Name: 아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 수생 미생물 군집에서 바이러스 생산 속도를 측정하는 방법을. 바이러스 감소 및 재발생 기법을 사용하여 해양 및 담수 생태계에서 미생물 사멸률을 추정할 수 있습니다.

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이 문서의 출판은 테네시 대학에서 연구의 사무실에서 교부금에 의해 지원되었다. 저자는 이러한 절차를 수정하기 위해 노력하는 학생과 연구자의 이전 세대 주셔서 감사합니다. 연구는 국립 과학 재단 (NSF - 0851113, NSF - 0825405 및 NSF - 0550485)의 보조금에 의해 지원되었다.

1. "바이러스 무료"물 (빌헬름 &amp; Poorvin 2001)를 생성하기 위해 해수의 Ultrafiltration <ol><li> 해수 / lakewater 약 20L가 가능한 무균 수집됩니다. </li><li> 워터는 순차적으로 142 - mm 직경의 폴리 카보 네이트를 통해 지역 사회의 분석을 위해 -20 ° C에서 보관 수있는 0.8 μm의 필터를 prefiltered입니다. 큰 기공 크기 필터는 매우 생산적인 시스템에 대해이 단계 이전에 사용할 수 있습니다. </li><li> 30 KDA - 커토프 나선형 카트리지가 모두 바이러스를 제외하는 데 사용됩니다 Amicon M12 시스템 (Millipore), 심지어는 작은 RNA 바이러스의 ultrafiltered 물을 얻을 수 있습니다. </li><li> 샘플은 backpressure의 ~ 15-16 kPa로 처리 ~ 25 %의 속도로 집중되고있다. </li><li> 물 ~ 500 ML의 나머지 샘플은 바이러스 무료 물의 나머지 19.5 L가 바이러스성 생산 assays에 사용됩니다 동안 집중 바이러스 커뮤니티 (어떤 다른 실험을 위해 저장될 수도 있습니다)가 포함됩니다. </li><li> 이용의 각 하루를 보낸 후, Amicon M12 시스템은 필터 카트리지의 멤브레인 손상을 방지하기 위해 청소해야합니다. </li><li> 이 해수와 함께 작업하는 경우 30~45분에 대한 0.1N NaOH 용액과 함께 세탁 다음 밀리 Q 물 최소한 6L와 멤브레인을 씻어. </li><li> 다시 밀리 Q 물 최소한 6L와 카트리지를 씻어. </li><li> M12 시스템을 이용하여 작업이 완료되면 나선형 카트리지 4 0.05MH 3 PO 4 용액 ° C.에 보관해야 </li></ol> 2. 바이러스성 생산을위한 바이러스 감소 방법 (빌헬름 외. 2002) <ol><li> 최대 두 호스트 및 바이러스가 0.2 - μm의 공칭 기공 크기 낮은 단백질 바인딩 그것에 배치 필터 (예 : Durapore.) 함께 취득하고 sterifilter 단위에 배치됩니다와 해수 / lakewater 샘플 500 ML에 </li><li> 지속 필터에 집중에서 박테리아 세포를 억제하는 살균 전송 피펫을 사용하여 샘​​플 resuspending하면서 예제는 부드럽게 &lt;200 mmHg로 압력을 진공이다. </li><li> 천천히 ultrafiltrate 세 볼륨 크게 샘플 무료 바이러스의 수를 줄이기 위해 세균 현탁액에 추가됩니다. </li><li> 세균성 분수는 바이러스가없는 물 500 ML로 희석 세 나누어 150 ML 각 복제 맑은 250ml 폴리 카보 네이트 병에 배치됩니다있다. </li></ol> 3. 바이러스성 생산을위한 접선 흐름 여과 (TFF) 방법 (Weinbauer 외. 2002 윙젯 외. 2005) TFF는 바이러스 감소 방법에 대한 대안적인 접근 방식을 나타냅니다. <ol><li> 위에서 설명한대로 자연 시료의 약 500 ML이 수집됩니다. </li><li> 이 예제는 0.2 - μm의 공칭 기공 크기의 접선 흐름 여과 시스템을 사용 집중되어 있습니다. </li><li> 세균성 분율이 약 10-15 ML로 감소되면, ultrafiltered, 바이러스 무료 물을 추가하고 위와 같이 배포됩니다. </li><li> 복제 병은 환경 챔버를 사용하여 현장 조건에 incubated 수 있습니다. <ol><li> 라이트 수준은 빛의 강도를 감소 NET 심사와 푸른 적용된 아크릴 또는 취소 아크릴을 사용하여 표면 조건 변경됩니다. </li><li> 주위 표면 온도는 종종 흐르는 해수 데크 배양기를 사용하여 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 박테리아와 바이러스성 풍부한 견적에 대한 샘플은 cryovials에 추가 2.0-2.5 % 살균 글루 타 알데히드의 최종 농도와 시간을 0에서 찍은 있습니다. 이 샘플은 즉시 액체 질소로 냉동 플래시하고 처리하기 전까지 냉동 저장됩니다. <ol><li> 액체 질소를 사용할 수없는 경우, 현미경 슬라이드는 (아래 절차를 참조) 준비하고 즉시 처리할 수 있습니다 </li></ol></li><li> Subsamples은 위에서 설명한 방법으로 적어도 10 시간 동안 매 2.5 시간을 수집하고 있습니다. <ol><li> 이 시간에 물을 정량 PCR 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 최대 샘플 5 ML하기는 액화 질소에 즉시 플래시 냉동로없이 정착액 에이전트 cryovial에 추가할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 바이러스성 생산 현미경 (노블 &amp; 퍼먼 1998, 웬 외. 2004) <ol><li> 0.02 - μm의 현미경에 대한 필터링하는 냉동 샘플은 얼음에서 해동해야합니다. </li><li> 멸균 물 주식 솔루션 1시 10분을 diluting하여 SYBR 녹색의 주식 솔루션을 준비합니다. 