대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

다음 실험의 전반적인 목표는 배아 발달 및 생리학의 핵심 요소를 특이적으로 조절하는 소분자를 발굴하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 다량의 수정란을 96-웰 스크리닝 플레이트에 배치함으로써 달성됩니다. 소분자 라이브러리의 분주액을 96-웰 플레이트에 추가하여 96-웰 내의 배아에 처리합니다.

소분자를 통해 유도된 표현형을 확인하기 위해 웰 플레이트를 검사합니다. 이를 통해 어떤 소분자가 슈퍼 피쉬의 발달 또는 생리에 특이적으로 영향을 미치는지 보여주는 결과를 얻습니다. 안녕하세요, 밴더빌트 대학교 의과대학의 Charles Hong입니다.

본 연구실에서는 제브라피쉬 배아를 이용하여 고처리량 화학 스크리닝을 수행합니다. 이는 새로운 생리활성 화합물을 발굴하기 위해 광범위하게 응용할 수 있는 비교적 간단한 기술입니다. 화학 스크리닝 전날 오후에 10~20개의 제브라피쉬 교배 탱크를 준비합니다.

각 수조에 칸막이를 설치하고, 뜰채를 이용하여 성체 수컷 한 마리와 성체 암컷 한두 마리를 내부 용기에 넣은 뒤 양식 시스템의 물로 각 수조를 채웁니다. 각 번식 수조에 라벨을 부착하고, 스크리닝 당일 아침에 뚜껑을 덮습니다. 번식 수조에서 칸막이를 제거하여 제브라피시가 교배할 수 있도록 합니다.

다음 한 시간 동안 수정한 알이 각 내부 용기 바닥의 그리드를 통해 빠져나가도록 둡니다. 한 시간이 지나면 성체 제브라피시를 영구 보관 탱크로 다시 옮깁니다.

내부 컨테이너를 제거하고 각 사육 탱크의 물을 플라스틱 차 거름망으로 걸러 알을 수집합니다. 거름망을 페트리 접시 위에 뒤집어 놓고 살살 헹구어 알이 페트리 접시로 들어가게 합니다. E three 배지가 든 세척병을 사용하여 불투명하게 보이는 모든 무정자와 알을 제거해야 합니다.

일회용 플라스틱 피펫을 사용하여, 각 교배 조합당 약 200개의 배아를 얻어야 합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 E3 배지가 담긴 배아 약 5개를 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 이렇게 하여 배아를 96웰 플레이트에 배열합니다.

12채널 피펫을 사용하여 웰에서 E three 배지를 최대한 제거합니다. 이때 배아에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 12채널 피펫을 사용하여 E three 250 µL를 분주합니다.

배아가 건조되지 않도록 0.5 µg/mL의 kanamycin이 함유된 배지를 각 웰에 가능한 한 빠르게 분주합니다. 화합물을 첨가하고자 하는 목표 단계에 도달할 때까지 96-웰 플레이트를 28.5 °C 인큐베이터에 보관합니다. 본 프로토콜에서는 초기 배아 패턴 형성을 방해하는 화합물을 탐색하며, 배아를 3시간 동안 또는 90% 이상의 배아가 1000-세포 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 저분자 화합물 라이브러리는 통상적으로 공급됩니다.

각 화합물이 10 millimolar 스톡으로 DMSO에 저장된 96-웰 소스 플레이트에서, 배아가 원하는 단계에 도달하기 약 60분 전에 소분된 저분자 화합물이 포함된 적절한 수의 96-웰 플레이트를 해동합니다. 플레이트의 응결을 최소화하기 위해 소스 플레이트의 일련번호 또는 기타 식별 번호를 기록하십시오. 건조제가 들어 있는 데시케이터에 넣으십시오. 오른쪽.

멀티웰 플레이트 어댑터가 장착된 벤치탑 원심분리기에서 플레이트를 짧게 원심분리합니다. 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트의 알루미늄 실링 테이프를 제거하고, DMSO를 이용해 소스 플레이트 내 화합물을 원하는 농도로 희석합니다. 본 프로토콜에서는 최종 농도를 0.5 millimolar로 설정하며, 10 millimolar 스톡 플레이트를 희석하기 위해 4.75 microliters의 DMSO를 첨가합니다.

96웰 플레이트의 배아가 원하는 단계에 도달하면, 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트의 화합물 2.5 µL를 배아가 들어 있는 수신 플레이트로 옮깁니다. 배아와 화합물이 포함된 플레이트를 덮개로 덮고, 배아 플레이트에 소스 플레이트의 식별 번호를 기록합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 섞은 후 28.5 °C 인큐베이터에 넣습니다.

사용하지 않은 소분자 화합물이 들어 있는 각 소스 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 테이프로 고정한 뒤, 장기 보관을 위해 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 시각적 스크리닝을 수행하기 전에 구체적인 히트(hit) 기준을 설정하십시오. 예를 들어, 뇌 발달의 소분자 억제제 스크리닝에서 히트는 전뇌(forebrain)의 소실을 유발하는 화합물이 될 수 있습니다.

눈의 결손은 전뇌 손실을 나타내는 쉬운 시각적 지표이며, 발달 단계의 원하는 시점에 분석할 때 형광 표지가 필요하지 않습니다. 화합물 처리된 배아가 담긴 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 실체 현미경으로 각 웰을 관찰하십시오. 전뇌 발달 억제제인 소분자 화합물을 스크리닝할 때는, 전뇌 발달 억제의 마커로서 눈의 결손 여부를 확인하기 위해 28시간째에 플레이트를 검사하십시오. 5개의 배아 중 최소 3개 이상에서 규정된 표현형이 나타나는 모든 웰에 대해 플레이트 식별 번호와 웰 위치를 기록하십시오. 96웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣으십시오.

48시간 후에 눈과 전뇌의 소실 여부를 재확인합니다. 배아의 전뇌는 형성되지 않더라도 최소 4일까지는 생존합니다. 화합물의 효과를 여러 농도로 재시험하여 잠재적인 히트(hit) 여부를 재확인하며, 각 농도당 10개의 배아를 48-웰 플레이트 형식의 0.5 mL E3 배지에서 테스트합니다.

재시험을 위한 화합물 조제 시점은 최초 스크리닝 때와 동일해야 합니다. 화합물 재시험 시 유도된 표현형이 용량 의존적 방식으로 재현되면 HIIT로 확정됩니다. 마지막으로, 화학 라이브러리의 저분자 화합물 데이터베이스에서 해당 hit 화합물을 식별하십시오.

제브라피시 기반의 시각적 화학물질 스크리닝을 통해, 우리는 체축에 미치는 영향을 바탕으로 소분자 hedgehog 신호 억제제를 발견했습니다. 이 이미지는 hedgehog 억제제에 노출되어 꼬리 부분이 현저하게 배측으로 굽은 배아들을 보여줍니다. 24시간째에 확인한 동일한 배아들을 48시간째에 다시 관찰했을 때도 여전히 배측으로 굽은 표현형이 나타납니다.

이 이미지는 화합물 처리된 배아와 hedgehog 경로 돌연변이 배아를 비교하여 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 한 사람이 단 몇 시간 만에 일주일에 약 400개의 화합물을 스크리닝할 수 있습니다. 또한 이 기술은 화학 생물학자들이 세포 발달, 세포 신호 전달 경로 및 배아 발달과 같은 사항을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

특성이 규명되지 않은 저분자 화합물을 다룰 때는 해당 물질이 잠재적으로 위험할 수 있으므로, 실험복과 장갑을 착용하여 적절한 안전 수칙을 준수하는 것이 중요합니다.