Name: Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 학습하세요 인간 유도만능줄기세포(iPS)의 동결보존 및 해동 복구 방법을 KnockOut SR 배지를 사용하여. 이 시각적 프로토콜은 세포 생존율 유지와 건강한 형태학 회복을 보장합니다.

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참고 : 무균 문화 조건을 유지하기 위해서는이 프로토콜의 절차를 모두 무균 실험실 방법을 사용하여 수행하고 층류 후드 아래에 실시하고 있습니다. 시작하기 전에, 모든 미디어는 37 equilibrated되도록 ° C 적절하게 기름. Geltrex - 코팅 문화 요리를 준비 참고 : CELLstart 코팅 문화 요리의 사용을 위해 부록을 참조하십시오. <ol><li> 해동 한 천천히 2-8에서 Geltrex (1 ML) ° C의 튜브 및 넉아웃 D-MEM/F-12 99 ML에 1:100 그것을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다. 참고 : 일부 IPS 세포 라인은 최적의 성장을 위해 다른 Geltrex 희석이 필요할 수 있습니다. 대체 dilutions에 대한 부록을 참조하십시오. </li><li> Geltrex 솔루션 (35 - mm 요리 1 ML, 60 mm 요리 1.5 ML) 각 문화 요리의 전체 표면을 커버. </li><li> 건조를 방지하고 37에서 1 시간 동안 요리를 부화 Parafilm 각 접시 ° C. 봉쇄해 참고 : 최대 1 개월이 지점에서 4 ° C에서 Geltrex - 코팅 문화 요리를 저장할 수 있습니다. 밖으로 건조에서 Geltrex을 방지하기 위해 Parafilm 각 요리를 밀봉합니다. </li><li> 이전 사용하기 층류 후드에 Geltrex - 코팅 요리를 전송하고는 실온 (약 1 시간)에 평형 수 있습니다. </li></ol> 완료 녹아웃의 SR 공급기 - 무료 매체를 준비 <ol><li> 10 μg / ML 기본 FGF 솔루션 1 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장 최대 6 개월까지. <table border="0"><tbody><tr><td> 기본 FGF </td><td> 10 μg </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : BSA는 같은 농도에서 HSA 또는 넉아웃의 SR로 대체 수 있습니다. </li><li> 2 MG / ML Dispase 솔루션의 50 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. 4 솔루션 및 저장 ° C 최대 2 주 동안을 소독 필터. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 MG </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 전체 녹아웃의 SR 100 ML를 준비하는 피더 - 무료 (KSR - FF)는 무균 아래 표에 나와있는 구성 요소를 결합. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 마네 DMEM/F12 (Cat. 번호. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (Cat. 번호 35050-061) </td><td> 200 MM </td><td> 2 MM </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR (Cat. 번호. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR - GFC (Cat. 번호. A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. 번호. PHG0024). </td><td> 10 μg / ML </td><td> 20 NG / ML </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> 최대 일주일을 위해 당신은 2-8 ° C에서 KSR - FF 매체를 저장할 수 있습니다. </li><li> 온도와 가스의 전체 매체를 미리 equilibrating 바로 전에 무균 0.1 MM 최종 농도 2 메르 캅 토 에탄올의 필요한 볼륨 (55 MM 주식 농도)을 추가합니다. 예를 들어, KSR - F 100 ML를 준비하는F 매체 2 - 메르 캅 토 에탄올 (1:550 희석) 또는 55 mm의 182 μL를 추가, 2 - 메르 캅 토 에탄올은 1X 완료 매체에 추가 및 최대 일주일 동안 2-8 ° C에 저장된 수 있습니다. </li></ol> 냉동 / Cryopreservation 중간 준비 cryopreservation 매체는 두 미디어로 구성되어, 냉동 매체는 A와 동결 매체 B.는 그들은 다른 시간에 세포에 추가되고 남아 분리해야합니다. 그들은 각 Cryopreservation 매체의 전체 볼륨의 50 %가 필요합니다. 필요한 Cryopreservation 매체의 총 부피는 냉동으로 각 유리병 1 ML입니다. hESC의 90% 합류 60mm 요리는 cryopreservation 미디어에 hESC 은행이 유리병하는 데 사용할 수 있습니다. 없더군요을 보장하기 위해 추가 2 5mL 각 냉동 매체의 충분한 볼륨을 준비합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 냉동 중간 (최종 볼륨의 50 %) </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50 % KSR </td></tr><tr><td> 냉동 중간 B (최종 부피의 50 %) </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> 예 : 이 세포의 20 튜브를 동결하는 경우 Cryopreservation 매체 20mL가 필요합니다. 24mL Cryopreservation 매체의 총 없더군요에 대한 4mL를 추가합니다. 당신은 냉동 매체의 12mL가 필요합니다 즉 A (24mL의 50 %)과 동결 매체 B (24mL의 50 %)의 12mL. <table border="1"><tbody><tr><td> 냉동 중간 (12 ML) : </td><td> 6 ML DMEM/F12 </td><td> 6 ML KSR </td></tr><tr><td> 냉동 중간 B (12 ML) : </td><td> 9.6 ML DMEM/F12 </td><td> 2.4 ML DMSO </td></tr></tbody></table> Cryopreservation 매체의 최종 구성 65 % DMEM/F12, 25 % KSR하고, 10 % DMSO입니다. Cryopreserving iPSCs <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 테이블 1below을 참조하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 선박에서 보낸 매체를 대기음하고, D - PBS로 두 번 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 문화 선박 (예, 60 mm 문화 요리 당 Dispase 솔루션 1 ML)로 사전 예열 Dispase 솔루션을 추가합니다. 코트 전체 세포 표면에 소용돌이 문화 우주선합니다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 문화 함선을 품어. </li><li> 인큐베이터에서 혈관을 제거 Dispase 솔루션을 기음, 부드럽게 D - PBS로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 세포 스크레이퍼를 사용하여 문화 접시의 표면에서 세포를 긁어 및 살균 15mL 원심 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 부드럽게 분리하지 않은 세포를 &quot;해제 분사.