다음 주식 솔루션에서 멸균 물 39 ML에 대한 재고 솔루션의 1mL를 추가하여 작업 솔루션을 준비합니다. 50 % 글리세롤, 50 % 인산이 호수 솔루션을 버퍼 (PBS, 0.05 M 나 2 HPO 4, 0.85 % NaCl, 산도 7.5) 및 P - phenylenediamine의 신선한 2.5 % 주식 솔루션은 또한 시작하기 전에 준비를해야합니다. 4 50 % glycerol/50 % PBS 솔루션을 유지 ° C 및 P - phenylenediam-20에서 오프라인 재고 ° 시작 때까지 어둠 속에 C. 오른쪽 필터링하기 전에 Antifade 솔루션으로 사용되는 0.1 %의 최종 농도 50 % glycerol/50 % PBS로 P - phenylenediamine를 추가합니다. </li><li> 0.45 - μm의 MicronStep, cellulosic 후원 필터의 상단에 0.02 - μm의 Anodisc 필터 25mm를 놓습니다. 완전히 건조까지 20 pKa에 Anodisc과 진공의 상단에 고정 샘플 850 μL를 추가합니다. 플레이스 100 멸균 페트리 접시에 SYBR 그린 작업 솔루션의 μL, 그리고 여전히 진공으로 조심스럽게 SYBR 그린 필터 탑과 장소에서 Anodisc를 제거합니다. 20 분 상온에서 어둠의 샘플을 품어. 조심스럽게 SYBR 그린 솔루션에서 필터를 제거하고 모든 잔류 염료를 제거하는 Kimwipe와 필터의 뒷면 윅. 원하는 경우, 타워에 필터를 반환하고 여분의 얼룩을 씻어하는 필터를 통해 0.02 - μm의 여과 물 또는 멸균 미디어 800 μL까지 전달합니다. </li><li> 현미경 슬라이드에 antifade 솔루션의 작은 방울을 추가하고 위에 덮개 용지를 넣으십시오. 커버 슬립을 제거하고 antifade 솔루션와 젖은 현미경 슬라이드에 말린 필터를 추가합니다. 다시 커버 슬립에 antifade 솔루션의 작은 금액을 추가하고 천천히 그 양식을 수있는 모든 거품을 제거해야하고, 필터의 상단에 배치하십시오. </li><li> 필요가 (이가 변색 방지하기 위해 몇 개월 이내에 사용되며, 바이러스 카운트를 낮춘한다)까지 즉시 -20 ° C에서 슬라이드를 동결 </li><li> 바이러스는 다양한 파란색 필터 세트 (λ 예 = 450-490 nm의, λ λ 엠에서 억제 필터 = 510 NM = 510 nm의)와 (과 우리의 경우 Leica DMRXA 현미경) 형광 현미경을 사용하여 열거됩니다. 각 필터는 필터 멤브레인 전체 바이러스의 균등을 보장하기 위해 각 분야의 그리드에서 전체 바이러스를 계량해야하고, 계산보기 최소한 20 필드를합니다. </li><li> 세 독립에서 바이러스 reoccurrence의 평균 가격은 다음 계산하고 표준 편차가 생산 가격에서 결정됩니다 복제합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 연구자에 의해 수집된 원시 데이터는 바이러스 풍요의 reoccurrence 속도를 생성하기 위해 최소한의 수학적 처리를 필요로합니다. 본 연구의 결과 기본 데이터 집합은 incubations에서 subsamples에서 바이러스 풍요의 reoccurrence 요금입니다. 이러한 결과는 샘플의 각 바이러스 어번던스 대 시간의 독립 regressions를 형성하고 있습니다. 각 샘플에 대해 개별 incubations이 연구원은 가격뿐만 아니라 변화의 추정 (예 : 표준 편차) (그림 1 참조). 계산할 수있는 세 가지 복제 - incubations을 작성하여 이렇게 하나의 치료 역할 이 과정 중 하나 주의해야 할 점은 바이러스 어번던스 불변의 감소는 바이러스 부담을지고있는 예제에서 호스트 세포의 감소로 연결한다는 것입니다. 소스 (필터없는 해수 또는 호수)와 T = 0 배양 샘플 모두에서 손실, 세균성 풍요의 열거를 상쇄하기 위해서 필요합니다. 이 정보가 손실 세포의 비율을 위해 계정을 사용할 수 있습니다 바이러스 풍부한를 줄이는 과정이 또는 미생물 지역 사회의 모든 구성원에 대한 선택이 아니라고 가정하면,이 요소는 다음 바이러스의 현장 생산 가격 추정하는 데 사용할 수 있습니다 . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. epifluorescence 현미경을 사용하여 현장 조건에서 10 시간 보육을 통해 입자와 같은 바이러스. 샘플의 생산은 2008 년 9 월 뉴질랜드의 해안에서 피는 식물성 플랑크톤을 통해 수집된되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 바이러스 생산을 시금위한 워크플로우 프로세스의 개략도 그림.이 과정은 바이러스 무료 물을 생성하는 샘플 물 ultrafiltration 시작합니다. 이 ultrafiltration 시스템을 사용하여 완료됩니다. 미생물 커뮤니티 (감염되지 않은 감염된 세포의 혼합물을 포함) 유지하는 동안 병렬 물 샘플에서는 필터를 통해 전달되는 동일한 사이트 및 무료 바이러스로부터 수집하고 있습니다. 이 커뮤니티는 다음 바이러스 무료로 물에 resuspended 및 현장 조건에 따라 incubated입니다. 바이러스의 reoccurrence 요금은 다음 바이러스 생산 속도를 결정하기 위해 앞으로 10 시간 동안 감시하고 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

