아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

본 실험 절차의 전반적인 목표는 수생 미생물 군집에서 바이러스가 생성되는 속도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 천연 미생물 군집은 유지하면서 관심 대상 샘플 내 자유 바이러스의 풍부도를 감소시켜 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 해당 조건에서 샘플을 배양하고, 최대 10시간 동안 2~3시간마다 서브샘플을 수집하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 각 시점별로 수집된 하위 샘플 내의 바이러스를 수치화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 샘플 내 바이러스 입자 풍부도가 증가하는 속도를 측정하고 바이러스 생성률을 결정하는 것입니다. 궁극적으로, 수치화 과정을 통해 미생물 군집 내에서 바이러스가 생성되는 속도를 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 연구자는 바이러스 활동으로 인한 미생물의 사망률을 추론할 수 있습니다.

안녕하세요. 저는 테네시 대학교 미생물학과의 Steven Milham 박사 연구실에서 근무하고 있는 Audrey Madison입니다. 오늘은 Charles Budoff, Claire Campbell과 함께 수생 시스템에서 바이러스가 생성되는 속도를 분석하는 절차를 보여드리겠습니다.

이를 위해 샘플 내 유리 바이러스의 수를 줄이고, 바이러스에 감염된 미생물의 용해로 인해 이들이 다시 나타나는 비율을 측정합니다. 현재 저희 연구실에서는 바이러스의 생태와 바이러스가 미생물 군집을 어떻게 형성하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다. 이제 소개를 마쳤으므로, 본격적으로 시작해 보겠습니다.

본 절차를 시작하기 전, 가능한 한 무균적으로 해수 약 20 liters를 수집하십시오. 샘플을 수집한 후, 142 millimeter 직경의 0.8 micron 필터로 물을 여과하십시오. 생물학적 생산성이 높은 시스템의 경우, 이전에 더 큰 공극 크기의 필터나 유리 섬유 필터로 먼저 여과할 수 있습니다.

초여과수를 얻기 위해, 모든 바이러스를 제거할 수 있는 나선형 권취 막 카트리지가 포함된 AmCon M 12 시스템과 같은 초여과 시스템을 설정합니다. 그런 다음 샘플 내의 바이러스를 약 15~16 kPa의 역압에서 최대 속도의 약 25%로 제거 및 농축합니다. 약 500 mL의 농축액에는 농축된 바이러스 군집이 포함되어 있으며, 이는 다른 연구를 위해 보관할 수 있고, 바이러스가 제거된 여과액은 바이러스 생산 분석에 사용됩니다.

매일 사용 후에는 필터 카트리지의 막 손상을 방지하기 위해 Omicron M 12 시스템을 세척하십시오. 해수를 사용하는 경우, 최소 6L의 Milli Q water로 막을 헹군 다음, 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 30분에서 45분 동안 세척하십시오. 그 후 다시 최소 6L의 Milli Q water로 카트리지를 헹구십시오.

작업이 완료되면, 스파이럴 카트리지를 4 °C의 0.05 M 인산 용액에 보관할 수 있습니다. 바이러스 감소 방법을 시작하려면, 바이러스 제거수를 제조했던 곳과 동일한 위치에서 채취한 해수 샘플 500 mL를 0.2 µm 공칭 기공 크기의 저단백질 결합 필터가 장착된 스테레오 필터 유닛에 넣습니다. 이때, 시작 시점의 물에 포함된 바이러스와 박테리아의 총 풍부도를 측정하기 위한 하위 샘플도 함께 수집하십시오.

멸균 전이 피펫을 사용하여 샘플을 계속 재현탁함으로써 박테리아 세포가 필터에 농축되는 것을 방지하면서, 200 mmHg 미만의 압력으로 샘플을 부드럽게 진공 가압합니다. 박테리아 개체군을 일정 밀도로 유지하면서 샘플 내 유리 바이러스의 양을 줄이기 위해, 초여과액 500 mL의 3배 부피를 박테리아 현탁액에 천천히 첨가합니다. 마지막으로 바이러스가 없는 초여과수로 박테리아 분획을 다시 500 mL로 희석합니다. 그다음, 이를 150 mL씩 세 개의 반복구로 나누어 투명한 250 mL 폴리카보네이트 병에 담습니다.

이는 시간 0(time zero) 샘플 세트를 나타냅니다. 시간 0 샘플에서 박테리아 및 바이러스 풍부도 추정을 위한 샘플을 채취하십시오. 최종 농도가 2.0~2.5%인 멸균 glutaraldehyde가 포함된 cryo vial에 샘플을 옮기십시오.