&quot;, KSR - FF로 두 번 문화 접시를 씻어 수영장은 15mL 튜브에 세포와 매체를 씻어. </li><li> 상온에서 펠릿 세포 5 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 대기음하고 폐기. </li><li> cryovials의 충분한 수량을 준비합니다. 세포 DMSO와 연락되면, 그들은 aliquoted 후 2-3 분 이내에 냉동해야합니다. </li><li> 천천히 완벽하게 [부드럽게까지 pipetting 아래 5 ML serological 피펫을 사용하여 소리] 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 이동시키다 및 냉동 매체 A.에있는 세포를 다시 정지, 튜브를 버려. 부드럽게 혼합에 세포 현탁액을 소용돌이 치는 동안 대단히 짧은 시간의 균일한 현탁액에 따라, 한 방울 현명한 방식으로, 그것 동결 매체 B의 같은 볼륨을 추가합니다. 참고 :이 시점에서, 세포가 DMSO와 연락하고, 작업이 효율적으로 수행되어야합니다. 세포 DMSO와 연락되면, 그들은 aliquoted 후 2-3 분 이내에 냉동해야합니다. </li><li> 각 cryovial에 세포 현탁액의 나누어지는 1 ML. </li><li> 신속 [급속 동결] 미스터 프로 스티에 튜브를 넣고 ° C -80 하룻밤에 전송할 수 있습니다. </li><li> -80에서 하룻밤 보관하면 ° C는 장기 저장을위한 액체 질소 탱크에 세포를 전송합니다. </li></ol> iPSC의 유리 해동 및 세포 복구 참고 : KSR - FF는 KSR 함유 MEF - 시설 중간, 또는 피더와 함께 사용하기위한 KSR 매체로 대체될 수 있습니다. 미디어 준비하기위한 지침은 부록을 참조하십시오. 50 ML 튜브에 KSR - FF 매체 사전 따뜻한 10mL. <ol><li> 당신을 도금하기 전에 실내 온도에 Geltrex - 코팅 요리의 적절한 수량 평형과 요리로부터 액체를 기음R 세포. </li><li> 조심스럽게 hESC (또는 iPSC) 액체 질소 저장 탱크에서 약병을 제거하십시오. </li><li> 단지 작은 냉동 덩어리가 유리병에 남아 때까지 빠르게, 37 ° C의 물을 욕조에 세포의 냉동 병을 해동. </li><li> 그것을 오염을 제거하다하고 멸균 조직 문화 후드로 전송하는 이소프로판올 70%로 병을 스프레이. </li><li> 무균 5 ML의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 관에 유리병의 전체 내용을 전송합니다. </li><li> KSR - FF 1 ML로 병을 씻어 15 ML의 원심 관에 이것을 추가합니다. </li><li> 천천히, KSR - FF 4 ML 15mL 원뿔 튜브에 세포 드롭 현명한를 추가합니다. 미디어를 추가하는 동안 부드럽게 세포를 섞어 앞뒤로 튜브를 이동합니다. (이것은 세포 삼투 충격을 줄일 수). </li><li> 15 ML 튜브 실온에서 2 분 동안 1000rpm (200 X G)의 세포 현탁액을 원심 분리기로. </li><li> 조심스럽게 기음과 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 사전 예열 KSR - FF의 세포 펠릿 (예 4mL/60 mm 요리) 5 ML 피펫을 사용하고 세포 펠릿가 완전히 분산 때까지 부드럽게 세포를 피펫 아래 다시 일시 중지합니다. 생존 적은 70 %면 이상 70 % 생존이 예상된다, 그러나, 그것은 합류에 도달하는 세포를 위해 더 많은 시간이 소요될 수 있습니다. </li><li> 같은 피펫을 사용하여 세포 현탁액 실온에 미리 equilibrated Geltrex - 코팅 문화 요리 드롭 현명한를 전송합니다. </li><li> 공기 4-6%의 CO 2의 humidified 분위기, 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. 고르게 세포를 배포 서부 패턴 남쪽, 동쪽 북쪽 신중하게 소용돌이 모양의 용기. </li><li> 부드럽게 문화 접시를 유체 - 변경 24 시간 이후 해동와 세포 부스러기를 제거하고 요리는 약 70-80% 합류하기 전까지 신선한 영양소를 제공하기 위해 이후 매일.이 귀하의 IPS 세포의 지속적인 문화와 passaging 들어, &quot;완료 마네 세럼 교체 사용하는 인간의 IPS 세포 피더 - 무료 문화 Passaging 피더를 무료 매체&quot;라는 제목의 프로토콜을 참조하십시오 </li></ol> 예상 결과 세포 전에 cryopreservation에 합류 약 70~80%되어야합니다. 최대 컬링과 식민지 마진 따라 식민지의 접이식의 소화 결과를 Dispase. 세포를 수확 후 그들은 cryopreservation 미디어의 작은 대단히 짧은 시간으로 냉동 있습니다. 유리병가 해동되면 세포가 회복 작은 대단히 짧은 시간으로 미리 코팅 요리에 첨부합니다. 그들은 급속하게 5-6일에 합류 접시에 선도적인 성장. 표 1 - 추천 볼륨 <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 35mm 디시 </td><td> 60mm 디시 </td><td> 100mm 디시 </td></tr><tr><td> 완료 녹아웃 SR 미디어 </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> Geltrex 솔루션 </td><td> 1 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 4-5 ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 3-4 ML </td></tr><tr><td> rinsing을위한 D - PBS </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr></tbody></table> 주십시오 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">부록을 보시려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산하는 생명 기술에 의해 고용됩니다.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>참고: 대체 DMEM 제품 GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) 사용법은 부록을 참조하십시오</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, 인간 재조합 단백질, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>참고: 대체 bFGF 팩 크기는 부록을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>참고: 대체 계대 배양 방법은 부록을 참조하십시오</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘이 없는 Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>멸균 조직 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C로 설정된 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드(Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C로 설정된 항온수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 세롤로지컬 피펫 (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm 조직 배양 처리 디쉬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 저장 탱크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올 동결 컨테이너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 냉동 보관 바이알(Cryovials)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving와 인간 ips 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

