완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

이 절차의 전반적인 목표는 complete knockout serum replacement가 포함된 무피더 배지(feeder free medium)를 사용하여 인간 유도만능줄기세포를 무피더 배양에 적응시키고 유지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 gelt, TRX 또는 cell start로 코팅된 플레이트를 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 disc space를 사용하여 iPS를 MEF에서 무피더 배지로 계대 배양하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 IPS 세포를 지속적으로 feeder-free 상태로 유지하는 것입니다. 최종적으로, 다능성 마커를 이용한 면역 염색을 통해 meth 배양에서 발견되는 것과 유사한 세포 성장 및 줄기세포능(stemness)을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Life Technologies의 GIB co 사이트에 있는 Kate Wagner입니다.

기존 기술 대비 이 기술의 주요 장점은 전체 워크플로우에 걸쳐 knockout serum replacement를 사용함으로써 세포 배양 시간을 단축하고 일관성을 높일 수 있다는 점입니다. 현재 knockout 제품군은 인간 배아줄기세포, 마우스 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 위한 피더 기반, 피더 프리 및 제노 프리 조건의 모든 배지와 시약 리스트를 포함하고 있습니다. KSR은 유도, 성장, 증식, 동결 보존 및 분화의 초기 단계에 사용할 수 있습니다.

다음 비디오에서는 KSR을 사용하여 무피더 조건에서 세포를 적응시키고 계대 배양하는 방법을 보여드립니다. 무피더 조건에서 인간 유도만능줄기세포를 적응시키고 계대 배양하려면 Gel TRX 코팅 배양 접시가 필요합니다. 코팅 접시를 준비하기 하루 전, Gelt TRX 한 튜브를 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 천천히 해동하십시오. 다음 날, 99 mL의 기본 배지가 들어 있는 병에 Gel Rex 1 mL를 옮겨 해동된 Gelt TRX 튜브를 기본 배지로 1:100 비율로 희석하십시오. 용액을 부드럽게 혼합하십시오.

기초 배지로 knockout D-M-E-M-F 12 사용을 권장하지만, 다른 옵션은 프로토콜 본문을 참조하십시오. 각 배양 접시의 전체 표면을 gel Rex 용액으로 덮습니다. 60 millimeter 접시당 1.5 milliliters의 gel trek 용액을 추가합니다.

디쉬를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 추가 플레이트는 파라필름으로 감싸 냉장고에 최대 4주 동안 보관할 수 있습니다. 희석된 추가 gelt TRX는 분주하여 -20 °C에서 -80 °C에 보관할 수 있으나, 사용 전 반복적인 동결-해동 사이클은 피해야 합니다.

TRX가 코팅된 젤 접시를 클린 벤치나 층류 후드로 옮겨 실온에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 또한, 필요한 다른 모든 시약을 준비하고 모든 배지가 37°C에서 평형을 이루며 적절하게 가스 처리가 되었는지 확인합니다. 인간 IPC를 무피더 배지에 적응시키기 위한 1차 배양 단계입니다.

iPSC를 meth feeder 세포 상에서 70~80% 밀도로 배양합니다. 각 60 mm 배양 접시에서 배지를 흡입하여 제거하고, 1 mL의 적절한 양의 Dispa 용액을 첨가합니다. 이 상태로 접시를 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다.

각 배양 접시에서 dispa 용액을 흡입하여 제거하고, DPBS로 meth feeder 세포를 2~3회 부드럽게 세척합니다. 다음으로, 각 배양 접시에 적절한 양의 완전 혈청 대체 배지를 첨가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시 표면에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다.

각 디쉬의 세포 현탁액을 각각 별도의 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 각 배양 디쉬를 적당량의 완전 혈청 대체 배지로 헹구고, 헹굼 배지를 세포 현탁액이 들어 있는 15 milliliter 원추형 튜브에 추가합니다. 세포를 펠렛화하기 위해 15 milliliter 원추형 튜브를 상온에서 200 G로 5분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 튜브 바닥에서 세포 펠릿을 완전히 떼어냅니다. 원하는 분할 비율에 따라 적절한 양의 완전 혈청 대체, 피더 프리 배지를 첨가합니다.

그리고 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 작은 덩어리는 표면에 잘 부착되지 않으므로 세포 덩어리를 더 작은 크기로 분쇄하지 마십시오. 이전에 준비한 gel Rex 코팅 배양 접시에서 잔류 gel TRE 용액을 흡입하여 제거하고, 각 배양 접시에 적절한 양의 세포 현탁액을 천천히 첨가합니다.

배양 접시를 앞뒤 좌우로 여러 번 움직여 세포가 접시 표면에 고르게 분산되도록 합니다. 배양 접시를 37 °C, 4~6% CO2 가습 배양기에 조심스럽게 넣습니다. 이후 세포가 약 70~80% confluency에 도달할 때까지 매일 소모된 배지를 교체합니다.

완전 혈청 대체, 피더 프리 배지에서 배양된 인간 유도 만능 줄기세포가 70~80% 정도로 합쳐지면(confluent), 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 분화된 세포가 있다면 계대 배양 전에 제거하십시오. 피펫을 사용하여 60 millimeter 배양 접시에서 사용한 배지를 흡입하여 제거하고 세포를 두 번 헹구어 줍니다.

DPBS를 사용하여 미리 데워둔 디스크 기반 솔루션 1 mL를 배양 접시에 천천히 첨가합니다. 배양 접시를 흔들어 세포 표면 전체에 코팅합니다. 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다.

다음으로, 분해 용액을 흡입하여 제거하고 DPBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 후, 완전 혈청 대체액과 feeder-free 배지를 첨가하고 배양 접시 표면에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 배양 접시를 완전 혈청 대체액으로 두 번 헹굽니다.

분리되지 않은 세포들을 조심스럽게 씻어내기 위해 Feeder free medium을 부드럽게 분사합니다. 15 milliliter 튜브에 담긴 세포들과 함께 두 번의 세척 과정에서 사용한 배지를 모두 회수합니다. 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 실온에서 200 G로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 완전히 분리합니다. 완전 혈청 대체액(complete serum replacement)에 세포를 부드럽게 재부유시킵니다.

5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 Feeder free 배지를 넣습니다. 이때 Triton-X 등으로 처리(tritate)하지 마십시오. 원하는 분할 비율에 맞추어 세포를 새로운 60 mm Geltrex 코팅 디쉬로 옮깁니다.

배양 접시를 앞뒤 좌우로 여러 번 움직여 세포를 표면 전체에 분산시킵니다. 다음 날, 배양 접시를 공기 중 이산화탄소 농도가 4~6%인 습윤 상태의 37 °C 배양기에 넣습니다. 소모된 배지를 완전 혈청 대체제로 조심스럽게 교체합니다.

세포 잔해를 제거하기 위해 무혈청 배지를 공급합니다. 그 이후로는 매일 소모된 배지를 교체합니다. 이 위상차 현미경 이미지는 완전 혈청 대체제 및 피더 프리 배지를 사용하여 gelt TRX 코팅 배양 접시에서 배양된 인간 유도만능줄기세포를 보여줍니다.

IPC는 큰 핵과 적은 세포질이 특징인 인간 배아줄기세포와 유사한 형태를 보입니다. 면역 염색 결과, KnockOut Serum Replacement 배지와 성장 인자 칵테일을 사용하여 배양한 IPC가 다능성 마커인 OCT4 및 SSEA4를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 KnockOut Serum Replacement 및 피더 프리(feeder-free) 조건에서 IPC를 적응시키고 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.