바이러스가 해양 미생물 커뮤니티에 영향을 어떻게 이해 핵심 구성 요소는 바이러스 입자가 생성되는 속도를 결정하는 것입니다. abundances이 (빌헬름 &amp; 셔틀 1999 Weinbauer 2004) 대부분의 시스템에서 정적 (자세한 이하)이며, 그 바이러스가 수중 시스템에 신속하게 제거 또는 비 전염성이 렌더링되는 것을 감안할 때 (빌헬름 외. 1998), 다음의 생산 가격이어야합니다 상대 빠른 손실 입자를 교체합니다. 사망률 바이러스는 미생물 커뮤니티 원인이 예측하는 것은 바이러스가 세포를 (이하 &quot;버스트 크기&quot;) lyses 때마다 생산 얼마나 많은 바이러스의 지식이 필요합니다. 자연 샘플에서 바이러스 버스트 크기는 크게 다를 수 있습니다. 버스트 크기는 전송 전자 현미경 (예 : Weinbauer &amp; Peduzzi 1994)에 의해 직접적으로 결정하지만, 이것은 항상 실용적이 아닌 주어진 실험실의 기능 넘어 자주하거나 수 있습니다. 그들이 경험적으로 결정되지 않을 수있는 상황에서, lytic 이벤트 당 24 바이러스의 문학 값은 담수 시스템 해양 시스템 34에 사용할 수 있습니다 (파라다 외. 2006). 바이러스 생산의 비율이 나눈 경우, 결과는 매일 바이러스에 의해 파괴 볼륨 당 세포의 풍부이다. 가치를 lysed 미생물 그런 다음 해당 시스템에 대한 바이러스 유도 사망률의 결과 세균성 풍요의 서 주식으로 나눌 수있다 : 기존 추정 범위 몇 %에서 거의 전체 인구와 자주 문제가 시스템의 다른 요소에 의존 (빌헬름 &amp; 메이트슨 2008). 총 사망률의 비율을 확인하려면이 번호는 종종 두 (세포의 50 %가 복제에 가서 세포의 50 %, Weinbauer 2004 년 손실 가정에서 작업) 곱한 것입니다. 되어 양분과 추적 요소 생체 이용율 (예, N, P, 철) 주요 생산성의 속도를 제한하고, 이러한 탄소 유량으로 수중 시스템을 통해,이 과정에서 바이러스 기반의 미생물 사망률의 역​​할의 이해 수 감안할 때 해양 geochemists에 관심. 몇몇 견적은 지금 (2009. 2008, 히긴스 외. 로우 외) 바이러스가 매일 물 열로 영양 요소의 상당 농도를 공개 제안 존재하고 이러한 요소들이 빠르게 미생물 지역 사회에 의해 동화되는 (Poorvin 동부 표준시 알. 2004 Mioni 외. 2005). 환경에 영양 흐름의 속도는 영양 당 셀 (표시된 &quot;할당량&quot;)의 금액에 의해 파괴 세포의 개수를 곱하여 결정하실 수 있습니다. 이 정보는 미생물의 식품 거미줄이 해양 시스템에서 작동하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요한 구성 요소를 제공할 수 있습니다. 지속적인 발전 : 연구 그룹의 일련의 현재 노력은 특정 생물이 바이러스 활동에 의해 영향을 방법을 결정하기 위해, 같은, 지역 사회 내의 특정 바이러스를 열거할 수 위의 전략을 채택하고 포함됩니다. 위해이 연구팀은 전체 바이러스 공동체의 추정에 병렬로 특정 바이러스의 그룹이나 가족의 풍부한을 예측할 수있는 정량 중합 효소의 연쇄 반응 (qPCR)를 사용합니다. 결과는 다음 직접 특정 플랑크톤 그룹에 대한 바이러스 사망률, 영양 매출 등 견적을 제공하기 위해 적용됩니다. 이 강력한 새로운 접근 방식은 향후 몇 년 동안 연구자가 바이러스의 생태와 관련된 프로세스에 더 깊게 조사하고, 처음으로, 실험실 시스템의 제약없는 특정 바이러스 호스트 커뮤니티의 상호 작용을 수치하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2.5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>Antifade용 스톡 솔루션</td></tr><tr><td>Amicon Proflux M12 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>이 단계에서 모든 초여과 장치를 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>SYBR Green I 핵산 젤 염색약</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>Helicon S10 30kDa 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>Pelicon XL 필터 0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>GE 0.2 &amp;mu;m PCTE 멤브레인 필터 (47mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 랩스케일 접선 흐름 여과(TFF) 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>이 단계에서 다른 TFF 시스템을 사용할 수 있음</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m Micronstep, 셀룰로스, 흰색 무지 필터 (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>GE Whatman 0.02 &amp;mu;m Anodisc 필터 (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA 현미경</td><td></td><td></td><td>청색 필터 세트가 장착된 모든 에피 형광 현미경 사용 가능</td></tr><tr><td>20L 폴리카보네이트 카보이</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0.05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td>50% 글루타르알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL 크라이오바이알-외부 나사산 폴리프로필렌</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>모든 크라이오바이알 사용 가능</td></tr><tr><td>Corning 5 mL 크라이오바이알-외부 나사산 폴리프로필렌</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>모든 크라이오바이알 사용 가능</td></tr><tr><td> 85% H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>스파이럴 멤브레인 보관용</td></tr><tr><td>NaOH 펠릿</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>M12 세척용</td></tr><tr><td>메스실린더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopore 0.8-&amp;mu;m 공경 멤브레인 필터 (142mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 스테인리스 스틸 가압 필터 홀더 (142mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

