그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

이 실험 절차의 전반적인 목표는 녹색 형광 단백질을 운반하는 HIV-1 rev 의존성 렌티바이러스 벡터를 사용하여 HIV 양성 세포를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 공동 형질전환(cot transfection)을 통해 rev 의존성 렌티바이러스 입자를 생성함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 HIV-1로 인간 CD4 T 세포를 감염시키는 것입니다.

다음으로, HIV 양성 인간 CD4 T 세포에 GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스 입자를 중복 감염시킵니다. 마지막 단계는 유세포 분석법으로 GFP 양성 세포를 측정하여 HIV 양성 세포를 식별하는 것입니다. 궁극적으로 유세포 분석법을 통해 GFP 양성 세포의 백분율을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.

rev 의존성 벡터가 HIV 감염 세포 내에서 치료 유전자를 전달하고 선택적으로 발현시켜 HIV 양성 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 점에서, 이 기술의 함의는 HIV 감염 치료로까지 확장됩니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자를 생성하는 절차는 본 실험실의 연구조교수인 gi가 시연할 것입니다. HEK 293T 세포에 rev 의존성 GFP 렌티바이러스 벡터, HIV-1 패키징 컨스트럭트 및 VSVG 당단백질을 포함하는 플라스미드 등 세 가지 플라스미드를 트랜스펙션합니다. 플라스미드 트랜스펙션 하루 전, 2 × 10⁶ 개의 HEK 293T 세포를 10 mL의 배지에 분주합니다.

100 millimeter 페트리 접시에서 세포를 37 °C, 5% CO2 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 세포의 상층액을 5 milliliters의 신선한 배지로 교체합니다.

그 다음 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 세포 배양을 계속합니다. 4시간의 배양 시간이 끝나기 전에 transfection 시약을 준비합니다. HEK 293T 세포에 rev 의존적 GFP 렌티바이러스 벡터 10 µg, HIV-1 패키징 컨스트럭트 7.5 µg, VSVG 당단백질 2.5 µg의 비율로 세 가지 플라스미드를 transfection합니다.

먼저 세 가지 플라스미드 DNA를 원하는 비율로 미리 혼합합니다. 그런 다음 5 mL 폴리스티렌 튜브 두 개를 준비합니다. 첫 번째 튜브와 두 번째 튜브에 2배 농도의 HBS 버퍼 480 µL를 각각 첨가합니다.

2 M 염화칼슘 완충액 60 µL를 혈장 DNA 및 transfection 완충액에 첨가하여 최종 부피를 480 µL로 맞춥니다. 다음으로, 혈장 DNA-염화칼슘 혼합물을 2x HPS 튜브에 한 방울씩 떨어뜨려 넣은 후, 상온에서 30분 동안 배양합니다.

미세한 침전물이 점차 형성됩니다. 이제 혼합물 960 µL 전량을 피펫을 사용하여 HEK 2 9 3 T 세포에 한 방울씩 첨가합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 S 상층액을 제거하고 신선한 배지 10 milliliters를 추가합니다. 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 하룻밤 동안 다시 배양합니다. transfection 후 48시간이 지나면, 상층액을 제거하여 50 milliliter 멸균 튜브로 옮김으로써 바이러스를 수확합니다.

신선한 배지 10 milliliters를 페트리 접시에 넣고 하룻밤 동안 계속 배양합니다. 바이러스 상층액은 4 °C에서 보관하십시오. 트랜스펙션 72시간 후에 상층액을 수집하고 이를 이전에 수집한 상층액과 합쳐 계속 수확합니다.

그 후 S 상층액을 500 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 침전시키고 제거합니다. 원심분리가 끝나면 S 상층액을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 상층액을 0.22 µm millipore 필터로 여과합니다.

바이러스는 크기 배제 컬럼을 통해 추가로 농축되며, 다음 단계에서 바이러스 입자를 농축하는 과정을 시연하겠습니다. 바이러스 상청액을 크기 배제 컬럼에 로딩하고 4°C에서 6,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 농축된 바이러스 상청액을 수집하고, 바이러스 역가 측정을 위해 약 100 µL를 따로 보관합니다.

