Name: 휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 학습하세요 식물 표피에서 형광 표기 단백질의 세포 간 이동을 분석하는 방법을 바이올리스틱 포격과 공초점 현미경을 활용하여. 이 기법은 단백질 운반 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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배경 식물 세포 연결을 통해 macromolecules의 Symplastic 교통, plasmodesmata는 많은 식물 병리학과 생물학에 관심이 있습니다. 예를 들어, 여러 바이러스 단백질은 바이러스 운동 1-3 있도록 plasmodesmal 크기 제외 한도를 규제하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들이 중요한 발달 규제 중 일부 내생 단백질은, 비 셀 자율적으로 4 기능, 아마도 plasmodesmata을 통해 세포에서 세포로 이동 간주됩니다. 따라서 식물 세포 사이의 macromolecular 운송을 파악하고 시각화하는 신뢰할 수있는 방법론이 훨씬 수요에 있습니다. 1) 대상 식물을 성장 높은 변환 효율을위한, 건강, 강력한 식물을 사용해야합니다. 1. Arabidopsis 식물 짧은 photoperiod (130-150 μE m -2 -1의 빛 8 시간 23 °와 환경 제어 챔버의 냄비에 프로 믹스 BX 한 Arabidopsis 공장 (10cm X 10cm X 10cm) 성장 C/16 20 시간 어두운 ° C)과 6~8주 5 40-65% 상대 습도. 5 설명된대로 상용 제품을 종종 그들을 비옥. 15mm X 35mm (길이 측정은 잎자루 포함)보다 큰 크기로 단풍이 실험을 위해 선택됩니다. 2. N. benthamiana와 N. tabacum 긴 photoperiod (23 ° C에서 130-150 μE m -2 -1의 빛을 16 시간과 환경 제어 챔버에 냄비 (20cm X 20cm X 20cm)에 프로 믹스 BX 한 식물을 성장 / 8 20 어두운 HR ° C) 및 7~10주에 대한 40-65% 상대 습도. 묘사와 같은 상용 제품을 종종 그들을 비옥. N. 대한 사이즈 50mm보다 큰 X 70mm와 잎 N. benthamiana에 대한, 또는 100mm X 125mm tabacum가 (이 길이 측정 잎자루에 포함되지 않습니다) 실험 선택됩니다. DNA - 코팅 골드로 진 건 카트리지 2) 준비 Microparticles 이 실험 단계에 대한 프로토콜은 이전에 여섯 자세히 설명되었습니다. 그것은 높은 농도 (~ 1 μg / μl) 실험의 나중 단계 동안 공촛점 현미경 분석의 용이성을위한 최고의 변환 효율을 얻기 위해에 잘 정화 플라스미드 DNA를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 형광 신호 클러스터와 어울리는 세포의 숫자가 symplastic 수송의 범위 (즉,의 지표로 사용되기 때문에 분석을 위해, 그것은 준비 카트리지가 높은 주파수에서 동시에 둘 이상의 인접한 세포를 변형하지 않는 확인할하는 것이 중요합니다 , multicell 신호 클러스터)가 움직임을 나타내는 반면 신호를 포함하는 하나의 조직이 어떤 움직임을 나타냅니다 없습니다. 카트리지 각의 품질은 단백질 16-20시간 포스트 충격의 표현을 분석하여 확인하실 수 있습니다. 우리 프로토콜 6는이 실험 따라서 적당이 시간 프레임에있는 모든 표현 행사 &lt;3 %,에서 multicell 표현 클러스터를 얻을 카트리지를 생산하고 있습니다. DNA - 코팅 Microparticles 3) Biolistic 배달 <ol><li> 날카로운 면도날과 같은 발달 단계 (즉, 같은 크기와 같은 나이로, 1 단계를 참조)의 잎을 제거하고 즉시 평면 스티로폼의 표면에까지 직면하고있는 abaxial 측면으로 그들을 놓으십시오. 잎사귀의 abaxial 측면 때문에 그들의 비교적 작은 크기의 Arabidopsis 잎은, 윈도우 화면 메쉬의 조각으로 덮여 있어야합니다. 그 낮은 trichome 밀도와 얇은 표피로 인해 충격을 위해 더 나은 기판을 대표하고, 메쉬 다음 pushpins과 안전 스티로폼 표면 수 있습니다. 유지은 평면은 입자 전달의 효율성을 증가하고 microbombardment 동안 조직에 대한 손상을 최소화 떠납니다. </li><li> 총으로 DNA - 코팅 microparticles (1 단계에서 준비)와 카트리지를 삽입합니다. Arabidopsis 들어, 촬영은 0.6 - μm의의 microparticles 1 - μm의 microparticles, 그리고 140-160 PSI에 대한 80-110 PSI의 압력에서 수행됩니다. N. 들어 benthamiana 담배는 촬영은 0.6 - μm의 microparticles 1 - μm의 microparticles, 그리고 160-180 PSI에 대한 PSI의 압력 100-120에서 수행됩니다. 