셀없는 매체 Wolbachia을 유지

제 이름은 Courtney Ston입니다. 저는 Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health의 Jason Rascon 박사님 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 배양된 곤충 세포로부터 박테리아를 정제하는 방법을 알아보겠습니다.

이는 매우 간단한 절차입니다. 먼저 세포를 수확한 다음, 유리 구슬 용해법(glass bead lysis)을 사용하여 진핵질 숙주 세포막을 물리적으로 파쇄합니다. 그 후 차등 원심분리를 통해 박테리아를 숙주 세포 잔해로부터 분리합니다.

그런 다음 일련의 여과 단계를 통해 숙주 세포 입자를 추가로 제거하여, 최종적으로 정제된 박테리아 펠렛만 남게 합니다. 이는 실제로 주요 요구 사항 중 하나입니다. 이것은 세포 배양 후드이며, 세포 배양은 오염되기 매우 쉽기 때문에 모든 것을 멸균 상태로 유지하는 데 사용됩니다.

또한 세포 배양 배지와 세포가 필요하며, 세포는 플라스틱 플라스크에서 배양합니다. 3mm 비드 비드, 50ml 원심분리 튜브가 필요하며, 박테리아를 펠릿화하기 위해 약 18,000 G의 고속 원심분리가 가능하면서도 숙주 세포를 펠릿화하기 위해 약 3,000 G 또는 2,500 G로 설정 가능한 원심분리기가 필요합니다. 먼저 배양된 세포부터 시작하겠습니다.

세포가 배양되었죠? 이것들은 T 75 플라스크입니다. 여기에는 15 mL의 배양 배지와 우리 자신의 샘플이 들어 있습니다.

가장 먼저 세포층을 분리하여 50 ml 원심분리관에 수집하는 것부터 시작하겠습니다. 세포층 위아래로 가볍게 긁어내면 모든 세포가 배지로 밀려 나옵니다. 세포가 배지에 섞이면, 이를 피펫으로 옮겨 50 ml conical 튜브에 넣습니다.

이제 두 개의 세포 현탁액에 3 mm 유리 비즈를 추가하겠습니다. 이 비즈들은 고압 멸균 처리되었으며 실제로 재사용이 가능합니다. 세척 후 표백제에 담가 두었다가 다시 사용하기 전에 고압 멸균하여 사용할 수 있습니다.

유리 B 병의 입구가 원심분리 튜브의 입구에 닿지 않도록 주의하며 부어줍니다. 각 원심분리 튜브에 5 mL 표시선까지 유리 비즈를 넣습니다. 그다음으로, 현탁액 속으로 박테리아를 방출하기 위해 eary 세포를 물리적으로 파쇄합니다.

따라서 볼텍스 믹서를 사용하여, 가장 높은 강도로 설정한 뒤 5분 동안 볼텍싱합니다. 이제 3 mm 유리 비즈와 함께 세포를 5분 동안 볼텍싱하고, 깨끗한 피펫을 사용하여 상층액을 깨끗하고 멸균된 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이렇게 하여 새로 생성된 현탁액을 얻게 되며, 이 현탁액은 방출된 박테리아와 용액뿐만 아니라 전체 세포 파편을 포함하고 있습니다.

다음 단계로는 저속 원심분리 단계를 수행하여 전체 물질을 침전시키고 박테리아는 부유 상태로 남겨둘 것입니다. 원심분리기를 사용하여 2,500 ×g에서 10분 동안 원심분리하겠습니다. 또한, 바닥에 펠릿을 효율적으로 수집하기 위해 4 °C에서 원심분리를 진행하겠습니다.

이제 이를 튜브에 넣고, 균형을 맞춘 후 뚜껑을 닫고 10분 동안 원심분리합니다. 숙주 세포 잔해와 정제된 박테리아가 포함된 상청액을 원심분리하였습니다. 2,500 G에서 10분 동안 수행했습니다.

보시는 바와 같이, 튜브 바닥에는 세포 파쇄물이 포함된 펠렛이 형성되어 있습니다. 새로 분리된 박테리아는 원심분리 속도가 충분히 높지 않아 펠렛으로 침전되지 않고 여전히 상층액에 남아 있습니다. 따라서 다음 단계로 상층액을 제거한 후 5 µm 필터로 여과하겠습니다.

이것은 5 µm 필터이며 사실상 모든 종류의 시린지에 장착할 수 있습니다. 저는 30 ml 시린지를 사용할 예정입니다. 우선 플런저를 위로 당긴 다음, 필터 본체, 특히 아래쪽 부분은 멸균 상태를 유지해야 하므로 만지지 않도록 주의합니다. 필터를 시린지에 돌려 끼워 연결한 후, 플런저를 부드럽게 눌러 상층액을 튜브로 통과시켜 옮깁니다.

필터를 파손시켜 더 이상 사용할 수 없게 될 수 있으므로 너무 세게 누르지 않도록 주의하십시오. 많은 압력을 가해야 하는 상황이 되면 필터가 세포 잔해로 많이 막혔다는 의미이므로, 필터를 제거하고 교체해야 합니다. 이때 매우 순수한 박테리아 배양물을 얻기 위한 추가적인 방법으로, 부피에 따라 필터 멸균된 250 millimolar sucrose 용액을 고속 원심분리 튜브에 첨가합니다.

