Name: 대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 대규모 소분자 화면 분석 방법으로 Danio rerio 배아를 활용하여 발달 생물학 및 약리학 연구에서 신약 후보 물질을 효율적으로 선별하는 기술을 익히세요.

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1) Zebrafish 에그 컬렉션 <ol><li> 이전에 화학 화면의 하루 오후, 10-20 zebrafish 사육 탱크를 설정합니다. 양식업 시스템에서 물을 각각의 탱크를 채우십시오. 물고기 그물을 사용하여 각각의 사육 수조 내부 컨테이너 한 성인 남성과 1-2 성인 여성을 전송할 수 있습니다. 구분선 서로의 남성과 여성의 생선을 분리합니다. 새장을 분류하고 그들을 통해 뚜껑을 넣어. </li><li> 화면의 아침, 사육 탱크에서 디바이더를 제거하고 짝짓기 zebrafish하실 수 있습니다. 다음 1 시간 과정 동안 수정된 계란 각 내부 컨테이너의 하단에 그리드를 통해 가을 수 있습니다. </li><li> 일시간 후, 영구 저장 탱크로 성인 zebrafish를 반환하는 내부 용기를 제거하고 플라스틱 차 스트레이너를 통해 각 사육 탱크에 물을 긴장하여 계란을 수집합니다. </li><li> 페트리 접시 위에 스트레이너를 반전하고 E3 매체를 포함하는 세척 병을 사용하여 페트리 접시에 계란을 내리려고 부드럽게 스트레이너를 씻어. </li><li> 불투명 나타나는 모든 unfertilized 계란은, 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 삭제해야합니다. 각 짝짓기 크로스는 약 200 배아를 얻을 것입니다. </li></ol> 2) 96 - 웰 플레이트에 배아를 Arraying <ol><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 E3 중간에 5 배아에 대한 전송합니다. </li><li> 소중히 배아를 치료하지 복용, 피펫 - 일단 태아가 96 - 웰 플레이트에 못하였 느니라 있으며, 12 채널 (300 μL 30)를 사용하여 우물 밖으로 가능한 한 많은 E3​​ 매체를 제거합니다. 12 채널 피펫을 사용하므로 같은 배아가 건조하지 못하게하는 것이 아니라 가능한 한 빨리 각각 0.5μg/ml kanamycin을 포함 E3 매체를 250 μL를 제공합니다. </li><li> 화합물을 추가할 때 그들이 원하는 무대를 도달할 때까지 28.5 ° C 배양기로 96 - 웰 플레이트 놔. </li></ol> 작은 분자 도서관 3) 전송 복합 전송이 로봇 전송 방법으로 자동화할 수 있지만, 우리는 수동 전송 방법을 설명합니다. <ol><li> 작은 분자 라이브러리는 일반적으로 10 MM 재고로 DMSO에 저장된 각각의 화합물로, 96 - 웰 형식으로 제공됩니다. 화합물이 추가 될 때 태아의 단계에 도달 약 60 분 전에, 작은 분자의 aliquots (소​​스 판)이있는 96 - 웰 플레이트에 원하는 숫자를 녹여. 소스 접시의 시리얼 또는 기타 식별 번호를 기록해 둡니다. 접시에 응축을 최소화하기 위해 해동은 Drierite을 (WA 하몬드 DRIERITE CO, 제니아, OH) 포함하는 건조 챔버에서 발생할 수 있습니다. </li><li> 간단히 멀티 웰 플레이트 어댑터가 장착된 탁상 원심 분리기에서 접시를 스핀 다운. </li><li> 소스 판에서 알루미늄 실링 테이프를 제거합니다. 12 채널 피펫을 사용하여 0.5 mm의 농도 (예를 들어, 10mM 재고 250 NL의 aliquots 시작하는 경우, 각 잘하는 DMSO의 4.75 μL 추가)하는 소스 접시에있는 성분을 희석. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 배아 (받는 접시) 원하는 단계에 도달하면,를 포함하는받는 사람 접시에 소스 접시에서 화합물의 2.5μL (0.5mM)을 전송하는 12 채널 (2-20 μL) 피펫을 사용하여 배아. </li><li> 받는 사람 배아 접시에있는 소스 접시의 식별 번호를 기록합니다. 지금 뚜껑과 함께 배아와 화합물을 포함하는받는 사람 번호판 커버, 부드럽게 부드럽게 소용돌이 치는하여 번호판을 혼합하고, 28.5 ° C 배양기에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 장기 저장을위한 -80 ° C 냉동고에 알루미늄 씰링 테이프 및 장소 사용되지 않은 작은 분자 (0.5 MM)를 포함하는 각 소스 판 표지. </li></ol> Phenotypes의 육안 검사에 의해 작은 분자의 효과에 대한 4) 심사 <ol><li> 이전 화면을 수행하는 &quot;히트&quot;를 구성하는 것이 무엇에 대한 구체적인 기준을 수립. </li><li> 개발에 원하는 시간에, 인큐베이터에서 화합물 - 처리 배아를 포함하는 96 - 웰 플레이트를 제거하고 stereomicroscope 아래의 각 우물을 확인합니다. 이러한 순환 패턴의 변화 등 미묘한 변화를보다 효율적으로 시각화 들어, 단계 - 대비 바뀌 현미경을 사용할 수 있습니다. 형광 현미경은 조직 특정 발기인에 따라 GFP 또는 DsRed 단백질의 표현의 섭동을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 신속하게 5 배아 밖으로 적어도 3 소정의 &quot;히트&quot;표현형을 전시 어느 잘 대해 96 - 웰 플레이트를 검사합니다. 판 각 잠재적인 충돌의 잘 위치의 신원을 기록합니다. </li><li> 여러 복용 (1 음, 5 음, 10 μm의 및 50 μm의)의 화합물의 효과를 다시 테스트하여 잠재적인 충돌을 재확인. 각 복용량을 위해, 10 배아는 48 웰 플레이트 형식 E3 미디어 0.5 ML에서 테스트합니다. 다시 테스트를위한 화합물 이외의시기는 원래 심사의 동일해야합니다. 조회 elicited 표현형이 compoun의 다시 테스트를 재현 때 확인D </li><li> 화학 라이브러리에 작은 분자의 데이터베이스에서 히트 화합물을 식별합니다. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