각 잎은 직경 10-12mm의 영역 microparticles을 확산 한방에 충분한 면적을 가지고 있기 때문에 Arabidopsis 위해, 우리는 일반적으로 잎 당 하나의 카트리지를 사용합니다. 큰 N.으로 benthamiana와 담배 잎 같은 잎의 여러 bombardments은 가능하지만, 그들은 (토론 참조) 같은 발달 단계에서 잎 영역을 대상으로 중간 리브의 양쪽에 대칭 위치에서 수행되어야합니다. </li><li> 스티로폼 표면에서 잎을 제거하고 그들에게 내가 배치서부 유럽 표준시 왓먼 필터 종이 3 레이어가 아닌 페트리 접시는 Parafilm와 페트리 접시를 밀봉하고, 그들의 단백질 제품의 배달 transgenes와 휴대 전화의 운동 잠재력의 표현을 허용하기 위해 36-48 시간을위한 실내 온도에서 품어 . </li></ol> 단백질의 표현 4) 영상 transiently 표현 태그 단백질의 형광 신호는 공촛점 현미경에 의해 시각입니다. 치료는 각 테스트 단백질의 검출을위한 최적의 현미경 설정을 찾을로 이동해야합니다. 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스 운동 단백질 (TMV MP) 1-3,6의 plasmodesmal 지방화로 약한 신호 강도와 제한 세포내 축적을 보여 단백질은 높은 해상도와를 내실수 40X 객관적인 렌즈, 아래의 관찰해야합니다 감도는 반면, 같은 무료 YFP와 같은 강력한 신호 농도, 세포질과 유통을 보여 단백질 빠른 영상에 대한 공촛점 줌 기능이있는 객관적인 10X 렌즈 (그림 1 참조)에서 시각하실 수 있습니다. Symplastic 수송은 형광 신호를 포함하는 multicell 클러스터의 모양에서 유추됩니다. 각 클러스터의 클러스터와 같은 세포의 수를는 휴대 전화 전송의 범위 나타내는 것입니다. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면, 최소한 100 표현 클러스터는 각 실험 시스템마다 기록해야합니다. 예를 들어, 단백질의 휴대 전화의 움직임이 총 200 표현 클러스터의 두 가지 다른 유전 배경 (예, 야생 종류와 유전자 변형 식물)에 비교하면이 기록되어야합니다. 중요한 것은, 실험, 서로 비교해야하는 결과가 동시에 진행되어야합니다. 5. 대표 결과 아래의 그림은 찬란 태그 단백질의 symplastic 교통 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 패널은 A와 B는 N.의 다음 microbombardment를 획득하는 전형적인 공촛점 이미지를 표시 TMV MP - YFP - 표현과 benthamiana 리프가 건설. 패널에서 TMV MP - YFP의 A, symplastic 운동은 YFP 신호의 multicell 클러스터의 모양에 따라 관찰합니다. 모든 transiently 표현 TMV MP - YFP은 일부 microbombardments (패널 B)의 단일 세포 신호에 의해 입증 이동시킬 수 없습니다. 통계에 &lt;계산 신호 클러스터의 40 %, TMV MP - YFP는 반면, 세포 사이를 이동할 수없는&gt;의 클러스터의 60 %, 단백질은 두 세포 확산이 가장 자주 있기 때문에 2-5 셀 사이를 이동 (ca. ~ 50 % 가지 경우) (그림 1C). 타고난 운동 활동을하지 않고 비교적 작은 분자 크기의 단백질은 휴대 전화를 이동하는 PD를 통해 확산하실 수 있습니다. 예를 들어, 무료 YFP, 또는 1xYFP은 (ca. 27 KDA, 패널 D), 계산 클러스터 (패널 C)의 30 %가 여러 세포 사이에 확산됩니다. 이 이외의 특정 확산은 TMV MP - YFP 융합 단백질 (57 KDA)의 크기 비교이며, 완전히 셀 자치있는 translational YFP의 주차 또는 2xYFP (54 KDA, 패널 E)에 대한 발생하지 않습니다 (그림 1C). <img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> N.의 symplastic 교통 분석에서 얻은 그림 1. 전형 결과 benthamiana 잎 조직. TMV MP - YFP의 (A, B) 시각. 신호 클러스터 (C) Quantitation. 1xYFP 및 2xYFP, 무료 YFP 각각 translational YFP 이합체. 1xYFP의 (D) 시각. 2xYFP의 (E) 시각. micrographs에서, 왼쪽 패널 YFP 신호를 표시하고 오른쪽 패널 합병 YFP의 이미지 (녹색) 및 엽록체의 autofluorescence (흰색) 신호를 보여줍니다. 이미지는 단일 공촛점 섹션입니다. micrographs에 별표 YFP 신호를 보여주는 표피 세포를 보여줍니다. 바 = 50 μm의.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