고정제로 사용하기 위해, 이 시료들을 액체 질소로 즉시 급속 냉동하고 처리 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 또는, 해양 미생물을 농축하기 위해 접선 유동 여과(tangential flow) 시스템을 사용할 수 있습니다. TFF 방법을 사용하려면, 천연 시료 약 500 mL를 준비하십시오.

바이러스 감소 방법에서 설명한 바와 같이, 박테리아 분획이 초여과된 바이러스 제거수 10~15 mL 정도로 줄어들 때까지 0.2 micron 공칭 기공 크기의 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 이 시료를 농축하고, 결과물인 반복 병들을 현장 조건에서 배양하십시오. SCE의 환경 챔버를 사용하여, 주변 온도를 유지하는 표층수 공급 장치에 연결된 유동 해수 배양기를 사용합니다. 청색 색조 아크릴이나 중성 밀도 차광망을 사용하여 빛의 세기를 낮춤으로써 광도를 표층 조건과 일치시킬 수 있습니다.

현장 스테이션이나 실험실에서 작업하거나 해수를 흐르게 할 수 없는 경우에는 조명이 설치된 배양 인큐베이터를 사용할 수 있습니다. 0시점 샘플에 대해 수행한 방법으로 최소 10시간 동안 2.5시간마다 하위 샘플을 계속 수집하십시오. 일부 연구자들은 현미경 관찰용 샘플 외에도 특정 바이러스의 정량적 PCR 분석을 위해 물을 수집하고자 할 것입니다.

qPCR 샘플의 경우, 고정제가 없는 크라이오 바이알에 샘플 5 mL를 넣고 액체 질소로 즉시 급속 냉동하여 바이러스 생성 현미경 관찰을 준비하십시오. 냉동된 샘플은 얼음 위에서 해동하고, 서면 프로토콜에 설명된 대로 용액을 새로 준비하십시오. 그런 다음 25 mm 크기의 0.02 µm 공극 크기를 가진 디스크 필터를 0.45 µm 셀룰로오스 백킹 필터 위에 배치하십시오. 이어서 고정된 샘플 850 µL를 아나디 필터 상단에 넣고 완전히 건조될 때까지 20 kPa 미만의 압력으로 진공 처리하십시오.

아노 디스크 필터가 마르면, 멸균 페트리 접시에 사이버 그린(cyber green) 작업 용액 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 진공 상태를 유지한 채 필터 타워에서 아노 디스크를 조심스럽게 분리하여 사이버 그린 용액 위에 올립니다. 샘플을 실온의 암소에서 20분 동안 배양합니다.

cyber green 용액에서 필터를 조심스럽게 꺼내고, Kim wipe로 필터 뒷면을 닦아 잔류 염료를 모두 제거합니다. 그다음 현미경 슬라이드에 Antifa 용액을 한 방울 떨어뜨리고 커버 글라스를 덮습니다. 커버 글라스를 제거한 후 건조된 필터를 현미경 슬라이드 위에 올립니다.

다시 한번, 커버 슬립에 Antifa 용액을 소량 첨가하고 필터 위에 천천히 놓으며, 이때 형성될 수 있는 기포를 반드시 제거하십시오. 광범위 청색 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 바이러스를 계수하십시오. 필터 막 전체에 바이러스가 균일하게 분포되었는지 확인하기 위해, 각 필터당 최소 20개의 시야를 관찰하고 각 필드 그리드에서 전체 바이러스 수를 정량화하십시오. 세 번의 독립적인 반복 실험으로부터 바이러스 재발의 평균율을 계산하고, 생성율에 대한 표준 편차를 구하십시오. 마지막으로, 시작 시의 풍부도에서 바이러스가 감소된 시료의 희석된 풍부도까지의 미생물 희석 정도에 맞추어 이 비율들을 보정하십시오.

본 연구의 주요 데이터 세트는 배양액 내 하위 샘플들의 바이러스 풍부도 재현율입니다. 이러한 결과는 각 샘플에 대해 시간 경과에 따른 바이러스 풍부도의 독립적인 회귀 분석을 형성합니다. 바이러스 유사 입자의 생성은 epi 형광 현미경을 사용하여 현장 조건에서 10시간의 배양 기간 동안 모니터링되었습니다.

이 시료들은 2008년 9월 뉴질랜드 연안의 식물플랑크톤 대번식 기간 동안 수집되었습니다. 지금까지 바이러스 생산률을 추정하는 방법을 살펴보았습니다. 여기에는 다양한 초여과 시스템의 사용과 바이러스 생산률 측정을 위한 실험 수행 과정이 포함됩니다.

또한, 우리는 epi 형광 현미경을 통해 이러한 바이러스의 수를 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 깨끗한 장비를 사용하고, 염색된 바이러스를 다룰 때는 빛을 차단하며, 샘플을 신속하게 처리하고, 매 사용 후 초여과 카트리지를 적절히 세척하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.