Name: 완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 인간 iPS 세포를 피더-프리 배양으로 적응시키는 방법을 KSR-FF 배지를 사용하여. 이 기법은 줄기세포 연구의 재현성과 효율성을 향상시킵니다.

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참고 : 무균 문화 조건을 유지하기 위해서는이 프로토콜의 절차를 모두 무균 실험실 방법을 사용하여 수행하고 층류 후드 아래에 실시하고 있습니다. 시작하기 전에, 모든 미디어는 37 equilibrated되도록 ° C 적절하게 기름. Geltrex - 코팅 문화 요리를 준비 참고 : CELLstart 코팅 문화 요리의 사용을 위해 부록을 참조하십시오 <ol><li> 해동 한 천천히 2-8에서 Geltrex (1 ML) ° C의 튜브 및 넉아웃 D-MEM/F-12 99 ML에 1:100 그것을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다. 참고 : 일부 IPS 세포 라인은 최적의 성장을 위해 다른 Geltrex 희석이 필요할 수 있습니다. 대체 dilutions에 대한 부록을 참조하십시오. </li><li> Geltrex 솔루션 (35 - mm 요리 1 ML, 60 mm 요리 1.5 ML) 각 문화 요리의 전체 표면을 커버. </li><li> 건조를 방지하고 37에서 1 시간 동안 요리를 부화 Parafilm 각 접시 ° C. 봉쇄해 참고 : 최대 1 개월이 지점에서 4 ° C에서 Geltrex - 코팅 문화 요리를 저장할 수 있습니다. 밖으로 건조에서 Geltrex을 방지하기 위해 Parafilm 각 요리를 밀봉합니다. </li><li> 이전 사용하기 층류 후드에 Geltrex - 코팅 요리를 전송하고는 실온 (약 1 시간)에 평형 수 있습니다. </li></ol> 완료 녹아웃의 SR 공급기 - 무료 매체를 준비 <ol><li> 10 μg / ML 기본 FGF 솔루션 1 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장 최대 6 개월까지. <table border="0"><tbody><tr><td> 기본 FGF </td><td> 10 μg </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990 μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : BSA는 같은 농도에서 HSA 또는 넉아웃의 SR로 대체 수 있습니다. </li><li> 2 MG / ML Dispase 솔루션의 50 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. 4 솔루션 및 저장 ° C 최대 2 주 동안을 소독 필터. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 MG </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 전체 녹아웃의 SR 피더 - 무료 (KSR - FF) 매체 무균 아래 표에 나와있는 구성 요소를 결합 100 ML를 준비합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 마네 DMEM/F12 (Cat. 번호. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (Cat. 번호 35050-061) </td><td> 200 MM </td><td> 2 MM </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR (Cat. 번호. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR - GFC (Cat. 번호. A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. 번호. PHG0024) </td><td> 10 μg / ML </td><td> 20 NG / ML </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> 최대 일주일을 위해 당신은 2-8 ° C에서 KSR - FF 매체를 저장할 수 있습니다. </li><li> 온도와 가스의 전체 매체를 미리 equilibrating 바로 전에 무균 0.1 MM 최종 농도 2 메르 캅 토 에탄올의 필요한 볼륨 (55 MM 주식 농도)을 추가합니다. 예를 들어, KSR - FF 매체의 100 ML를 준비하는 것은 2 - 메르 캅 토 에탄올 (1:550 희석) 또는 55 mm의 182 μL를 추가, 2 - 메르 캅 토 에탄올이에 대한 1X 완료 매체에 추가 2-8 ° C에서 저장될 수 있습니다 최대 일주일. </li></ol> KSR - FF 중간에 iPSCs를 적응 <ol><li> 시작하기 전에, 후드에서 상온에 Geltrex 코팅 요리를 미리 평형. </li><li> 문화 MEF 피더 세포에서 iPSCs 그들은 70-80%의 합류 때까지. MEF 기반 문화 프로토콜에 대한 GIBCO 마우스 배아의 Fibroblast 수첩을 참조하십시오. 리&gt; </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 문화 요리에서 매체를 기음과 Dispase 솔루션의 적절한 금액을 추가합니다. 3~5분에 대해 37 ° C에서 요리를 품다. </li><li> 각 문화 선박에서 Dispase 솔루션을 기음과 D - PBS (2 3 회)로 부드럽게 MEF의 피더 세포를 씻어. </li><li> 각 문화 선박을 완료 마네의 SR 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 부드럽게 문화 선박의 표면에서 세포를 긁어 셀 스크레이퍼 또는 5 ML의 피펫을 사용합니다. 참고 : 하드 IP를 적응 세포 라인에 대한 대체 적응 프로토콜에 대한 부록을 참조하십시오, </li><li> 별도의 15 ML 원뿔 튜브에 각 문화 접시에서 세포 현탁액를 수집합니다. 전체 녹아웃의 SR 매체의 적절한 금액을 각 문화 선박 린스, 그리고 D - PBS는 세포 현탁액을 포함 15 ML 원뿔 튜브로 매체를 씻어 추가합니다. 하나의 세포로 세포 대단히 짧은 시간을 휴식하지 않는주의 </li><li> 펠렛 iPSCs 5 분 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. </li><li> iPSC 펠렛에서 뜨는을 대기음. 분할 비율 (표 1)에 따라 KSR - FF 매체의 적절한 금액 펠렛을 Resuspend. 작은 대단히 짧은 시간이 표면에 잘 부착하지 않기 때문에, 작은 크기로 휴대 대단히 짧은 시간을 아프게하지 마십시오. 참고 : iPSCs이 KSR - FF 매체에 iPSC MEF 문화 미디엄에서 직접 passaged 후에 우리는 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율을 권장합니다. 일반적으로 1시 3분과 1시 5분 사이의 분할 비율이 적합하지만, 1시 2분에서 passaging 것은 피더 무료 문화에 적응 할 때 필요한 세포의 높은 밀도를 보장합니다. </li><li> 이전 Geltrex 코팅 요리 iPSCs을 도금하는 사전 코팅 접시에서 잔여 Geltrex 솔루션을 기음, 천천히 각 문화 요리에 세포 현탁액의 적절한 금액을 추가합니다. 참고 : 도금하기 전에 요리를 씻어하지 않습니다. </li><li> 접시의 표면에 걸쳐 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리를 이동합니다. 