바이러스는 해양 및 담수 시스템의 전반 구성 요소이며, 미생물의 사망률의 중요한 대리인으로 알려져 있습니다. 우리가 그 미생물 지역 사회의 구조와 기능의 더 나은 모델을 개발뿐만 아니라 바이러스가 수상 biogeochemical주기를 변경하는 작업 방법을 우리의 이해를 사전에 수이 과정의 양적 추정을 개발하는 것은 중요합니다. 바이러스 감소 기술은 연구자 바이러스 입자가 발병 미생물 커뮤니티에서 공개되는 속도를 추정 할 수 있습니다. 미생물 커뮤니티 가까운 주위 농도 유지하는 동안 간단히, 무료 (세포) 바이러스의 풍부한는 샘플로 줄어 듭니다. 미생물 커뮤니티는 다음 무료로 바이러스의 부재와 바이러스 정량 (지역 사회의 이미 감염된 회원의 용해를 통해) 샘플에 reoccur epifluorescence 현미경에 의해 계량 수 또는 특정 바이러스의 경우, 어떤 속도에서 incubated입니다 PCR. 이 요금은 다음 바이러스 매개 세포 용해에 의한 미생물의 사망률의 속도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

해양 및 담수 시스템에 바이러스의 매출 비율은 감소하고 reoccurrence 기술로 예상하실 수 있습니다. 데이터는 연구자들이 해양 시스템에서 바이러스 중재의 미생물 사망률의 속도를 추측할 수 있습니다.

