Name: 그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 Rev 의존적 렌티바이러스 벡터를 이용한 GFP 표현으로 HIV-1 양성 세포를 특이적으로 검출하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 및 항바이러스 전략 개발에 활용됩니다.

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작품은 NIAID에서 YW에 보건 서비스를 부여 1R01AI081568로와 M. 로젠과 Day2 주식 회사가 주최하는 2009 NYCDC 에이즈 라이드의 기증자와 라이더의 관대한 기부금에 의해 부분적으로 지원되었다

1. 레브 의존 Lentiviral 입자의 생산을위한 Plasmids의 Transfection 설정 : 레브 종속 GFP lentiviral 벡터, pNL - GFP - RRE - SA는, 이전 4,5,6 설명했다. 바이러스 입자로 조립하려면, 플라스미드는 HIV - 1 포장 구조, pCMVΔ8.2 (친절 박사 Dider Trono에서 제공)와 HEK293 T 세포에 contransfected 및 플라스미드는 VSV - G의 당단백질 (pHCMV - G)를 가지고 가던 중이었습니다 . transfection은 인산 칼슘 방법을 사용하여 실시되었다. 버퍼의 준비 : 10 X HBS는 (Hepes가 살린 버퍼) Hepes 5 G를 해소하여 준비했습니다 8 NaCl의 g, 100 ML에 나 2 HPO 4 (무수)의 KCl, 덱스 트로 오스의 1g, 0.103 g의 0.37 g H 2 O. 나누어지는 the10 X HBS의 한 ML의 aliquots에 버퍼와 -20 ° C.에 저장 transfection의 당시 H 2 O (1 : 5 희석) 2 X HBS에 10 X HBS로 변환하고, 사이에 7.05로 산도를 조정 - 7.12. (10 ML 2 X HBS를 위해, 그것은 보통 1M NaOH의 약 50 μL가 필요합니다.) 0.22 μm의 Millipore 필터를 통과하여 2X HBS 버퍼를 소독 필터. CaCl 2 버퍼는 최종 농도 2M 10 MM의 Hepes에 CaCl 2를 용해하여 만들어졌다. 5.8으로 산도를 조절, 4에서 버퍼와 저장소를 소독 필터 ° C.를 절차 : <ol><li> 이전 transfection 한 일, 종자 2 X 10 6 HEK293T 페트리 - 요리 100mm의 세포, 37 10 ML DMEM + 10% FBS에서 야간 세포를 성장 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 그 다음날, 세포의 표면에 뜨는 제거 5 ML 신선한 DMEM + 10% FBS, 4 시간 동안 지속적으로 문화 전지로 교체하십시오. </li><li> 5 ML의 폴리스티렌 관에서 480 μL 2X HBS 버퍼를 추가합니다. </li><li> 두 번째 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 480 μL의 총 부피 60 μL 2M CaCl 2 버퍼, 플라스미드 DNA 및 transfection TE 버퍼를 (1 MM 트리스, 25 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)을 추가합니다. 각 페트리 - 요리, plasmids은 pNL - GFP - RRE - SA, pCMVΔR8.3의 7.5 μg, 그리고 pHCMV - G 2.5 MG 10 μg의 비율에 추가되어야합니다. </li><li> 2 X HBS 튜브에 dropwise 플라스미드 DNA - CaCl 2 혼합물을 추가하고 30 분 동안 상온에서 알을 품다. 좋은 침전물이 형성됩니다. </li><li> 세포에 피펫으로 dropwise 혼합물의 960 μL를 추가합니다. ° C, 5 % CO 2 밤새 37 알을 품다. </li><li> 다음날, 뜨는을 제거하고 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고, 지속적으로 37 ° C, 5 % CO 2 밤새에서 세포를 품어. </li><li> 48 시간 게시 transfection에서 수확 뜨는을 제거 50 ML 멸균 튜브에 전송하여 바이러스. 각 페트리 - 그릇에 신선한 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고 야간 문화를 계속합니다. 4 바이러스 뜨는을 저장 ° C. </li><li> 뜨는를 수집하여 72시간 게시물 transfection에 수확을 계속합니다. 모든 supernatants를 결합하고, 펠릿 15 분 500 XG에서 supernatants를 원심과 세포 잔해를 제거합니다. </li><li> 뜨는은 0.22 μm의 Millipore 필터를 통해 수집 및 필터링되었습니다. 