대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

다음 실험의 전반적인 목표는 배아 발달 및 생리학의 주요 측면을 구체적으로 조절하는 작은 분자를 발견하는 것입니다. 이것은 두 번째 단계로 플레이트를 스크리닝하는 동안 많은 수의 수정란을 96개에 배치함으로써 달성됩니다. 작은 분자 라이브러리의 부분 표본은 96개의 웰 플레이트에 추가되고 다음 96개의 배아에 추가됩니다.

웰 플레이트는 작은 분자에 의해 유도된 표현형에 대해 검사됩니다. 어떤 작은 분자가 슈퍼 어류의 발달 또는 생리학에 구체적으로 영향을 미치는지를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 안녕하세요, 저는 밴더빌트 대학교 의과대학의 찰스 홍입니다.

우리 실험실에서는 이어류 배아를 사용하여 고처리량 화학 스크리닝을 수행합니다. 이것은 새로운 생체 활성 화합물을 발견하는 데 널리 적용할 수 있는 비교적 쉬운 기술입니다. 화학 검사가 있기 전날 오후에 10-20개의 제브라피쉬 번식 탱크를 설치하십시오.

각 탱크에 칸막이를 놓고 어망 이동을 사용하여 각 탱크에 양식 시스템의 물을 채우고, 성인 수컷 1 명과 성인 암컷 1-2 명을 내부 용기로 보냅니다. 각 번식 탱크에서 탱크에 라벨을 붙이고 스크린 아침에 뚜껑을 덮습니다. 번식 탱크에서 칸막이를 제거하고 제브라피쉬가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다.

다음 한 시간 동안. 수정란이 각 내부 용기의 바닥에 있는 그리드를 통해 떨어지도록 합니다. 1 시간 후 성인 seber 물고기는 영구 저장 탱크로 다시 돌아갑니다.

내부 용기를 제거하고 플라스틱 차 여과기를 통해 각 사육 탱크의 물을 걸러서 계란을 수집합니다. 페트리 접시 위에 여과기를 뒤집고 여과기를 부드럽게 헹구어 계란을 페트리 접시에 씻어냅니다. E 3 배지가 들어있는 세척 병을 사용하여 불투명하게 보이는 수정되지 않은 모든 난자를 제거해야 합니다.

일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 각 짝짓기 교배는 약 200개의 배아를 산출해야 합니다. 그런 다음 유리 페이스트르 피펫을 사용하여 E 3개 매체의 약 5개의 배아를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 일단 배아가 96 웰 플레이트에 배열됩니다.

12채널 피펫을 사용하여 웰에서 E 3개 매체를 최대한 많이 제거합니다. 배아에 구멍이 나지 않도록 주의합니다. 12 채널 피펫을 사용하여 250 마이크로 리터의 E 3을 전달합니다.

밀리리터당 0.5마이크로그램을 함유한 배지는 배아가 마르지 않도록 가능한 한 빨리 각 웰에 마이신을 넣을 수 있습니다. 96개의 웰 플레이트를 화합물을 추가할 때 원하는 단계에 도달할 때까지 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣습니다. 이 프로토콜에서는 초기 배아 패터닝을 교란하고 3시간 동안 또는 일반적으로 공급되는 배아의 90% 이상이 1000 cell stage에 도달할 때까지 배아를 배양하는 화합물을 찾습니다.

각 화합물이 10 밀리몰 스톡으로 DMSO에 저장된 96웰 소스 플레이트에서 배아가 원하는 단계에 도달하기 약 60분 전에 저분자 분취액을 포함하는 적절한 수의 96웰 플레이트를 해동합니다. 플레이트의 응결을 최소화하기 위해 소스 플레이트의 일련 번호 또는 기타 식별 번호를 기록해 두십시오. T는 건조기가 포함된 건조 챔버에 떨어집니다. 오른쪽.