바이러스는 해양 및 담수 시스템에 널리 퍼져 있는 구성 요소이며, 미생물 사망의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 정량적인 ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 수생 미생물 군집에서 바이러스가 생성되는 속도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 천연 미생물 군집은 유지하면서 관심 대상 샘플 내 자유 바이러스의 풍부도를 감소시켜 수행합니다. 절차의 두 번째 단계는 해당 조건에서 샘플을 배양하고, 최대 10시간 동안 2~3시간마다 서브샘플을 수집하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 각 시점별로 수집된 하위 샘플 내의 바이러스를 수치화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 샘플 내 바이러스 입자 풍부도가 증가하는 속도를 측정하고 바이러스 생성률을 결정하는 것입니다. 궁극적으로, 수치화 과정을 통해 미생물 군집 내에서 바이러스가 생성되는 속도를 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 연구자는 바이러스 활동으로 인한 미생물의 사망률을 추론할 수 있습니다.안녕하세요. 저는 테네시 대학교 미생물학과의 Steven Milham 박사 연구실에서 근무하고 있는 Audrey Madison입니다. 오늘은 Charles Budoff, Claire Campbell과 함께 수생 시스템에서 바이러스가 생성되는 속도를 분석하는 절차를 보여드리겠습니다.이를 위해 샘플 내 유리 바이러스의 수를 줄이고, 바이러스에 감염된 미생물의 용해로 인해 이들이 다시 나타나는 비율을 측정합니다. 현재 저희 연구실에서는 바이러스의 생태와 바이러스가 미생물 군집을 어떻게 형성하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다. 이제 소개를 마쳤으므로, 본격적으로 시작해 보겠습니다.본 절차를 시작하기 전, 가능한 한 무균적으로 해수 약 20 liters를 수집하십시오. 샘플을 수집한 후, 142 millimeter 직경의 0.8 micron 필터로 물을 여과하십시오. 생물학적 생산성이 높은 시스템의 경우, 이전에 더 큰 공극 크기의 필터나 유리 섬유 필터로 먼저 여과할 수 있습니다.초여과수를 얻기 위해, 모든 바이러스를 제거할 수 있는 나선형 권취 막 카트리지가 포함된 AmCon M 12 시스템과 같은 초여과 시스템을 설정합니다. 그런 다음 샘플 내의 바이러스를 약 15~16 kPa의 역압에서 최대 속도의 약 25%로 제거 및 농축합니다. 약 500 mL의 농축액에는 농축된 바이러스 군집이 포함되어 있으며, 이는 다른 연구를 위해 보관할 수 있고, 바이러스가 제거된 여과액은 바이러스 생산 분석에 사용됩니다.매일 사용 후에는 필터 카트리지의 막 손상을 방지하기 위해 Omicron M 12 시스템을 세척하십시오. 해수를 사용하는 경우, 최소 6L의 Milli Q water로 막을 헹군 다음, 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 30분에서 45분 동안 세척하십시오. 그 후 다시 최소 6L의 Milli Q water로 카트리지를 헹구십시오.작업이 완료되면, 스파이럴 카트리지를 4 °C의 0.05 M 인산 용액에 보관할 수 있습니다. 바이러스 감소 방법을 시작하려면, 바이러스 제거수를 제조했던 곳과 동일한 위치에서 채취한 해수 샘플 500 mL를 0.2 µm 공칭 기공 크기의 저단백질 결합 필터가 장착된 스테레오 필터 유닛에 넣습니다. 이때, 시작 시점의 물에 포함된 바이러스와 박테리아의 총 풍부도를 측정하기 위한 하위 샘플도 함께 수집하십시오.멸균 전이 피펫을 사용하여 샘플을 계속 재현탁함으로써 박테리아 세포가 필터에 농축되는 것을 방지하면서, 200 mmHg 미만의 압력으로 샘플을 부드럽게 진공 가압합니다. 박테리아 개체군을 일정 밀도로 유지하면서 샘플 내 유리 바이러스의 양을 줄이기 위해, 초여과액 500 mL의 3배 부피를 박테리아 현탁액에 천천히 첨가합니다. 마지막으로 바이러스가 없는 초여과수로 박테리아 분획을 다시 500 mL로 희석합니다. 그다음, 이를 150 mL씩 세 개의 반복구로 나누어 투명한 250 mL 폴리카보네이트 병에 담습니다.이는 시간 0(time zero) 샘플 세트를 나타냅니다. 시간 0 샘플에서 박테리아 및 바이러스 풍부도 추정을 위한 샘플을 채취하십시오. 