부드럽게 공기 4-6%의 CO 2의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. KSR - FF로 보낸 매체 매일 교체합니다. </li></ol> KSR - FF을 사용하여 Passaging 인간의 IPS 세포 <ol start="13"><li> 세포 70-80% 합류하고 subcultured 준비가되었는지 확인하기 위해 현미경으로 전체 KSR - FF의 성장 인간 iPSCs을 준수. 1 그림을 참조하십시오. 참고 : 식민지가 너무 밀도 또는 너무 커질 경우, 증가 차별이 발생합니다. </li><li> 잘라와 문화를 passaging하기 전에 어떠한 차별 iPSC 식민지를 제거합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 선박에서 보낸 매체를 대기음하고, D - PBS로 두 번 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 문화 선박 (예, 60 mm 문화 요리 당 Dispase 솔루션 1 ML)로 사전 예열 Dispase 솔루션을 추가합니다. 코트 전체 세포 표면에 소용돌이 문화 우주선합니다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 문화 함선을 품어. </li><li> 인큐베이터에서 혈관을 제거 Dispase 솔루션을 기음, 부드럽게 D - PBS로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 세포 스크레이퍼를 사용하여 문화 접시의 표면에서 세포를 긁어 및 살균 15mL 원심 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 부드럽게 분리하지 않은 세포를 "해제 분사.", KSR - FF로 두 번 문화 접시를 씻어 수영장은 15mL 튜브에 세포와 매체를 씻어. </li><li> 상온에서 펠릿 세포 5 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 대기음하고 폐기. </li><li> 부드럽게 튜브가 완전히 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 이동시키다을 버려. </li><li> 부드럽게 5mL serological 피펫을 사용하여 사전 equilibrated KSR - FF의 세포를 resuspend. 씹다하지 마십시오. 참고 : 부드럽게 손상을 방지하기 위해 무력을 사용하지 않고 세포를 resuspend하는 단계에서 중요한 그것입니다. </li><li> 원하는 분할 비율에 신선한 60 mm Geltrex - 코팅 접시에 세포를 전송하고 표면을 가로질러 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리 이동합니다. </li><li> 의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 플레이스4~6%는 공중에 2 CO. </li><li> 그 다음날, 부드럽게 세포 파편을 제거하는 KSR - FF로 보낸 매체를 대체합니다. 이후 매일 지출 매체를 교체합니다. IPS 세포는 매일 그들로 (약 매 4~5일) 필요한 통로 관찰. Passaging은 세포가 70~80%의 합류에 도달했을 때 권장합니다. IPS 세포 cryopreservation 융해 들어, "완료 마네 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Cryopreserving 인적 IPS 세포 복구하기"라는 제목의 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 예상 결과 <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="현미경으로 세포 배양; 세포 성장 연구; 현미경 이미징; 생물학 연구." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 아래의 위상 콘트라스트 이미지는 완전 넉아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Geltrex - 코팅 문화 요리에 성장 iPSCs를 보여줍니다. iPSCs 큰 핵 및 세포질 부족한 특징 hESCs에 형태학 유사한 나타냅니다. (40x 확대) <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 35mm 디시 </td><td> 60mm 디시 </td><td> 100mm 디시 </td></tr><tr valign="top"><td> 완료 녹아웃 SR 미디어 </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex 솔루션 </td><td> 1 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 4-5 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 3-4 ML </td></tr><tr valign="top"><td> rinsing을위한 D - PBS </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. 추천 볼륨 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">부록을 참조하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 생명 기술에 의해 고용됩니다.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. no. 12660-012</td><td>참고: 대체 DMEM 제품 사용법은 부록 참조</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, 인간 재조합 단백질, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td><td>참고: 대체 bFGF 팩 크기는 부록 참조</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>Cat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. no. 17105-041</td><td>참고: 대체 계대 배양 방법은 부록 참조</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘이 없는 Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td></td><td>Cat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>멸균 조직 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C로 설정된 배양기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C로 설정된 항온수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 세롤로지컬 피펫 (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm 조직 배양 처리 디쉬</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 ips 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 passaging