zebrafish 기반 화학 화면을 계획하는 경우 특히주의가 고려에서 표현형 및 표현형의 배경 율의 견고에 지불되어야합니다. 이것은 유도 표현형 화학 진압을 위해 스크린에 특히 중요합니다. 예를 들어, transgene의 열 - 충격 유도에 의한 표현형 들어, 표현형을 유도 조건 reproducibly 정확하게 unacceptably 높은 거짓 긍정적인 요금을 피하기 위해 화면을 시작하기 전에 밖으로 매핑해야합니다. 주의 계획과, 겸손한 자본 투자를 필요로 zebrafish 화학 화면, 세포 신호 및 생리학의 소설 변조기의 발견뿐만 아니라, 인간 질병 모델을 반대로 리드 화합물을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 고전적인 앞으로 유전 화면에 비유하여 zebrafish 기반 화학 화면 기본적인 생물 학적 과정의 화학 유전 해부에 대한 가치 수 있습니다.

<ol><li> 원하는 유전자형의 성인 zebrafish의 20쌍 최소. </li><li> 이동식 내부 컨테이너와 디바이더 (수생 서식지)와 물고기 그물, 사육 탱크. </li><li> 배양 접시 (10cm). </li><li> 플라스틱 티 스트레이너. </li><li> 병 containg 배아 물을 씻으십시오. </li><li> 일회용 폴리에틸렌 전송 pipettes. </li><li> 폴리스티렌은 96 - 잘 왕복 하단의 분석 플레이트 (코닝 코스타, 로웰, MA). </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 (피셔 과학). </li><li> 수동 피펫 펌프, 10 ML (벨 - 예술 제품, 페콰녹, NJ). </li><li> E3 배아 매체 : 0.003 % PTU을 (phenylthio - carbamide, 시그마, 세인트 루이스, MO)가 포함된 5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4. PTU는 E3 배아 미디어 1 L에서 0.3 - G PTU를 용해하여 10X 솔루션으로 준비하실 수 있습니다. PTU를 포함하는 솔루션은 알루미늄 호일로 덮고의 빛으로부터 보호되어야합니다. </li><li> 12 채널 pipettes, 2-20 μL (Eppendorf). </li><li> 12 채널 pipettes, 3에서 300 사이 μL (Eppendorf). </li><li> 일회용 피펫 폴리스티렌 분지, 50 ML (피셔 과학). </li><li> DMSO 10 MM 주식에서 96 못할거다 형식 못하였 느니라 구조적으로 다양한 화합물의 작은 분자 라이브러리입니다. 각 마스터 판은 96 잘 폴리 프로필렌 저장 플레이트 (코닝)로 aliquoted하고, -80 ° C에서 사용할 때까지 저장됩니다. </li><li> 알루미늄은 (Nunc, 로체스터, NY) 96 - 웰 플레이트에 대한 테이프를 씰링. </li><li> DMSO (시그마, 세인트 루이스, MO). </li><li> 기본 인큐베이터, 28.5 ° C (피셔 과학). </li><li> 전송 라이트베이스 (Leica 이크로 시스템즈, 배녹번, IL)로 Stereomicroscope. </li></ol>

대규모 zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

그들의 작은 배아 크기, 신속한 개발, 투명성, 생산력, 그리고 포유류에 수많은, 분자 및 생리 형태학의 유사성을 감안할 때, zebrafish는 강력한으로 등장했습니다<em&gt; 생체내에</em표현형 기반 약물 스크린 및 화학 유전 분석&gt; 플랫폼입니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아를 사용하는 작은 분자의 대규모 심사 간단한 실용적인 방법을 보여줍니다.