멀티웰 플레이트 어댑터가 장착된 탁상용 원심분리기에서 플레이트를 잠시 회전시킵니다. 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 알루미늄 천장 테이프를 제거하고 소스 플레이트의 화합물을 DMSO로 원하는 농도로 희석합니다. 이 프로토콜에서는 0.5 millimolar 최종 농도를 사용하고 4.75 μlit의 DMSO를 첨가하여 10 millimolar stock plate를 희석합니다.

96웰 플레이트의 배아가 원하는 단계에 도달하면 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 배아가 포함된 수용 플레이트로 2.5마이크로리터의 화합물을 전달합니다. 현재 배아와 화합물이 들어 있는 플레이트를 뚜껑으로 덮고 배아 플레이트에 소스 플레이트의 식별 번호를 기록합니다. 접시를 부드럽게 휘젓고 섞어 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣습니다.

사용하지 않은 소분자가 들어 있는 각 소스 플레이트를 알루미늄 천장, 테이프로 덮고 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣습니다. 시각적 스크린을 수행하기 전에 특정 히트 기준을 공식화하십시오. 예를 들어, 4개의 브레인 발달의 소분자 억제제에 대한 스크리닝에서, 히트는 전뇌의 손실을 부여하는 화합물일 수 있습니다.

눈이 없다는 것은 전뇌의 손실을 시각적으로 쉽게 나타낼 수 있는 지표이며, 발달 과정에서 원하는 시기에 분석하기 위해 형광이 필요하지 않습니다. 인큐베이터에서 복합 처리된 배아를 포함하는 96개의 웰 플레이트를 제거하고 4개의 브레인 발달의 소분자 억제제를 스크리닝할 때 실체 현미경으로 각 웰을 검사하고, 4개의 브레인 발달 억제의 마커로서 안구 손실에 대해 28시간에 플레이트를 검사합니다. 5개의 배아 중 3개 이상이 규정된 hi 표현형을 나타내는 모든 웰의 플레이트와 웰 위치를 기록하고 96 웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.

48시간에 눈과 전뇌의 소실을 재확인합니다. 배아에는 전뇌가 없더라도 최소 4일까지 생존할 수 있습니다. 각 용량에 대해 여러 용량으로 화합물의 효과를 재테스트하여 잠재적 인 히트를 재확인하고, 10 개의 배아를 48 웰 플레이트 형식으로 0.5 밀리리터의 E 3 배지에서 테스트합니다.

재검사를 위한 복합 에디션의 시기는 기존 스크리닝의 시기와 동일해야 합니다. HIIT는 유도된 표현형이 화합물의 재검사에 대한 용량 의존적 방식으로 재현될 때 확인됩니다. 마지막으로, 화학 라이브러리의 작은 분자 데이터베이스에서 hi 화합물을 식별합니다.

제브라피시 기반 시각 화학 스크린을 사용하여 신체 축에 미치는 영향을 기반으로 한 소분자 고슴도치 신호 억제제를 발견했습니다. 이 이미지는 고슴도치 억제제에 노출된 배아가 꼬리의 현저한 복부 곡률을 나타내는 것을 보여줍니다. 24시간에, 48시간에 검사된 동일한 배아가 여전히 복부로 굴곡된 표현형을 나타냅니다.

이 이미지는 고슴도치 경로 돌연변이 배아와 비교하여 처리된 화합물 배아를 표시합니다. 이 기술을 마스터하면 한 사람이 단 몇 시간 만에 일주일에 약 400개의 화합물을 스크리닝할 수 있습니다. 이 기술은 또한 화학 생물학자들이 세포 발달, 세포 신호 전달 경로 및 배아 발달과 같은 것들을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

특성화되지 않은 작은 분자로 작업할 때는 이러한 특성화되지 않은 분자가 잠재적으로 위험할 수 있으므로 적절한 안전 사용 실험실 가운과 장갑을 착용하는 것이 중요합니다.