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

인간과 마우스 섬유아 세포가 배아 줄기 세포에 상당히 유사 자질을 가진 1-3 IPS 세포를 생성하는 재설정 될 수 있다고 2006 년에 발견은 약물 발견, 세포 치료와 기초 연구를위한 pluripotent 세포의 중요한 새로운 소스를 만들었습니다. GIBCO 미디어 및 시약 년 동안 pluripotent 줄기 세포 연구의 선두에있다. DMEM가 마네 세럼 교체와 보충 마네는 배아 줄기 세포의 성장과 지금은 IPS 세포 배양 3-9위한 최고의 매체입니다. 이 황금 표준 미디어 시스템은 이제 마네의 SR 성장 팩터 칵테일의 추가와 함께 피더 무료 문화 사용할 수 있습니다. 전통적인 인간의 ES와 IPS의 세포 배양 방법은 마우 스나 인간 fibroblast 피더 레이어의 사용 또는 피더 - 에어컨 매체를 필요로합니다. 이러한 문화 방법은 규모에 노동 집약, 하드 있으며, 그것은 정의되지 않은 상황으로 인해 undifferentiated 허리의 세포를 유지하기 어렵습니다. Invitrogen은 여전히​​ 마네의 SR의 사용을 유지하면서 당신이 피더 - 무료로 전환 엉덩이 셀 문화를 쉽게하도록 마네의 SR 성장 팩터 칵테일을 개발했습니다.

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

2006년, 인간과 생쥐의 섬유아세포를 재프로그래밍하여 배아줄기세포와 매우 유사한 특성을 가진 iPS 세포 1-3를 생성할 수 있다는 발견은...