Zebrafish는 강력한으로 등장했습니다<em&gt; 생체내에</em표현형 기반 약물 스크린 및 화학 유전 분석&gt; 플랫폼입니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아를 사용하는 작은 분자의 대규모 심사 간단한 실용적인 방법을 보여줍니다.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

배아의 크기가 작고 발달 속도가 빠르며, 투명도와 다산성을 갖추었을 뿐만 아니라 ...와의 분자적, 형태적 및 생리학적 유사성이 많기 때문에...

다음 실험의 전반적인 목표는 배아 발달 및 생리학의 핵심적인 측면을 특이적으로 조절하는 저분자 화합물을 발굴하는 것입니다. 이는 먼저 다량의 수정란을 96웰 플레이트에 배치하고, 두 번째 단계로 스크리닝을 수행함으로써 달성됩니다. 저분자 화합물 라이브러리의 분주액을 96웰 플레이트에 추가하여 웰 내의 배아에 처리합니다.소분자가 유도하는 표현형을 확인하기 위해 웰 플레이트를 검사합니다. 이를 통해 어떤 소분자가 슈퍼 피쉬의 발달 또는 생리에 특이적으로 영향을 미치는지에 대한 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 저는 밴더빌트 대학교 의과대학의 Charles Hong입니다.본 연구실에서는 제브라피쉬 배아를 이용하여 고처리량 화학 스크리닝을 수행합니다. 이는 새로운 생성물 활성 화합물을 발견하기 위해 광범위하게 적용할 수 있는 비교적 간단한 기술입니다. 화학 스크리닝 실시 전날 오후에 제브라피쉬 교배 탱크 10~20개를 준비하십시오.각 수조에 칸막이를 설치하고 양식 시스템의 물을 채운 후, 뜰채를 사용하여 성체 수컷 한 마리와 성체 암컷 한에서 두 마리를 내부 용기로 옮깁니다. 각 교배 수조에 라벨을 부착하고, 스크리닝 당일 아침에 뚜껑을 덮습니다. 교배 수조에서 칸막이를 제거하여 제브라피시가 교배할 수 있도록 합니다.다음 한 시간 동안, 수정란이 각 내부 용기 바닥의 그리드를 통해 아래로 떨어지도록 둡니다. 한 시간이 지나면 성체 제브라피시를 영구 보관 탱크로 다시 옮깁니다.내부 컨테이너를 제거하고, 각 사육 탱크의 물을 플라스틱 차 거름망으로 걸러 알을 수집합니다. 거름망을 페트리 접시 위에 뒤집어 놓고 거름망을 부드럽게 헹궈 알이 페트리 접시로 들어가게 합니다. E three 배지가 담긴 세척병을 사용하여 불투명하게 보이는 모든 무정란을 제거해야 합니다.일회용 플라스틱 피펫을 사용하여, 각 교배 조합당 약 200개의 배아를 얻어야 합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 E3 배지가 담긴 96 웰 플레이트의 각 웰에 약 5개의 배아를 옮깁니다. 배아가 96 웰 플레이트에 배열되면12채널 피펫을 사용하여 웰에서 E three 배지를 가능한 한 많이 제거합니다. 이때 배아에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 12채널 피펫을 사용하여 E three 250 µL를 분주합니다.배아가 건조되지 않도록 가능한 한 빨리 각 웰에 0.5 µg/mL의 kanamycin이 포함된 배지를 넣습니다. 화합물을 첨가해야 하는 원하는

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 multiwell 플레이트에 zebrafish 배아 유전자 변형의 자동 이미징 및 분석을위한 시스템의 개발을보고합니다. 이것은 Fibroblast 성장 팩터 리포터 유전자의 표현에 작은 분자, BCI의 복용 부양 효과를 측정하고 높은 처리량 zebrafish 화학 화면 설립을위한 기술을 제공하는 능력을 보여줍니다.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

이 기사에서는 제브라피시 배아가 화학적 독성 검사에 사용됩니다. 화학적 독성은 표현형 판독과 상관관계가 있습니다. 샘플 프로토콜은 화학적 독성 스크리닝을 수행하는 방법론적 접근 방식을 보여줍니다.

배아 기반 화학 독성 스크리닝: 제브라피시 배아 발달에 미치는 영향 평가

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

이 프로토콜은 수정 후 3-7일 후에 제브라피시 유충에 대한 약물 스크리닝 절차와 형태학적 평가를 설명합니다.

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

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