바이러스는 더 크기 배제 컬럼을 통해 집중되었다. </li></ol> 2. 바이러스성 입자를 집중 바이러스성 Titer 결정 <ol><li> 바이러스성 입자는 크기 제외 열 (100,000 MW가 잘려, Centricoin)에 의해 집중되었다. 바이러스성 뜨는은 열에로드, 4 15 분 동안 ° C에서 6,000 XG에 centrifuged했다. </li><li> 집중 바이러스 뜨는가 수집 aliquoted하고, -80 ° C.에 저장된 </li><li> 바이러스 titer는 TNF - 처리, HIV - 1 양성 재킷 세포 라인, J1.1 7 감염에 의해 결정되었다. 전지는 ML 당 2.5 X 10 5 셀 (100 ML 전체 볼륨)에서 96 접시에 잘 교양하고, 일주일 동안 순차적으로 희석 vNL - GFP - RRE - SA 100 ML에 감염되었습니다. 입자의 titer (TCID50)는 리드와 Muench 8 방법 다음과 같은 GFP 긍정적인 우물을 계산하여 추정되었다. </li></ol> 3. 마킹 HIV - 1 Lentiviral 입자와 함께 긍정적인 세포, vNL - GFP - RRE - SA 설정 : 인간의 CD4 T 세포 라인, CEM - SS는, 먼저 HIV - 1에 감염되었습니다. 48 시간 이후 감염에서, 세포는 lentiviral 입자 vNL - GFP - RRE - SA와 함께 superinfected되었습니다. 또 이틀 동안 superinfection 따라 GFP 양성 세포 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 컨트롤로서, HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포는 동일 vNL - GFP - RRE - SA에 감염되었습니다. 단지 HIV - 1에 감염된 CEM - SS 세포는 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포를 GFP 양성 세포에 상승했다지만. 절차 : <ol><li> 감염 전에 두 시간은 최종 농도 4 MG / ML에 polybrane를 추가합니다. 세포를 카운트하고 각 감염 2 × 10 5 세포를 가져가라. 2 시간 동안 HIV - 1 NL4 - 3 200 NG (p24)의 세포를 감염. </li><li> resuspend은 10 분 300 XG에서 원심 분리기에 의해 세포를 세척48 시간 37 2 X 10 5 세포 / ML, 문화에 세포 ° C. </li><li> 세포를 카운트하고 vNL - GFP - RRE - SA와 함께 감염 당 2 × 10 5 세포를 가져가라. ° C 야간 37 vNL - GFP - RRE - SA와 부화 100 ML을 추가합니다. 세포를 씻어 2 × 10 5 세포 / ML에 resuspend. </li><li> 48 시간 게시 superinfection에서 유동세포계측법 분석을 수행합니다. 감염된 세포는 pelleted 20 분 실온에서 incubated 500 ML 1 % paraformaldehede로 resuspended되었고, 다음 FACScan 분석기 (백톤 디컨슨)에서 분석했다. </li></ol> 4. 대표 결과 실험이 성공적으로 수행하는 경우에는 컨트롤에 GFP 양성 세포가 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS에서 검색되지 않습니다, 반면, 상당한 GFP의 인구는, 흐름 cytometer에 의해 HIV - 1에 감염된 CEM - SS 세포에 감지됩니다 세포. 실험이 성공적으로 수행하는 경우, 레브 의존 lentiviral 벡터, vNL - GFP - RRE - SA는 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현의 측정을 통해 세포 인구 생활의 복제 HIV의 매우 구체적인 검출을 허용합니다. 이 예제에서 수확 CEM - SS 세포는 마우스 CD24, HSA에 대한 PE - 라벨 쥐의 단클론 항체와 스테인드되었고, 다음 HSA 및 GFP의 표현 모두에 대해 흐름 cytometer에 분석했다. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 여기 같이, 상당한 GFP의 인구가 vNL - GFP - RRE - SA (그림 1C)와 superinfected HIV - 1에 감염된 세포에서 발견되었다. 대조적으로, GFP 양성 세포는 lentiviral superinfection (그림 1A) 또는 HIV - 1 lentiviral superinfection (그림 1B)와 감염되지 않은 세포.없이도 HIV - 1 감염되지 않은 CEM - SS 세포에서 발견되지 않았습니다

