전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

본 절차에서는 살아있는 박테리아 세포에 반응하는 공변세포의 움직임을 평가하기 위해 잎 이미징 기술을 사용합니다. 먼저, 글리세롤 스톡으로부터 박테리아를 배양하여 접종액을 준비합니다. 그런 다음, 건강한 어린 잎을 수집하여 propidium iodide로 염색합니다.

염색된 잎을 절단하고, 절단된 잎 조각을 박테리아 현탁액 위에 올려 배양합니다. 마지막으로 현미경으로 잎 표면을 관찰하여 기공 개구부를 측정할 수 있습니다. 형광 현미경을 통해 얻은 결과는 박테리아에 반응하여 기공 개구부가 변화하는 것을 보여줍니다.

표피 박리법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 박테리아와 접촉하는 잎이 손상되지 않은 상태로 유지되어 박테리아가 잎으로 침투하는 자연 조건과 유사하다는 점입니다. 이 절차를 시작하려면 Arabidopsis 종자를 성장 배지, 질석, 그리고 Vermiculite를 1:1:1 비율로 혼합한 배지에 파종합니다. 식물을 성장 챔버에서 배양하며 필요에 따라 물을 줍니다.

식물은 추대 전, 어린 잎이 완전히 전개된 4~6주 후에 사용할 준비가 됩니다. 실험 시작 2일 전에 박테리아 배양 스트리크를 준비합니다. glycerol stock에서 Pseudomonas ringe를 modified LB 배지에 스트리킹하고, 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다.

접종균을 준비할 때는 신선한 배양물을 사용하고, 배양 플레이트는 항상 글리세롤 스톡으로부터 시작하십시오. 계대 배양 후에는 박테리아의 독성이 약해지므로, 플레이트에서 성장한 박테리아를 사용하여 10 mL의 pseudomona singe 액체 배양을 시작합니다. 50 mL 삼각 플라스크에 배양물을 넣고 28 °C에서 격렬하게 흔들어 밤새 배양하여, 600 nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.8에서 1 사이가 되도록 합니다.

600 nm에서 OD를 측정하고, 1,360 ×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 최종 OD가 0.2가 되도록 증류수로 세포를 재현탁합니다. 이 OD 값은 mL당 10⁸ CFU(colony forming units)에 해당합니다.

박테리아가 준비되면, 잎을 준비하고 잎을 염색하기 위한 분석을 진행합니다. 먼저, 증류수에 20 µM의 propidium iodide(PI) 용액을 준비합니다. 용액 10 mL이면 한 번에 작은 잎 세 장을 염색하기에 충분합니다.

생장 챔버에서 식물을 꺼내고, 핀셋을 사용하여 완전히 확장된 어린 잎 3장을 떼어냅니다. 잎 전체를 PI 용액에 5분 동안 담급니다. 그 다음 잎을 꺼내어 증류수로 짧게 헹굽니다.

다음으로, 잎의 뒷면이 아래로 향하도록 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 박테리아를 잎과 함께 배양할 수 있도록 잎이 슬라이드 위에 평평하게 놓이게끔, 중맥을 제외하고 날카로운 면도날로 잎을 네 조각으로 자릅니다. 슬라이드 위의 잎 조각들 아래에 300 µL의 박테리아 현탁액을 첨가하고, 잎의 뒷면이 접종물과 접촉하고 있는지 확인합니다.

식물을 성장시킬 때 사용했던 것과 동일한 환경 조건에서 샘플을 배양합니다. 현미경으로 잎을 관찰할 때가 되면, 잎 조각을 새 슬라이드로 옮기되 잎의 하단면이 위를 향하게 합니다. 슬라이드 마운팅 시 커버슬립은 사용하지 않는다는 점에 유의하십시오.

동일한 잎 샘플을 배양 기간 동안 여러 번 촬영할 수 있으며, 연구 목적에 따라 시계열 분석을 설정할 수 있습니다. 본 과정에서는 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 잎을 검사하고, 동일한 잎 샘플의 하표면을 관찰하여 PI의 형광을 검출하며, 시간에 따른 기공의 이미지를 캡처합니다. 기공 개구부의 너비를 측정하기 위해 이미지를 저장합니다.

각 시간대별로 각 처리군에 대해 최소 60개 이상의 기공에 대해 기공 개구부 너비를 측정합니다. LSM 이미지 브라우저를 사용하여 기공 개구부 너비의 평균과 표준 오차를 계산합니다. 결과의 통계적 유의성은 양측 paired wise Student's t-test를 사용하여 계산할 수 있습니다.

여기 T-test는 레이저 주사 공초점 현미경으로 관찰한 애기장대 잎 표면의 전형적인 현미경 이미지입니다. 명시야 뷰에서 propidium iodide는 생존 세포의 세포벽을 염색하여, 손상되지 않은 세포를 식별할 수 있게 함과 동시에 공변세포의 가시성을 높여줍니다. 이러한 마이크로그래프에서는 완전히 닫힌 기공부터 활짝 열린 기공까지 다양한 범위의 기공 개폐 상태를 확인할 수 있습니다.

완전히 닫힌 기공은 공변세포의 모양으로 식별합니다. 열린 기공의 경우 기공 너비는 0 µm로 간주합니다. 표시된 기공 너비는 기공 구멍의 가장 넓은 영역을 가로지르는 직선을 사용하여 측정하였습니다.

이것은 살아있는 잎 접종 분석의 전형적인 실험 결과입니다. Arabidopsis 잎을 세 가지 서로 다른 pseudomonas Cy Ringe 균주와 함께 암실에서 배양하였으며, 박테리아 균주당 무작위로 선택한 60개 기공의 개구부 너비를 측정한 결과 P-S-T-D-C 3000 박테리아만이 암조건의 기공을 열 수 있었습니다. 이 기술은 식물-박테리아 상호작용 분야의 연구자들이 식물 종의 병원균에 대한 초기 반응 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.