인간과 마우스 섬유아 세포가 배아 줄기 세포에 상당히 유사 자질을 가진 1-3 IPS 세포를 생성하는 재설정 될 수 있다고 2006 년에 발견은 약물 발견, 세포 치료와 기초 연구를위한 pluripotent 세포의 중요한 새로운 소스를 만들었습니다. GIBCO 미디어 및 시약 년 동안 pluripotent 줄기 세포 연구의 선두에있다. DMEM가 마네 세럼 교체와 보충 마네는 배아 줄기 세포의 성장과 지금은 IPS 세포 배양 3-9위한 최고의 매체입니다. 이 황금 표준 미디어 시스템은 이제 마네의 SR 성장 팩터 칵테일의 추가와 함께 피더 무료 문화 사용할 수 있습니다. 전통적인 인간의 ES와 IPS의 세포 배양 방법은 마우 스나 인간 fibroblast 피더 레이어의 사용 또는 피더 - 에어컨 매체를 필요로합니다. 이러한 문화 방법은 규모에 노동 집약, 하드 있으며, 그것은 정의되지 않은 상황으로 인해 undifferentiated 허리의 세포를 유지하기 어렵습니다. Invitrogen은 여전히​​ 마네의 SR의 사용을 유지하면서 쉽게 전환하여 엉덩이와 hES 세포 문화를 피더없는 수 있도록 마네의 SR 성장 팩터 칵테일을 개발했습니다.