최종 농도가 2.0~2.5%인 멸균 glutaraldehyde가 포함된 cryo vial에 샘플을 옮기십시오.고정제로 사용하기 위해, 이 시료들을 액체 질소로 즉시 급속 냉동하고 처리 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 또는, 해양 미생물을 농축하기 위해 접선 유동 여과(tangential flow) 시스템을 사용할 수 있습니다. TFF 방법을 사용하려면, 천연 시료 약 500 mL를 준비하십시오.바이러스 감소 방법에서 설명한 바와 같이, 박테리아 분획이 초여과된 바이러스 제거수 10~15 mL 정도로 줄어들 때까지 0.2 micron 공칭 기공 크기의 접선 유동 여과 시스템을 사용하여 이 시료를 농축하고, 결과물인 반복 병들을 현장 조건에서 배양하십시오. SCE의 환경 챔버를 사용하여, 주변 온도를 유지하는 표층수 공급 장치에 연결된 유동 해수 배양기를 사용합니다. 청색 색조 아크릴이나 중성 밀도 차광망을 사용하여 빛의 세기를 낮춤으로써 광도를 표층 조건과 일치시킬 수 있습니다.현장 스테이션이나 실험실에서 작업하거나 해수를 흐르게 할 수 없는 경우에는 조명이 설치된 배양 인큐베이터를 사용할 수 있습니다. 0시점 샘플에 대해 수행한 방법으로 최소 10시간 동안 2.5시간마다 하위 샘플을 계속 수집하십시오. 일부 연구자들은 현미경 관찰용 샘플 외에도 특정 바이러스의 정량적 PCR 분석을 위해 물을 수집하고자 할 것입니다.qPCR 샘플의 경우, 고정제가 없는 크라이오 바이알에 샘플 5 mL를 넣고 액체 질소로 즉시 급속 냉동하여 바이러스 생성 현미경 관찰을 준비하십시오. 냉동된 샘플은 얼음 위에서 해동하고, 서면 프로토콜에 설명된 대로 용액을 새로 준비하십시오. 그런 다음 25 mm 크기의 0.02 µm 공극 크기를 가진 디스크 필터를 0.45 µm 셀룰로오스 백킹 필터 위에 배치하십시오. 이어서 고정된 샘플 850 µL를 아나디 필터 상단에 넣고 완전히 건조될 때까지 20 kPa 미만의 압력으로 진공 처리하십시오.아노 디스크 필터가 마르면, 멸균 페트리 접시에 사이버 그린(cyber green) 작업 용액 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 진공 상태를 유지한 채 필터 타워에서 아노 디스크를 조심스럽게 분리하여 사이버 그린 용액 위에 올립니다. 샘플을 실온의 암소에서 20분 동안 배양합니다.cyber green 용액에서 필터를 조심스럽게 꺼내고, Kim wipe로 필터 뒷면을 닦아 잔류 염료를 모두 제거합니다. 그다음 현미경 슬라이드에 Antifa 용액을 한 방울 떨어뜨리고 커버 글라스를 덮습니다. 커버 글라스를 제거한 후 건조된 필터를 현미경 슬라이드 위에 올립니다.다시 한번, 커버 슬립에 Antifa 용액을 소량 첨가하고 필터 위에 천천히 놓으며, 이때 형성될 수 있는 기포를 반드시 제거하십시오. 광범위 청색 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 바이러스를 계수하십시오. 필터 막 전체에 바이러스가 균일하게 분포되었는지 확인하기 위해, 각 필터당 최소 20개의 시야를 관찰하고 각 필드 그리드에서 전체 바이러스 수를 정량화하십시오. 세 번의 독립적인 반복 실험으로부터 바이러스 재발의 평균율을 계산하고, 생성율에 대한 표준 편차를 구하십시오. 마지막으로, 시작 시의 풍부도에서 바이러스가 감소된 시료의 희석된 풍부도까지의 미생물 희석 정도에 맞추어 이 비율들을 보정하십시오.본 연구의 주요 데이터 세트는 배양액 내 하위 샘플들의 바이러스 풍부도 재현율입니다. 이러한 결과는 각 샘플에 대해 시간 경과에 따른 바이러스 풍부도의 독립적인 회귀 분석을 형성합니다. 바이러스 유사 입자의 생성은 epi 형광 현미경을 사용하여 현장 조건에서 10시간의 배양 기간 동안 모니터링되었습니다.이 시료들은 2008년 9월 뉴질랜드 연안의 식물플랑크톤 대번식 기간 동안 수집되었습니다. 지금까지 바이러스 생산률을 추정하는 방법을 살펴보았습니다. 여기에는 다양한 초여과 시스템의 사용과 바이러스 생산률 측정을 위한 실험 수행 과정이 포함됩니다.또한, 우리는 epi 형광 현미경을 통해 이러한 바이러스의 수를 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 깨끗한 장비를 사용하고, 염색된 바이러스를 다룰 때는 빛을 차단하며, 샘플을 신속하게 처리하고, 매 사용 후 초여과 카트리지를 적절히 세척하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

