서는 살아있는 박테리아 세포에 반응하는 공변세포의 움직임을 평가하기 위해 잎 이미징 기법을 사용합니다. 먼저, 글리세롤 스톡으로부터 박테리아를 배양하여 접종액을 준비합니다. 그다음, 건강한 어린 잎을 수집하여 propidium iodide로 염색합니다.

염색된 잎을 절단하여 잎 조각을 박테리아 현탁액 위에 놓고 배양합니다. 마지막으로 현미경으로 잎 표면을 관찰하여 기공 개구부를 측정할 수 있습니다. 형광 현미경을 사용하여 얻은 결과는 박테리아에 반응하여 기공 개구부가 변화함을 보여줍니다.

표피 박리법과 같은 기존 방법과 비교하여 이 방법이 가진 주요 장점은, 박테리아와 접촉하는 잎이 온전한 상태로 유지되어 박테리아가 잎으로 침투하는 자연적인 조건을 모사할 수 있다는 점입니다. 이 실험 절차를 시작하기 위해, Arabidopsis 종자를 성장 배지와 질석, 퍼라이트를 1:1:1 비율로 혼합한 배지에 파종합니다. 식물을 생장 챔버에서 재배하며 필요에 따라 물을 줍니다.

식물은 추대 전 어린 잎이 완전히 전개되었을 때인 4~6주 후에 사용할 준비가 됩니다. 실험 시작 이틀 전에 박테리아 배양 스트리크를 준비하십시오. 글리세롤 스톡에서 Pseudomonas ringe를 변형된 LB 배지에 스트리크하고 28 °C에서 24시간 동안 배양하십시오.

접종원을 준비하려면 신선한 배양물을 사용하고, 항상 글리세롤 스톡(glycerol stocks)으로부터 배양 플레이트를 시작하십시오. 계대 배양 후 박테리아의 독성이 약해지므로, 플레이트에서 성장한 박테리아를 사용하여 10 milliliter의 pseudomona singe 액체 배양을 시작하십시오. 50 milliliter 삼각 플라스크에 배양물을 넣고 28 °C에서 격렬하게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.8에서 1 사이가 되도록 하십시오.

600 nm에서 OD를 측정하고 1,360 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 최종 OD가 0.2가 되도록 증류수에 세포를 재현탁합니다. 이 OD 값은 mL당 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다.

박테리아 준비가 완료되면, 잎을 준비하고 잎을 염색하기 위한 분석을 수행합니다. 먼저, 물에 20 µM propidium iodide(PI) 용액을 준비합니다. 용액 10 mL면 한 번에 작은 잎 3장을 염색하기에 충분합니다.

생장 챔버에서 식물을 꺼내어 핀셋을 사용하여 완전히 확장된 어린 잎 3장을 떼어냅니다. 잎 전체를 PI 용액에 5분 동안 담급니다. 그 다음 잎을 꺼내어 증류수로 짧게 헹굽니다.

다음으로, 잎의 뒷면이 아래로 향하도록 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 날카로운 면도날을 사용하여 잎의 중앙맥을 제외하고 네 조각으로 자릅니다. 이는 잎이 슬라이드 위에 평평하게 놓여 박테리아와 잎이 함께 배양될 수 있도록 하기 위함입니다. 슬라이드 위 잎 조각들 아래에 박테리아 현탁액 300 µL를 첨가하고, 잎의 뒷면이 접종물과 접촉하고 있는지 확인합니다.

식물을 재배할 때와 동일한 환경 조건에서 시료를 배양합니다. 현미경으로 잎을 관찰할 시간이 되면, 잎 조각을 새로운 슬라이드로 옮기고 잎의 뒷면이 위를 향하도록 배치합니다. 슬라이드 마운팅 시 커버 슬립은 사용하지 않는다는 점에 유의하십시오.

동일한 잎 샘플을 배양 기간 동안 여러 번 촬영할 수 있으며, 연구 목적에 따라 시간 경과 분석(time course)을 설정할 수 있습니다. 본 과정에서는 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 잎을 조사하고, 동일한 잎 샘플의 하단 표면을 관찰하여 PI의 형광을 검출하며, 시간에 따른 기공의 이미지를 캡처합니다. 이후 기공 개구부의 너비를 측정하기 위해 해당 이미지들을 저장합니다.

각 시점의 처리군별로 최소 60개 이상의 기공의 기공 개구폭을 측정하십시오. LSM 이미지 브라우저를 사용하여 기공 개구폭의 평균과 표준 오차를 산출합니다. 결과의 통계적 유의성은 양측 paired wise Student's t-test를 사용하여 계산할 수 있습니다.

여기에 제시된 T-test는 레이저 주사 공초점 현미경으로 관찰한 애기장대 잎 표면의 전형적인 현미경 이미지입니다. 명시야 뷰에서 propidium iodide는 생존 세포의 세포벽을 염색하여, 손상되지 않은 세포를 식별할 수 있게 함과 동시에 공변세포의 가시성을 높여줍니다. 이러한 마이크로그래프에서는 완전히 닫힌 기공부터 넓게 열린 기공까지 다양한 범위의 기공 개폐 상태를 확인할 수 있습니다.

완전히 닫힌 기공은 공변세포의 모양으로 식별합니다. 열린 기공의 경우 기공 너비는 0 µm로 간주합니다. 표시된 기공 너비는 기공 구멍의 가장 넓은 영역을 가로질러 그은 직선을 사용하여 측정합니다.

이는 살아있는 잎 접종 분석의 전형적인 실험 결과입니다. Arabidopsis 잎을 세 가지 서로 다른 Pseudomonas 균주와 함께 암소에서 배양했을 때, 박테리아 균주당 무작위로 선택된 60개 기공의 개구부 너비를 측정한 결과 P-S-T-D-C 3000 균주만이 암소의 기공을 열 수 있었습니다. 이 기술은 식물-박테리아 상호작용 분야의 연구자들이 식물 종의 병원체에 대한 초기 반응 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.