July 15th, 2010
이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 공급장치 기반 또는 공급자가 없는 배양 조건에서 IPS 세포를 동결 보존 및 복구하는 것입니다. 이것은 일반적으로 하는 것처럼 IPC를 먼저 패키징하기 시작하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 세포를 무혈청 동결 매체로 옮기는 것입니다.
절차의 세 번째 단계는 평소와 같이 냉동 보존하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 해동하고 유지 관리를 시작하는 것입니다. 궁극적으로, 건강한 형태와 해동 후 회복을 통해 혈청 무 동결 매체에서 IPS 세포의 성공적인 동결 및 해동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
안녕하세요, 저는 Life Technologies의 GCO 현장에서 근무하는 Kate Wagner입니다. IPC는 동결 및 T에 매우 민감할 수 있으므로 이 프로토콜의 시각적 시연이 중요합니다. 이 프로토콜을 더 쉽게 만드는 것은 녹아웃 혈청 교체를 전체 워크플로우에 걸쳐 사용할 수 있다는 것입니다.
오늘날 KSR 제품군에는 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기 세포의 피더 기반 피드 프리 및 제노 프리 배양을 위한 배지 및 시약의 전체 목록이 포함되어 있습니다. KSR은 유도체 성장, 극저온 보존, 확장 및 분화의 첫 번째 초기 단계에 사용할 수 있습니다. 다음 비디오는 Peter free 기계에서 KSR을 사용하여 해동 및 동결하는 방법을 보여줍니다.
이 절차를 시작합니다. 먼저 적당량의 완전 피더 프리 배지를 섭씨 37도까지 수조에서 60mm 접시인 배양 용기에서 흡입 폐배지로 가열합니다. 이 경우 인간 유도 만능 줄기세포를 DPBS로 두 번 헹굽니다.
그런 다음 접시에 1ml의 디스파를 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 그 후, 디스파 용액을 흡입하고 DPBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.
다음으로, 접시를 덮기 위해 완전한 피더 프리 배지를 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 멸균 15ml 원심분리 튜브로 세포를 부드럽게 긁습니다. 유리 배지를 완전히 공급하여 접시를 헹구고 분리되지 않은 세포를 부드럽게 분사합니다. 헹굼 용액을 세포가 들어 있는 동일한 15ml 튜브로 옮깁니다.
접시를 매체로 두 번 헹구고 실온에서 3분 동안 1000RPM으로 원심분리하여 셀 펠릿 세포와 함께 헹굼 용액을 당깁니다. 원심분리 후 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 버립니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 튜브 바닥에서 세포 펠릿을 완전히 제거합니다.
그런 다음 5ml 혈청학적 피펫을 사용하여 1ml의 동결 배지 A를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 덩어리를 균일하게 현탁시킨 후 1ml의 동결 매체 B를 적하 방식으로 튜브에 첨가하면서 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이쳐 혼합합니다. 이소프로판올 챔버에서 하룻밤 동안 섭씨 영하 80도의 각 극저온 동결 셀에 1ml의 세포 현탁액을 할당합니다.
다음 날, 장기 보관을 위해 세포의 바이알을 액체 질소 탱크로 옮깁니다. 세포의 얼어붙은 바이알을 섭씨 37도의 수조에 넣어 작은 냉동 덩어리만 남을 때까지 약 3-4분 동안 빠르게 해동합니다. 수조에서 바이알을 꺼낸 후 70% 이소프로판올을 뿌려 오염을 제거한 다음 5ml 피펫을 사용하여 바이알의 전체 내용물을 15ml 원추형 튜브에 무균 상태로 옮깁니다.
다음 단계는 절차의 가장 어려운 측면일 수 있습니다. 피더 프리 배지는 천천히 그리고 조심스럽게 세포에 첨가해야 합니다. 삼투압 쇼크를 줄이려면 15ml 원추형 튜브의 셀에 4ml의 완전 피더 프리 배지를 천천히 적가합니다.
배지를 추가하는 동안 튜브를 앞뒤로 부드럽게 움직여 세포를 혼합합니다. 이것은 세포에 대한 삼투압 쇼크를 줄입니다. 완전한 무급유 배지는 필로폰 조절 배지를 함유한 녹아웃 혈청 대체품 또는 피더와 함께 사용하기 위한 녹아웃 혈청 대체 배지로 교체할 수 있습니다(배지 준비 지침은 프로토콜 텍스트 참조).
4ml의 배지를 모두 첨가한 후 실온에서 5분 동안 1000RPM으로 셀을 원심분리합니다. 원심분리 후, 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 제정신을 버리십시오. 세포 펠릿을 4ml의 완전 공급되지 않는 배지에 부드럽게 재현탁합니다.
5ml 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 젤트 트럭으로 코팅된 60mm 배양 접시에 부드럽게 덧붙입니다. 배양 접시를 공기 중 이산화탄소가 4-6%인 가습 분위기의 섭씨 36-38도의 인큐베이터에 놓습니다. 접시를 북쪽에서 남쪽, 동쪽에서 서쪽 패턴으로 조심스럽게 휘젓아 세포를 고르게 분포시킵니다.
해동 후 24시간. 접시의 매체를 새 매체로 교체하십시오. 그 후 세포가 약 70-80% confluent가 될 때까지 사용한 배지를 매일 교체하십시오.
이 대비 이미지는 완전한 혈청 대체, 무공급액 배지를 사용하여 gelt TRX 코팅 배양 접시에서 성장한 인간 유도 만능 줄기 세포를 보여줍니다. IPC는 큰 핵과 부족한 세포질을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 보여줍니다. 해동 및 녹아웃 혈청 교체 후 세포의 예.
gelt TrackX의 피더 프리 배지가 여기에 나와 있습니다. 이 절차를 따를 때 모든 세포 콜로니를 동일한 크기로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 동결 보존하면 세포 회복이 향상됩니다.
그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.
이 프로토콜은 KnockOut SR 동결보존 배지를 사용하여 인간 유도 다능 줄기(iPS) 세포를 동결보존하고 완전한 KnockOut SR Feeder Free(KSR-FF) 배지 또는 피더 기반 KnockOut SR 배지에서 복구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 동결 및 해동 중 iPS 세포의 민감성 때문에 시각적 시연의 중요성을 강조합니다.
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.