나머지를 소분하여 -80 °C에서 보관하십시오. 바이러스 역가를 결정하는 것은 이 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. GFP VIR 벡터를 이용해 세포를 효율적으로 감염시키려면 더 높은 감염 다중도(MOI)가 필요합니다.

유세포 분석기로 검출 가능한 GFP 양성 세포의 백분율을 얻어 바이러스 역가를 결정하기 위해서, TNF 처리된 HIV V one 양성 Jurkat 세포주에 바이러스 상층액을 감염시킵니다. 이 HIV V one 양성 세포들을 배양합니다.

96웰 플레이트에 mL당 2.5 × 10⁵개의 세포를 총 부피 100 µL로 분주합니다. HIV-1 양성 세포를 감염시키기 위해 rev 의존성 렌티바이러스 입자를 10배씩 6단계로 연속 희석하여 준비합니다. 각 웰의 세포에 희석된 바이러스 100 µL씩을 첨가합니다. 37 °C CO₂ 배양기에서 7일 동안 배양합니다.

입자의 타이터(titer)는 형광 현미경으로 GFP 양성 세포를 관찰하여 추정합니다. 계산은 Reid 및 MU의 방법에 따라 수행하며, 타이터는 GFP 양성 웰(well)이 나타나는 희석 지점으로 결정합니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자로 감염시킨 웰의 50%에서 양성 세포가 관찰될 때를 기준으로 합니다.

먼저 인간 CD4 T 세포주에 HIV-1을 감염시킵니다. 각 감염당 2×10⁵개의 세포를 사용합니다. 감염 2시간 전에.

세포에 poly brain을 최종 농도 4 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 5 mL 튜브 중 하나에 HIV 용액을 피펫팅하여 세포를 감염시킵니다.

나머지 두 개의 세포 튜브는 감염시키지 않고 대조군으로 사용합니다. 모든 세포를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 세포를 300 ×g에서 10분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거하여 세포가 없는 바이러스를 씻어낸 다음, 세포를 신선한 배지에 2 × 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁하여 37 °C에서 48시간 동안 배양합니다.

48시간 후, HIV 감염 세포를 감염시킬 준비가 됩니다. rev 의존성 렌티바이러스 입자를 사용할 때는 2 × 10⁵개의 세포를 사용하여, HIV V1 감염 세포에 100 µL의 렌티바이러스 입자를 처리하여 감염시킵니다. 대조군으로 HIV V1 미감염 인간 CD4 T 세포 또한 100 µL의 렌티바이러스 입자로 감염시킵니다. 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날로 넘어갑니다.

사용된 배지를 신선한 배지로 교체하고, 세포를 2×10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 감염 48시간 후, 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 다음 500 µL의 1% Paraformaldehyde에 재현탁하고, 재현탁된 세포를 유세포 분석용 튜브로 옮겨 유세포 분석을 수행합니다. 실온에서 20분간 배양한 후, FACScan 분석기를 사용하여 GFP 양성 여부를 분석할 수 있습니다.

실험이 성공적으로 수행되면, rev 의존성 렌티바이러스 벡터 V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A를 통해 녹색 형광 단백질 GFP 발현 측정을 함으로써 살아있는 세포 집단 내에서 복제 중인 HIV를 매우 특이적으로 검출할 수 있습니다. 본 예시에서는 수집된 C-E-M-S-S 세포를 mouse CD 24 HSA에 대한 PE 표지 쥐 단클론 항체로 염색한 후, 여기에서 보여주는 바와 같이 유세포 분석기로 HSA와 GFP 발현을 모두 분석하였습니다. V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A가 중복 감염된 HIV one 감염 세포에서 상당한 규모의 GFP 집단이 검출되었습니다.

대조적으로, 렌티바이러스 중복 감염이 없는 HIV V1 비감염 C-E-M-S-S 세포와 렌티바이러스 중복 감염이 있는 HIV1 비감염 세포 모두에서 GFP 양성 세포는 검출되지 않았습니다. HIV를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 생물안전 등급 준수와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.