이 논문은 자동 및 수동 액체 처리기를 사용하여 다양한 RNA 및 DNA 바이러스를 적정하는 고처리량 루시페라제 발현 기반 방법을 제시합니다.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

여기서 보고된 TCID50 분석법은 라벨 없는 실시간 임피던스 측정과 시스템의 바이러스학 모듈을 활용하여 바이러스 유발 세포병리 효과(CPE)를 실시간으로 객관적으로 모니터링합니다. 이 간소화된 분석법은 직접 손을 대고 작업하는 시간을 크게 줄이면서 고처리량의 정량적 동역학 CPE 측정을 지원하고 자동화된 실시간 TCID50 계산을 가능하게 합니다.

임피던스를 이용한 자동화된 바이러스 역가 정량을 위한 간소화되고 라벨이 없는 실시간 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50) 분석법

여기에서는 시아노파지(및 그 숙주)를 분리하기 위해 해양 및 담수 생태계의 유쾌한 영역에서 샘플링하는 방법과 단일 유전자형을 풍부하게 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학을 특성화하는 사후 샘플링 프로세스에 대해 설명합니다.

광합성 미생물 및 바이러스의 환경 샘플링: 현장에서 실험실까지

학습하세요 수생 미생물 군집에서 바이러스 생산 속도를 측정하는 방법을. 바이러스 감소 및 재발생 기법을 사용하여 해양 및 담수 생태계에서 미생물 사멸률을 추정할 수 있습니다.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

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