이 절차의 전반적인 목표는 complete knockout serum replacement가 포함된 무피더 배지(feeder free medium)를 사용하여 인간 유도만능줄기세포를 무피더 배양에 적응시키고 유지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 gelt, TRX 또는 cell start로 코팅된 플레이트를 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 disc space를 사용하여 iPS를 MEF에서 무피더 배지로 계대 배양하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 IPS 세포를 지속적으로 feeder-free 상태로 유지하는 것입니다. 최종적으로, 다능성 마커를 이용한 면역 염색을 통해 meth 배양에서 발견되는 것과 유사한 세포 성장 및 줄기세포능(stemness)을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Life Technologies의 GIB co 사이트에 있는 Kate Wagner입니다.기존 기술 대비 이 기술의 주요 장점은 전체 워크플로우에 걸쳐 knockout serum replacement를 사용함으로써 세포 배양 시간을 단축하고 일관성을 높일 수 있다는 점입니다. 현재 knockout 제품군은 인간 배아줄기세포, 마우스 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포를 위한 피더 기반, 피더 프리 및 제노 프리 조건의 모든 배지와 시약 리스트를 포함하고 있습니다. KSR은 유도, 성장, 증식, 동결 보존 및 분화의 초기 단계에 사용할 수 있습니다.다음 비디오에서는 KSR을 사용하여 무피더 조건에서 세포를 적응시키고 계대 배양하는 방법을 보여드립니다. 무피더 조건에서 인간 유도만능줄기세포를 적응시키고 계대 배양하려면 Gel TRX 코팅 배양 접시가 필요합니다. 코팅 접시를 준비하기 하루 전, Gelt TRX 한 튜브를 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 천천히 해동하십시오. 다음 날, 99 mL의 기본 배지가 들어 있는 병에 Gel Rex 1 mL를 옮겨 해동된 Gelt TRX 튜브를 기본 배지로 1:100 비율로 희석하십시오. 용액을 부드럽게 혼합하십시오.기초 배지로 knockout D-M-E-M-F 12 사용을 권장하지만, 다른 옵션은 프로토콜 본문을 참조하십시오. 각 배양 접시의 전체 표면을 gel Rex 용액으로 덮습니다. 60 millimeter 접시당 1.5 milliliters의 gel trek 용액을 추가합니다.디쉬를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 추가 플레이트는 파라필름으로 감싸 냉장고에 최대 4주 동안 보관할 수 있습니다. 희석된 추가 gelt TRX는 분주하여 -20 °C에서 -80 °C에 보관할 수 있으나, 사용 전 반복적인 동결-해동 사이클은 피해야 합니다.TRX가 코팅된 젤 접시를 클린 벤치나 층류 후드로 옮겨 실온에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 또한, 필요한 다른 모든 시약을 준비하고 모든 배지가 37°C에서 평형을 이루며 적절하게 가스 처리가 되었는지 확인합니다. 인간 IPC를 무피더 배지에 적응시키기 위한 1차 배양 단계입니다.iPSC를 meth feeder 세포 상에서 70~80% 밀도로 배양합니다. 각 60 mm 배양 접시에서 배지를 흡입하여 제거하고, 1 mL의 적절한 양의 Dispa 용액을 첨가합니다. 이 상태로 접시를 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다.각 배양 접시에서 dispa 용액을 흡입하여 제거하고, DPBS로 meth feeder 세포를 2~3회 부드럽게 세척합니다. 다음으로, 각 배양 접시에 적절한 양의 완전 혈청 대체 배지를 첨가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시 표면에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다.각 디쉬의 세포 현탁액을 각각 별도의 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 각 배양 디쉬를 적당량의 완전 혈청 대체 배지로 헹구고, 헹굼 배지를 세포 현탁액이 들어 있는 15 milliliter 원추형 튜브에 추가합니다. 세포를 펠렛화하기 위해 15 milliliter 원추형 튜브를 상온에서 200 G로 5분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후, 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 튜브 바닥에서 세포 펠릿을 완전히 떼어냅니다. 원하는 분할 비율에 따라 적절한 양의 완전 혈청 대체, 피더 프리 배지를 첨가합니다.그리고 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 작은 덩어리는 표면에 잘 부착되지 않으므로 세포 덩어리를 더 작은 크기로 분쇄하지 마십시오. 이전에 준비한 gel Rex 코팅 배양 접시에서 잔류 gel TRE 용액을 흡입하여 제거하고, 각 배양 접시에 적절한 양의 세포 현탁액을 천천히 첨가합니다.배양 접시를 앞뒤 좌우로 여러 번 움직여 세포가 접시 표면에 고르게 분산되도록 합니다. 배양 접시를 37 °C, 4~6% CO2 가습 배양기에 조심스럽게 넣습니다. 이후 세포가 약 70~80% confluency에 도달할 때까지 매일 소모된 배지를 교체합니다.완전 혈청 대체, 피더 프리 배지에서 배양된 인간 유도 만능 줄기세포가 70~80% 정도로 합쳐지면(confluent), 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 분화된 세포가 있다면 계대 배양 전에 제거하십시오. 피펫을 사용하여 60 millimeter 배양 접시에서 사용한 배지를 흡입하여 제거하고 세포를 두 번 헹구어 줍니다.DPBS를 사용하여 미리 데워둔 디스크 기반 솔루션 1 mL를 배양 접시에 천천히 첨가합니다. 배양 접시를 흔들어 세포 표면 전체에 코팅합니다. 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다.다음으로, 분해 용액을 흡입하여 제거하고 DPBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 후, 완전 혈청 대체액과 feeder-free 배지를 첨가하고 배양 접시 표면에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 배양 접시를 완전 혈청 대체액으로 두 번 헹굽니다.분리되지 않은 세포들을 조심스럽게 씻어내기 위해 Feeder free medium을 부드럽게 분사합니다. 15 milliliter 튜브에 담긴 세포들과 함께 두 번의 세척 과정에서 사용한 배지를 모두 회수합니다. 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 실온에서 200 G로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 완전히 분리합니다. 완전 혈청 대체액(complete serum replacement)에 세포를 부드럽게 재부유시킵니다.5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 Feeder free 배지를 넣습니다. 이때 Triton-X 등으로 처리(tritate)하지 마십시오. 원하는 분할 비율에 맞추어 세포를 새로운 60 mm Geltrex 코팅 디쉬로 옮깁니다.배양 접시를 앞뒤 좌우로 여러 번 움직여 세포를 표면 전체에 분산시킵니다. 다음 날, 배양 접시를 공기 중 이산화탄소 농도가 4~6%인 습윤 상태의 37 °C 배양기에 넣습니다. 소모된 배지를 완전 혈청 대체제로 조심스럽게 교체합니다.세포 잔해를 제거하기 위해 무혈청 배지를 공급합니다. 그 이후로는 매일 소모된 배지를 교체합니다. 이 위상차 현미경 이미지는 완전 혈청 대체제 및 피더 프리 배지를 사용하여 gelt TRX 코팅 배양 접시에서 배양된 인간 유도만능줄기세포를 보여줍니다.IPC는 큰 핵과 적은 세포질이 특징인 인간 배아줄기세포와 유사한 형태를 보입니다. 면역 염색 결과, KnockOut Serum Replacement 배지와 성장 인자 칵테일을 사용하여 배양한 IPC가 다능성 마커인 OCT4 및 SSEA4를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 KnockOut Serum Replacement 및 피더 프리(feeder-free) 조건에서 IPC를 적응시키고 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는...

