휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

다음 실험의 전반적인 목표는 식물 표피에서 형광 표지된 단백질의 세포 간 이동 정도를 분석하는 것입니다. 이는 DNA가 코팅된 금 입자를 사용하여 식물 표피에서 관심 있는 융합 단백질을 일시적으로 발현시켜 달성합니다. 두 번째 단계로, DNA를 식물 표피로 전달하여 테스트 대상인 융합 단백질의 발현과 이동이 가능하게 합니다.

다음으로, 형광 표지된 테스트 단백질의 발현 및 위치를 관찰하기 위해 공초점 현미경으로 발현된 융합 단백질을 관찰합니다. 공초점 현미경을 통한 형광 신호 분포 분석을 바탕으로 형광 표지된 단백질의 세포 간 이동 정도를 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕 주립대학교 스토니브룩 캠퍼스 생화학 및 세포생물학과 KY 연구실의 Ben Myers입니다.

오늘은 식물 표피에서 세포 간 이동 범위 또는 형광 표지 단백질을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 통해 다양한 식물 배경에서 식물 바이러스 이동 단백질의 세포 간 수송을 연구하고, 서로 다른 유형의 단백질 간 세포 이동성을 비교합니다. 그럼 시작하겠습니다.

본 프로토콜을 시작하려면 Promix bx에서 애기장대 식물 한 개체를 배양하십시오. 적절한 크기의 화분을 사용하고, Nicotiana hamana 및 Nicotiana tabacum 식물의 경우 짧은 광주기와 40~65% 상대 습도가 유지되는 환경 제어 챔버를 사용하며, 각 식물을 더 큰 화분의 Promix BX에서 배양하십시오. 마찬가지로, 긴 광주기와 40~65% 상대 습도가 유지되는 환경 제어 챔버를 제공하십시오.

이전에 설명한 대로 시판 제품을 사용하여 가끔 식물에 시비를 합니다. Opsis 식물을 6~8주 동안 성장시킨 후, 크기가 15 mm x 35 mm보다 큰 잎을 실험용으로 선택하십시오(길이 측정치에는 peole이 포함됨). n benanna 및 NAC 식물의 경우, 식물을 7~10주 동안 성장시킵니다. 그런 다음 end benanna는 50 mm x 70 mm보다 크고, nac은 100 mm x 125 mm보다 큰 잎을 선택하십시오.

이 경우, 길이 측정치에는 peole이 포함되지 않습니다. DNA가 코팅된 마이크로입자의 BIC 전달을 시작하기 전, 이전에 상세히 기술된 방법대로 DNA가 코팅된 금 마이크로입자를 사용하여 진 gun 카트리지를 준비합니다. 그런 다음, 날카로운 면도날로 동일한 발달 단계의 잎을 제거하고, AAL 면이 위로 향하게 하여 평평한 스티로폼 표면 위에 즉시 배치합니다.

잎의 ABA 면은 기공 밀도가 더 낮고 큐티클 층이 더 얇기 때문에 bombardment에 더 적합한 기질이 됩니다. rapid opsis와 같은 작은 잎은 창문 방충망 조각으로 덮고 push pin으로 스티로폼 표면에 고정하여 움직이지 않게 할 수 있습니다. 입자 전달 효율을 높이고 micro bombardment 과정 중 조직 손상을 최소화하려면 잎을 평평하게 유지하십시오.

그런 다음 DNA가 코팅된 미세입자가 들어있는 카트리지를 건에 삽입하십시오. 토끼 안구의 경우, 0.6 micron 미세입자를 사용하여 140에서 160 PSI의 압력으로 bắn팅을 수행하십시오.

잎당 하나의 카트리지를 사용하여 샘플에 빔을 쏘아 지름 10 내지 12 밀리미터의 표면적에 미세 입자를 분산시킵니다. end benanna 및 end baum의 경우, 크기가 더 큰 end benanna 및 end tobacco 잎을 사용하여 0.6 micron 미세 입자를 160 내지 180 PSI의 압력으로 발사합니다.

동일한 잎에 여러 번의 폭격(bombardment)을 수행할 수 있으나, 동일한 발달 단계의 잎 영역을 대상으로 하기 위해 중륵의 양측 대칭 위치에서 수행해야 합니다. 일시적으로 발현된 태그 단백질의 형광 신호는 공초점 현미경으로 시각화합니다. 각 테스트 단백질의 검출을 위해 최적의 현미경 설정값을 찾는 데 주의를 기울여야 합니다.

담배모자이크바이러스 이동 단백질(T-M-V-M-P)의 원형질막 국소화와 같이 신호 강도가 약하고 세포 내 축적이 제한적인 단백질을 관찰하려면 40배 대물렌즈를 사용하십시오. 이를 통해 더 높은 해상도와 향상된 민감도를 얻을 수 있습니다. 반면, 유리한 황색 형광 단백질(YFP)과 같이 신호 강도가 강하고 세포질에 분포하는 단백질의 경우, 공초점 줌 기능이 있는 10배 대물렌즈를 사용하여 더 빠르게 이미징할 수 있습니다. 형광 신호를 포함하는 다세포 클러스터의 외형을 통해 단순 수송이 일어났음을 추론할 수 있습니다.

이러한 클러스터의 수와 각 클러스터 내의 세포 수는 세포 간 수송의 정도를 나타냅니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 실험 시스템당 최소 100개의 발현 클러스터를 기록하고, 실험을 동시에 수행하도록 주의하십시오.

비교 분석을 수행할 때입니다. 여기서는 형광 표지된 단백질의 단순한 이동이 검출되었습니다. TMV mp-YFP 발현 컨스트럭트를 end hamana 잎에 마이크로 폭격(micro bombardment)한 후 얻은 전형적인 공초점 이미지가 제시되어 있습니다.

YFP 신호의 다세포 클러스터 출현을 통해 TMV MP YFP의 단순한 이동이 관찰됩니다. 하지만 일부 마이크로 입자 총격법(micro bombardment)에서 단일 세포 신호가 나타나는 것으로 보아, 일시적으로 발현된 모든 TMV MP YFP가 이동할 수 있는 것은 아닙니다.

통계적으로 측정된 신호 클러스터의 40% 미만에서 TMV MP YFP는 세포 간 이동이 불가능했습니다. 반면, 60% 이상의 클러스터에서는 단백질이 2개에서 5개의 세포 사이로 이동했습니다. 두 개의 세포로 확산되는 경우가 가장 빈번했으며, 이는 고유한 이동 활성이 없는 상대적으로 작은 분자 크기의 단백질이 세포 간 이동을 위해 세포막 SMA를 통해 확산될 수 있음을 보여줍니다.

예를 들어, 유리 YFP 또는 하나의 XYFP는 여러 세포와 계산된 클러스터의 30% 이상으로 확산됩니다. 반대로, TMV MP YFP 융합 단백질과 크기가 유사하며 완전히 세포 자율적인 번역 YFP 이량체 또는 두 개의 XYFP에서는 이러한 비특이적 확산이 일어나지 않습니다. 지금까지 유전자 총(gene gun) 시스템을 이용한 식물 표피의 일시적 발현을 통해 형광 표지 단백질의 세포 간 이동을 분석하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 건강하고 튼튼한 식물을 준비하고, DNA 전달을 위해 고품질의 DNA 코팅 금 입자를 준비하며, 통계적으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 충분한 수의 발현 클러스터를 분석하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.