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이전 개발 태트 종속적인 표현 벡터와 마찬가지로 수익 시스템은 진화 HIV 과정의 착취가 여기에 설명되어 있습니다. 레브 - 의존의 포함은 복제 HIV의 존재에 LTR 기반 발현 벡터가 매우 의존 렌더링. 여기보고로 벡터의 응용 프로그램 HIV에 의존 기자의 바이러스는 HIV - 양성 세포를 식별하는 소설 새로운 접근 방식을 제공합니다. 벡터는 살아있는 세포의 검사를 허용하는 기본 또는 임상 실험에 대한 유전자를 표현하고 의사 입력 lentivirus 같은 대부분의 세포 유형과 조직에 액세스할 수 있습니다 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>생물안전작업대</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 배양기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>알레가(Allega)&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;C 냉장고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;C 냉장고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> -80&amp;#x00B0;C 냉장고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>셀로미터(Cellometer)&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포주</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS 세포주</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 세포주 J1.1</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>열불활성화 소태아혈청 (Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>클론화된 프로바이러스 DNA를 이용한 HeLa 세포의 형질전환을 통해 준비됨</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>pNL4-3의 모든 HIV ORF의 완전 결손</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>pNL-GFP-RRE에 HIV-1 A5 및 D4 삽입</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>Dider Trono 박사 제공</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS (Hepes 완충 식염수)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1% 파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 팔콘 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>5ml 라운드 바텀 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;M Millipore 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;M Millipore 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>크기 배제 컬럼(100,000MW 컷오프)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>2ml 냉동 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로원심분리기 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 lentiviral 벡터를 사용하여 hiv - 1 양성 세포의 특정 마킹

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

HIV - 응답 표현 벡터의 대부분은 HIV의 발기인, 긴 터미널 반복 (LTR)을 기반으로합니다. 초기 HIV 단백질, 태트 대응 반면, LTR는 세포 활성화 상태와 통합이 발생 지역 염색질 활동으로 반응합니다. 이것은 높은 HIV 독립적인 활동의 결과 수 있으며, 마르크 HIV 양성 세포가 1,2,3에 LTR 기반 기자의 유용성을 제한하고 있습니다. 여기, 우리는 태트 - 응답 LTR, 레브 - 반응 요소와 HIV의 splicing 사이트 4,5,6를 포함 수많은 HIV의 DNA 시퀀스 이외에, 가지고 표현 lentiviral 벡터를 잽니다. 벡터는 살아있는 세포 집단에서 HIV의 복제 매우 구체적인 감지를 허용, lentiviral 기자 바이러스에 통합되었다. 벡터의 활동은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 표현에 의해 측정되었다. 여기보고로 벡터의 응용 프로그램은 HIV - 양성 세포를 확인하기 위해 현장 PCR이나 HIV의 항원 얼룩과 같이 기존의 방법에 새로운 대안의 접근 방식을 제공합니다. 벡터는 또한 HIV - 양성 세포를 대상으로 기본 또는 임상 실험을위한 치료 유전자를 표현할 수 있습니다.

우리는 태트 - 응답성 LTR 이외에, 가지고 lentiviral 벡터를 개발, HIV - 1 태트 및 레브 종속적인 방식으로 기자의 유전자 발현을 조절 할 수 레브 - 반응 요소 (RRE). 벡터는 GFP의 표현을 통해 살아있는 세포에서 HIV 복제의 구체적인 검색을 허용합니다.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