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

이 프로토콜은 혈청에서 파생 마우스 배아 줄기 세포의 수집 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)하는 방법을 제공한다 (소 태아 혈청, FBS) - 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 셀에 대한 - 무료 조건 - 무료 방법. 이는 노화 및 노화 관련 질환의 치료에 적용될 수있다.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

유도만능줄기세포(iPSC)의 유지를 확인하기 위한 정기적인 특성화는 이러한 세포가 다른 응용 분야에 사용되기 전에 중요한 단계입니다. 여기에서는 면역세포화학을 통해 쉽고 일상적인 특성 분석을 가능하게 하도록 특별히 설계된 인간 iPSC의 소규모 증식 방법에 대해 설명합니다.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 효소적 또는 기계적 패시징과 관련된 한계를 피하기 위해 EDTA 매개 탈유착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 피더 세포층에 유지되는 hESC 또는 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다.

에틸렌디아민테트라아세트산 매개 탈접착에 의한 공급세포에서 인간 만능 줄기세포의 신속하고 비용 효율적이며 효소 없는 패스페이징

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

여기에서는 다양한 악성 종양에 대한 사멸을 개선하여 인간 iPSC 유래 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해 세포를 분화하고 확장하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 자연살해(NK)에 최적화된 iPSC 유래 CAR-NK 세포의 분화 및 증식과 다양한 종양 세포주에 대한 항종양 활성의 측정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

학습하세요 인간 iPS 세포를 피더-프리 배양으로 적응시키는 방법을 KSR-FF 배지를 사용하여. 이 기법은 줄기세포 연구의 재현성과 효율성을 향상시킵니다.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

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