이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

2006년에 인간 및 마우스 섬유아세포를 재프로그래밍하여 배아 줄기세포와 매우 유사한 특성을 가진 iPS 세포 1-3를 생성할 수 있다는 사실이 발견되었으며...

이 프로시저의 전반적인 목표는 피더 기반 또는 피더 프리 배양 조건에서 IPS 세포를 동결 보존하고 회복시키는 것입니다. 이는 우선 평상시와 동일한 방식으로 IPC를 패키징하는 것으로 시작하여 수행됩니다. 프로시저의 두 번째 단계는 세포를 무혈청 동결 배지로 옮기는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 평상시와 동일하게 동결 보존하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 해동하고 유지 배양을 시작하는 것입니다. 결과적으로, 혈청이 없는 동결 배지를 통한 iPS 세포의 성공적인 동결 및 해동은 해동 후의 건강한 형태와 회복을 통해 확인할 수 있습니다.안녕하세요, Life Technologies GCO 사이트의 Kate Wagner입니다. IPC는 동결 및 온도에 매우 민감하기 때문에 이 프로토콜의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 작업 과정 전반에 걸쳐 knockout serum replacement를 사용할 수 있어 과정이 더 간편하다는 점입니다.현재 KSR 제품군은 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포의 피더 기반, 피더 프리 및 제노 프리 배양을 위한 모든 배지와 시약 목록을 포함하고 있습니다. KSR은 유도, 성장, 냉동 보존, 증식 및 분화의 초기 단계에 사용될 수 있습니다. 다음 영상에서는 피더 프리 환경에서 KSR을 사용하여 세포를 해동하고 동결하는 방법을 보여드리겠습니다.본 절차를 시작하려면, 먼저 적절한 양의 완전 피더 프리 배지를 항온수조에서 37 °C로 가온합니다. 60 mm 디쉬인 배양 용기에서 사용한 배지를 흡입하여 제거합니다. 이 경우, 인간 유도만능줄기세포를 DPBS로 두 번 세척합니다.그런 다음 디쉬에 dispa 1 mL를 첨가합니다. 디쉬를 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 그 후, dispa 용액을 흡입 제거하고 DPBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.다음으로, 디쉬를 덮을 수 있도록 완전 무피더 배지(complete feeder free medium)를 추가하고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어낸 뒤 멸균된 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 완전 무피더 배지로 디쉬를 헹구어 분리되지 않은 세포들을 부드럽게 씻어냅니다. 이 세척액을 세포가 들어 있는 동일한 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.배지로 디쉬를 다시 한번 헹군 후, 세포가 포함된 해당 세척액을 회수하여 상온에서 1000 RPM으로 3분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리가 끝나면 세포 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 완전히 분리시킵니다.그 다음 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 동결 배지 A 1 mL를 첨가하고, 피펫팅을 부드럽게 반복하여 세포를 재현탁합니다. 세포 덩어리가 균일하게 현탁되면, 세포 현탁액을 부드럽게 회전시켜 혼합하면서 동결 배지 B 1 mL를 튜브에 한 방울씩 첨가합니다. 세포 현탁액 1 mL씩을 각 크라이오 바이알에 나누어 담고, 이소프로판올 챔버 내 -80 °C에서 하룻밤 동안 세포를 동결합니다.다음 날, 세포가 담긴 바이알을 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관합니다. 냉동된 세포 바이알을 37 °C 항온수조에 약 3~4분 동안 넣어 바이알 안에 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 빠르게 해동합니다. 바이알을 항온수조에서 꺼낸 후 70% isopropanol을 분사하여 오염을 제거하고, 5 mL 피펫을 사용하여 바이알의 전체 내용물을 15 mL 원추형 튜브에 무균적으로 옮깁니다.다음 단계는 실험 과정 중 가장 까다로운 부분일 수 있습니다. 피더 프리 배지를 세포에 천천히 그리고 주의해서 첨가해야 합니다. 삼투압 쇼크를 줄이기 위해, 15 mL 원추형 튜브에 들어 있는 세포에 complete feeder free medium 4 mL를 한 방울씩 천천히 첨가하십시오.배지를 추가하는 동안 튜브를 부드럽게 앞뒤로 움직여 세포를 혼합하십시오. 이렇게 하면 세포의 삼투압 충격을 줄일 수 있습니다. Complete feeder free medium은 meth conditioned medium이 포함된 knockout serum replacement 또는 feeder 사용을 위한 knockout serum replacement medium으로 대체할 수 있으며, 배지 조제 지침은 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.배지 4 mL를 모두 첨가한 후, 실온에서 1000 RPM으로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 세포 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 세포 펠릿을 4 mL의 완전 무피더 배지(complete feeder free medium)에 부드럽게 재현탁합니다.5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 geltrac로 코팅된 60 mm 배양 접시에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 배양 접시를 공기 중 4~6% 이산화탄소가 포함된 습윤 환경의 36~38 °C 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 고르게 분포되도록 배양 접시를 남북 및 동서 방향으로 조심스럽게 회전시킵니다.해동 24시간 후, 디쉬의 배지를 신선한 배지로 교체합니다. 이후 세포가 약 70~80% 밀도로 증식(confluent)할 때까지 매일 소모된 배지를 교체합니다.이 대조 이미지는 완전 혈청 대체제 및 피더 프리 배지를 사용하여 gelt TRX 코팅 배양 접시에서 배양된 인간 유도 만능 줄기세포를 보여줍니다. iPSC는 큰 핵과 적은 세포질을 특징으로 하며, 인간 배아 줄기세포와 유사한 형태를 나타냅니다. 이는 해동 및 혈청 대체제 제거 후의 세포 예시입니다.gelt TrackX 상의 feeder-free 배지가 여기에 표시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 세포 콜로니의 크기를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이는 동결 보존 시 세포 회복률을 향상시킵니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

