Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

이 프로시저의 전반적인 목표는 피더 기반 또는 피더 프리 배양 조건에서 IPS 세포를 동결 보존하고 회복시키는 것입니다. 이는 우선 평상시와 동일한 방식으로 IPC를 패키징하는 것으로 시작하여 수행됩니다. 프로시저의 두 번째 단계는 세포를 무혈청 동결 배지로 옮기는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 평상시와 동일하게 동결 보존하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 해동하고 유지 배양을 시작하는 것입니다. 결과적으로, 혈청이 없는 동결 배지를 통한 iPS 세포의 성공적인 동결 및 해동은 해동 후의 건강한 형태와 회복을 통해 확인할 수 있습니다.

안녕하세요, Life Technologies GCO 사이트의 Kate Wagner입니다. IPC는 동결 및 온도에 매우 민감하기 때문에 이 프로토콜의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 작업 과정 전반에 걸쳐 knockout serum replacement를 사용할 수 있어 과정이 더 간편하다는 점입니다.

현재 KSR 제품군은 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포의 피더 기반, 피더 프리 및 제노 프리 배양을 위한 모든 배지와 시약 목록을 포함하고 있습니다. KSR은 유도, 성장, 냉동 보존, 증식 및 분화의 초기 단계에 사용될 수 있습니다. 다음 영상에서는 피더 프리 환경에서 KSR을 사용하여 세포를 해동하고 동결하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 절차를 시작하려면, 먼저 적절한 양의 완전 피더 프리 배지를 항온수조에서 37 °C로 가온합니다. 60 mm 디쉬인 배양 용기에서 사용한 배지를 흡입하여 제거합니다. 이 경우, 인간 유도만능줄기세포를 DPBS로 두 번 세척합니다.

그런 다음 디쉬에 dispa 1 mL를 첨가합니다. 디쉬를 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 그 후, dispa 용액을 흡입 제거하고 DPBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.

다음으로, 디쉬를 덮을 수 있도록 완전 무피더 배지(complete feeder free medium)를 추가하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어낸 뒤 멸균된 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 완전 무피더 배지로 디쉬를 헹구어 분리되지 않은 세포들을 부드럽게 씻어냅니다. 이 세척액을 세포가 들어 있는 동일한 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.

배지로 디쉬를 다시 한번 헹군 후, 세포가 포함된 해당 세척액을 회수하여 상온에서 1000 RPM으로 3분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리가 끝나면 세포 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 완전히 분리시킵니다.

그 다음 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 동결 배지 A 1 mL를 첨가하고, 피펫팅을 부드럽게 반복하여 세포를 재현탁합니다. 세포 덩어리가 균일하게 현탁되면, 세포 현탁액을 부드럽게 회전시켜 혼합하면서 동결 배지 B 1 mL를 튜브에 한 방울씩 첨가합니다. 세포 현탁액 1 mL씩을 각 크라이오 바이알에 나누어 담고, 이소프로판올 챔버 내 -80 °C에서 하룻밤 동안 세포를 동결합니다.

다음 날, 세포가 담긴 바이알을 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관합니다. 냉동된 세포 바이알을 37 °C 항온수조에 약 3~4분 동안 넣어 바이알 안에 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 빠르게 해동합니다. 바이알을 항온수조에서 꺼낸 후 70% isopropanol을 분사하여 오염을 제거하고, 5 mL 피펫을 사용하여 바이알의 전체 내용물을 15 mL 원추형 튜브에 무균적으로 옮깁니다.

다음 단계는 실험 과정 중 가장 까다로운 부분일 수 있습니다. 피더 프리 배지를 세포에 천천히 그리고 주의해서 첨가해야 합니다. 삼투압 쇼크를 줄이기 위해, 15 mL 원추형 튜브에 들어 있는 세포에 complete feeder free medium 4 mL를 한 방울씩 천천히 첨가하십시오.

배지를 추가하는 동안 튜브를 부드럽게 앞뒤로 움직여 세포를 혼합하십시오. 이렇게 하면 세포의 삼투압 충격을 줄일 수 있습니다. Complete feeder free medium은 meth conditioned medium이 포함된 knockout serum replacement 또는 feeder 사용을 위한 knockout serum replacement medium으로 대체할 수 있으며, 배지 조제 지침은 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.

배지 4 mL를 모두 첨가한 후, 실온에서 1000 RPM으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 세포 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 세포 펠릿을 4 mL의 완전 무피더 배지(complete feeder free medium)에 부드럽게 재현탁합니다.

5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 geltrac로 코팅된 60 mm 배양 접시에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 배양 접시를 공기 중 4~6% 이산화탄소가 포함된 습윤 환경의 36~38 °C 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 고르게 분포되도록 배양 접시를 남북 및 동서 방향으로 조심스럽게 회전시킵니다.

해동 24시간 후, 디쉬의 배지를 신선한 배지로 교체합니다. 이후 세포가 약 70~80% 밀도로 증식(confluent)할 때까지 매일 소모된 배지를 교체합니다.

이 대조 이미지는 완전 혈청 대체제 및 피더 프리 배지를 사용하여 gelt TRX 코팅 배양 접시에서 배양된 인간 유도 만능 줄기세포를 보여줍니다. iPSC는 큰 핵과 적은 세포질을 특징으로 하며, 인간 배아 줄기세포와 유사한 형태를 나타냅니다. 이는 해동 및 혈청 대체제 제거 후의 세포 예시입니다.

gelt TrackX 상의 feeder-free 배지가 여기에 표시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 세포 콜로니의 크기를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이는 동결 보존 시 세포 회복률을 향상시킵니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.