병의 약 80% 이상이 채워지도록 합니다. 보통 병의 목 부분까지 채웁니다. 고속 원심분리기 내부에서 튜브가 찌그러지지 않도록 하려면 이 정도로 충분히 채워야 합니다.

이제 고속 원심분리기를 사용하여 18,000 ×g에서 상층액을 원심분리하여 정제된 박테리아를 회수하겠습니다. 튜브를 당연히 균형 있게 배치한 다음 뚜껑을 닫습니다. 시간은 10분으로 설정하겠습니다.

이 과정은 10 °C 이하에서 진행하는 것이 좋으며, 온도는 여기에서 설정되어 있습니다. 그리고 이 원심분리기의 특정 로터에 대한 각속도는 12.5 rpm입니다. 변환 도표에 따르면, 이는 약 18,670 ×g의 속도로 회전하게 됩니다. 이제 정제된 박테리아를 펠렛화하기 위한 고속 원심분리를 수행하였습니다.

이제 보시는 바와 같이, 고속 원심분리관 바닥에 박테리아 펠릿이 잘 형성되었습니다. 이제 상층액을 모두 제거하여 액체 폐기물 용기에 버리겠습니다. 이 단계에서 수행해야 할 작업은 박테리아를 재현탁하는 것입니다.

10% 열불활성화 태아 송아지 혈청이 첨가된 Schneider의 곤충 배지인 배양액 2 mL에 이를 다시 현탁하겠습니다. 그리고 모든 박테리아가 다시 용해될 때까지 피펫팅으로 펠릿을 현탁하겠습니다. 이제 박테리아가 다시 현탁되었으므로, 다른 잠재적인 숙주 세포 잔해를 제거하기 위해 한 번 더 정제 단계를 거치겠습니다.

이를 위해 2.7 µm 필터를 사용할 것입니다. 제가 선호하는 방법은 5 µm 필터의 플라스틱 케이싱을 홀더로 사용하는 것입니다. 용액을 취한 후, 주사기를 2.7 µm 필터에 결합하고, 이제 장기 보관용 튜브에 필터링하여 담습니다.

다른 필터와 마찬가지로, 플런저를 살며시 누릅니다. 이제 정제된 박테리아 용액이 준비되었습니다. 다음으로 보여드릴 내용은 생존력 분석 방법입니다.

당사는 Molecular Probes사의 backlight live dead bacterial viability kit를 사용합니다. 이 키트에는 두 가지 염색약인 propidium iodide와 cyto nine propidium iodide가 포함되어 있습니다. propidium iodide는 적색 형광을 띠며, 세균 막이 완전히 온전하지 않은 세균만을 염색합니다. cyto nine은 모든 세균을 염색합니다.

따라서 형광 광학 장치가 장착된 현미경으로 이 박테리아들을 관찰하면, 모든 박테리아는 녹색 형광을 띠며 그중 사멸한 일부 박테리아는 적색 형광을 띱니다. 정제된 샘플에서 소량의 분주액을 취하는데, 이번 경우에는 슬라이드 한 장을 만들기에 충분한 양인 10 µL만 취하겠습니다. 그리고 이를 다른 두 개의 튜브에 분주하겠습니다.

그런 다음 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)와 cyto nine 혼합액 1 µL를 박테리아 현탁액에 추가합니다. 이후 이를 암소에서 15분 동안 배양합니다. 하지만 실제로 즉시 마운팅하여 관찰하더라도 결과를 확인할 수 있다는 것을 알 수 있었습니다.

이제 backlight live/dead 염색약으로 박테리아를 염색한 슬라이드를 관찰하겠습니다. 슬라이드 위에 염색약을 분주하고 커버 글라스를 덮은 뒤 관찰하겠습니다. 박테리아의 생존력을 평가하기 위해 적색-녹색 혼합 필터를 사용하겠습니다.

셔터를 열면 박테리아가 보이는데, 거의 작은 점처럼 보입니다. 여기서 약 90에서 95%의 박테리아는 녹색인 반면, 빨간색은 약 5% 정도인 것으로 보입니다. 따라서 생존율이 매우 높다고 할 수 있겠지요?

지금까지 배양된 곤충 세포로부터 생존 가능한 Akia를 정제하는 과정을 살펴보았습니다. 이 프로토콜에는 진핵 숙주 세포의 물리적 파쇄와 정제된 박테리아를 분리하기 위한 차등 원심분리가 포함되었으며, 모든 숙주 세포 성분으로부터 박테리아를 완전히 정제하여 품질을 보장하기 위한 일련의 여과 단계가 포함되었습니다. 그리고 이어서 두 가지 염색법을 사용하여 박테리아의 생존력을 평가하는 BacLight live/dead assay 과정을 살펴보았습니다.

이제 정제된 박테리아를 다양한 응용 분야에 사용할 수 있으며, 여기에는 특정 시스템의 감염률을 높이기 위해 다른 배양 세포 시스템을 감염시키는 것이 포함됩니다. 또한 정제된 살아있는 박테리아를 사용하여 대사 연구 또는 기타 수많은 연구를 수행할 수 있습니다.