대부분의 HIV 반응성 발현 벡터는 HIV 프로모터인 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat, LTR)을 기반으로 합니다. 이는 초기 HIV 단백질인 Tat에 반응하지만, ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 녹색 형광 단백질을 운반하는 HIV-1 rev 의존성 렌티바이러스 벡터를 사용하여 HIV 양성 세포를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 공동 형질전환(cot transfection)을 통해 rev 의존성 렌티바이러스 입자를 생성함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 HIV-1로 인간 CD4 T 세포를 감염시키는 것입니다.다음으로, HIV 양성 인간 CD4 T 세포에 GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스 입자를 중복 감염시킵니다. 마지막 단계는 유세포 분석법으로 GFP 양성 세포를 측정하여 HIV 양성 세포를 식별하는 것입니다. 궁극적으로 유세포 분석법을 통해 GFP 양성 세포의 백분율을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.rev 의존성 벡터가 HIV 감염 세포 내에서 치료 유전자를 전달하고 선택적으로 발현시켜 HIV 양성 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 점에서, 이 기술의 함의는 HIV 감염 치료로까지 확장됩니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자를 생성하는 절차는 본 실험실의 연구조교수인 gi가 시연할 것입니다. HEK 293T 세포에 rev 의존성 GFP 렌티바이러스 벡터, HIV-1 패키징 컨스트럭트 및 VSVG 당단백질을 포함하는 플라스미드 등 세 가지 플라스미드를 트랜스펙션합니다. 플라스미드 트랜스펙션 하루 전, 2 × 10⁶ 개의 HEK 293T 세포를 10 mL의 배지에 분주합니다.100 millimeter 페트리 접시에서 세포를 37 °C, 5% CO2 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포의 상층액을 5 milliliters의 신선한 배지로 교체합니다.그 다음 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 세포 배양을 계속합니다. 4시간의 배양 시간이 끝나기 전에 transfection 시약을 준비합니다. HEK 293T 세포에 rev 의존적 GFP 렌티바이러스 벡터 10 µg, HIV-1 패키징 컨스트럭트 7.5 µg, VSVG 당단백질 2.5 µg의 비율로 세 가지 플라스미드를 transfection합니다.먼저 세 가지 플라스미드 DNA를 원하는 비율로 미리 혼합합니다. 그런 다음 5 mL 폴리스티렌 튜브 두 개를 준비합니다. 첫 번째 튜브와 두 번째 튜브에 2배 농도의 HBS 버퍼 480 µL를 각각 첨가합니다.2 M 염화칼슘 완충액 60 µL를 혈장 DNA 및 transfection 완충액에 첨가하여 최종 부피를 480 µL로 맞춥니다. 다음으로, 혈장 DNA-염화칼슘 혼합물을 2x HPS 튜브에 한 방울씩 떨어뜨려 넣은 후, 상온에서 30분 동안 배양합니다.미세한 침전물이 점차 형성됩니다. 이제 혼합물 960 µL 전량을 피펫을 사용하여 HEK 2 9 3 T 세포에 한 방울씩 첨가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 S 상층액을 제거하고 신선한 배지 10 milliliters를 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 하룻밤 동안 다시 배양합니다. transfection 후 48시간이 지나면, 상층액을 제거하여 50 milliliter 멸균 튜브로 옮김으로써 바이러스를 수확합니다.신선한 배지 10 milliliters를 페트리 접시에 넣고 하룻밤 동안 계속 배양합니다. 바이러스 상층액은 4 °C에서 보관하십시오. 트랜스펙션 72시간 후에 상층액을 수집하고 이를 이전에 수집한 상층액과 합쳐 계속 수확합니다.그 후 S 상층액을 500 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 침전시키고 제거합니다. 원심분리가 끝나면 S 상층액을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 상층액을 0.22 µm millipore 필터로 여과합니다.바이러스는 크기 배제 컬럼을 통해 추가로 농축되며, 다음 단계에서 바이러스 입자를 농축하는 과정을 시연하겠습니다. 바이러스 상청액을 크기 배제 컬럼에 로딩하고 4°C에서 6,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 농축된 바이러스 상청액을 수집하고, 바이러스 역가 측정을 위해 약 100 µL를 따로 보관합니다.나머지를 소분하여 -80 °C에서 보관하십시오. 바이러스 역가를 결정하는 것은 이 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. GFP VIR 벡터를 이용해 세포를 효율적으로 감염시키려면 더 높은 감염 다중도(MOI)가 필요합니다.유세포 분석기로 검출 가능한 GFP 양성 세포의 백분율을 얻어 바이러스 역가를 결정하기 위해서, TNF 처리된 HIV V one 양성 Jurkat 세포주에 바이러스 상층액을 감염시킵니다. 