유도만능줄기세포(iPSC)의 유지를 확인하기 위한 정기적인 특성화는 이러한 세포가 다른 응용 분야에 사용되기 전에 중요한 단계입니다. 여기에서는 면역세포화학을 통해 쉽고 일상적인 특성 분석을 가능하게 하도록 특별히 설계된 인간 iPSC의 소규모 증식 방법에 대해 설명합니다.

일상적인 면역 세포 화학 특성에 대한 혈청이없는 조건에서 인간 iPSCs의 소규모 전파

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

원시 생식 세포 (PGCs)는 정자와 모두의 일반적인 선구자. 인간의 배아 PGCs cytokines의 상호 작용을 통해 만능 epiblast 셀에서 지정 됩니다. 여기, 우리가 유도 액 pluripotency 유도 만능 줄기 세포에서 embryoid 몸 표면에 PGCs을 닮은 인간의 세포 transcriptomally의 13 일 프로토콜을 설명 합니다.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 연구는 인간 줄기세포 유래 망막 색소 상피 세포의 효율적인 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 최적 단계에서 동결 보존

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

여기에서는 다양한 악성 종양에 대한 사멸을 개선하여 인간 iPSC 유래 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해 세포를 분화하고 확장하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 자연살해(NK)에 최적화된 iPSC 유래 CAR-NK 세포의 분화 및 증식과 다양한 종양 세포주에 대한 항종양 활성의 측정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

학습하세요 인간 유도만능줄기세포(iPS)의 동결보존 및 해동 복구 방법을 KnockOut SR 배지를 사용하여. 이 시각적 프로토콜은 세포 생존율 유지와 건강한 형태학 회복을 보장합니다.

Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

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