symplastic 교통 분석의 성공에 대한 열쇠는 통계적으로 중요한 쉽게 detectible 신호 클러스터의 생산을 허용 높은 변환 효율을 얻을 수 있습니다. 이것은 건강, 강력한 식물에서 수확한 잎을 사용하고 순수하고 집중 DNA 준비로 코팅된 금 입자를 준비 얻을 수 있습니다. 같은 성장 단계에서 나뭇잎을 사용하면 분석의 신뢰성을 위해 매우 중요합니다. Plasmodesmal 조리개는 differentially 조직 7-11의 발달 단계에 따라 규제 것으로 알려져있다. 많은 식물의 종류 단풍의 기초 12 부보다 더 성숙되고있는 잎의 꼭대기의 일부로, 꼭대기에서 기지로 basipetally 개발할 수 있습니다. 따라서, 실험의 각 집합에 대해 선택한 단풍 (보통 자신의 크기와 줄기에 위치하여 반영)의 발달 단계뿐만 아니라 동일해야하지만, microbombardment 대상 잎 영역은 동일한 위치에 위치해야합니다. <p clas...

<table><tbody><tr><td>금 미립자, 직경 1.0 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>금 미립자, 직경 0.6 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel 튜브</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Helios 카트리지 준비 스테이션</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>튜브 커터</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Helios 유전자 총</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>헬륨 가스 조절기</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

휴대 전화의 macromolecular 교통 분석 planta에 biolistic 포격을 활용

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

여기, 우리는 planta에서 휴대 전화의 macromolecular 수송의 범위를 감지하고 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에 관심이 찬란 태그 단백질은 transiently의 인코딩 DNA의 전달 구조 biolistic 다음과 식물 조직에 표시됩니다. 태그 단백질의 내부 및 세포 분포는 다음 공촛점 현미경으로 분석됩니다. 우리는 분석하기 위해 단계별 절차를 제공 세부 사항이 기술을 설명하는 세 식물 종 (种)의 symplastic 단백질 수송의 범위, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana 및 N. 평가 tabacum (담배).

식물 세포 사이 Macromolecular 거래는 transiently 관심 찬란 - 태그 단백질을 표현하고 공촛점 현미경하여 내부와 세포 분포를 분석하여 평가하실 수 있습니다.

휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

본 연구에서는 식물체 내(in planta)에서 세포 간 거대분자 수송을 검출하고 그 범위를 평가하는 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 식물 표피에서 형광 표지된 단백질의 세포 간 이동 정도를 분석하는 것입니다. 이는 DNA가 코팅된 금 입자를 사용하여 식물 표피에서 관심 있는 융합 단백질을 일시적으로 발현시켜 달성합니다. 두 번째 단계로, DNA를 식물 표피로 전달하여 테스트 대상인 융합 단백질의 발현과 이동이 가능하게 합니다.다음으로, 형광 표지된 테스트 단백질의 발현 및 위치를 관찰하기 위해 공초점 현미경으로 발현된 융합 단백질을 관찰합니다. 공초점 현미경을 통한 형광 신호 분포 분석을 바탕으로 형광 표지된 단백질의 세포 간 이동 정도를 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕 주립대학교 스토니브룩 캠퍼스 생화학 및 세포생물학과 KY 연구실의 Ben Myers입니다.오늘은 식물 표피에서 세포 간 이동 범위 또는 형광 표지 단백질을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 통해 다양한 식물 배경에서 식물 바이러스 이동 단백질의 세포 간 수송을 연구하고, 서로 다른 유형의 단백질 간 세포 이동성을 비교합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 프로토콜을 시작하려면 Promix bx에서 애기장대 식물 한 개체를 배양하십시오. 적절한 크기의 화분을 사용하고, Nicotiana hamana 및 Nicotiana tabacum 식물의 경우 짧은 광주기와 40~65% 상대 습도가 유지되는 환경 제어 챔버를 사용하며, 각 식물을 더 큰 화분의 Promix BX에서 배양하십시오. 마찬가지로, 긴 광주기와 40~65% 상대 습도가 유지되는 환경 제어 챔버를 제공하십시오.이전에 설명한 대로 시판 제품을 사용하여 가끔 식물에 시비를 합니다. Opsis 식물을 6~8주 동안 성장시킨 후, 크기가 15 mm x 35 mm보다 큰 잎을 실험용으로 선택하십시오(길이 측정치에는 peole이 포함됨). n benanna 및 NAC 식물의 경우, 식물을 7~10주 동안 성장시킵니다. 그런 다음 end benanna는 50 mm x 70 mm보다 크고, nac은 100 mm x 125 mm보다 큰 잎을 선택하십시오.이 경우, 길이 측정치에는 peole이 포함되지 않습니다. DNA가 코팅된 마이크로입자의 BIC 전달을 시작하기 전, 이전에 상세히 기술된 방법대로 DNA가 코팅된 금 마이크로입자를 사용하여 진 gun 카트리지를 준비합니다. 그런 다음, 날카로운 면도날로 동일한 발달 단계의 잎을 제거하고, AAL 면이 위로 향하게

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Biology

생물학

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

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담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

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Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

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포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

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고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

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