이 HIV V one 양성 세포들을 배양합니다.96웰 플레이트에 mL당 2.5 × 10⁵개의 세포를 총 부피 100 µL로 분주합니다. HIV-1 양성 세포를 감염시키기 위해 rev 의존성 렌티바이러스 입자를 10배씩 6단계로 연속 희석하여 준비합니다. 각 웰의 세포에 희석된 바이러스 100 µL씩을 첨가합니다. 37 °C CO₂ 배양기에서 7일 동안 배양합니다.입자의 타이터(titer)는 형광 현미경으로 GFP 양성 세포를 관찰하여 추정합니다. 계산은 Reid 및 MU의 방법에 따라 수행하며, 타이터는 GFP 양성 웰(well)이 나타나는 희석 지점으로 결정합니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자로 감염시킨 웰의 50%에서 양성 세포가 관찰될 때를 기준으로 합니다.먼저 인간 CD4 T 세포주에 HIV-1을 감염시킵니다. 각 감염당 2×10⁵개의 세포를 사용합니다. 감염 2시간 전에.세포에 poly brain을 최종 농도 4 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 5 mL 튜브 중 하나에 HIV 용액을 피펫팅하여 세포를 감염시킵니다.나머지 두 개의 세포 튜브는 감염시키지 않고 대조군으로 사용합니다. 모든 세포를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 세포를 300 ×g에서 10분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거하여 세포가 없는 바이러스를 씻어낸 다음, 세포를 신선한 배지에 2 × 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁하여 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다.48시간 후, HIV 감염 세포를 감염시킬 준비가 됩니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자를 사용할 때는 2 × 10⁵개의 세포를 사용하여, HIV V1 감염 세포에 100 µL의 렌티바이러스 입자를 처리하여 감염시킵니다. 대조군으로 HIV V1 미감염 인간 CD4 T 세포 또한 100 µL의 렌티바이러스 입자로 감염시킵니다. 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날로 넘어갑니다.사용된 배지를 신선한 배지로 교체하고, 세포를 2×10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 감염 48시간 후, 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 다음 500 µL의 1% Paraformaldehyde에 재현탁하고, 재현탁된 세포를 유세포 분석용 튜브로 옮겨 유세포 분석을 수행합니다. 실온에서 20분간 배양한 후, FACScan 분석기를 사용하여 GFP 양성 여부를 분석할 수 있습니다.실험이 성공적으로 수행되면, rev 의존성 렌티바이러스 벡터 V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A를 통해 녹색 형광 단백질 GFP 발현 측정을 함으로써 살아있는 세포 집단 내에서 복제 중인 HIV를 매우 특이적으로 검출할 수 있습니다. 본 예시에서는 수집된 C-E-M-S-S 세포를 mouse CD 24 HSA에 대한 PE 표지 쥐 단클론 항체로 염색한 후, 여기에서 보여주는 바와 같이 유세포 분석기로 HSA와 GFP 발현을 모두 분석하였습니다. V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A가 중복 감염된 HIV one 감염 세포에서 상당한 규모의 GFP 집단이 검출되었습니다.대조적으로, 렌티바이러스 중복 감염이 없는 HIV V1 비감염 C-E-M-S-S 세포와 렌티바이러스 중복 감염이 있는 HIV1 비감염 세포 모두에서 GFP 양성 세포는 검출되지 않았습니다. HIV를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 생물안전 등급 준수와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.

포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

우리는 GFP를 표현하고 완전히 전염성이있다 maedi - visna 바이러스의 분자 클론을 설명합니다. 이 바이러스의 복제는 형광 현미경과 유동세포계측법를 사용하여 검색하실 수 있습니다.

전파와 녹색 형광 단백질을 표현 Maedi - visna 바이러스의 감염성 분자 클론을 검출

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

녹색 형광 단백질 유전자가 발견된 이래로 형광 단백질은 분자 세포 생물학에 영향을 미쳤습니다. 이 프로토콜은 유전 공학을 통한 뚜렷한 형광 단백질의 발현이 개별 세포를 바코드로 만드는 데 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 절차를 통해 세포 혼합물에서 고유한 집단을 추적할 수 있으며, 이는 다중화 응용 분야에 이상적입니다.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

학습하세요 Rev 의존적 렌티바이러스 벡터를 이용한 GFP 표현으로 HIV-1 양성 세포를 특이적으로 검출하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 및 항바이러스 전략 개발에 활용됩니다.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

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