비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

안녕하세요, 저는 RI Ov입니다. 그리고 저는 Alexia Ying입니다. 저희는 Cent University의 대학원생입니다. 이번 영상에서는 전뇌 조직의 특정 부위에 표적 유전자를 전달하기 위한 in vivo electroporation 방법을 소개하겠습니다.

자, 살펴보겠습니다. In vivo 전기천공법은 관심 유전자나 소형 간섭 RNA를 살아있는 뇌 조직으로 전달하는 신속하고 효율적인 방법을 제공합니다.

이는 형질전환 동물의 생성 및 바이러스 유전자 전달 방식에 대한 저비용의 대안을 제공합니다. 본 영상에서는 신생 쥐의 대뇌 피질에 대한 출생 후 유전자 전달의 상세 절차를 시연하겠습니다. CMV 인핸서가 포함된 치킨 beta actin 프로모터와 강화 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 사용하겠습니다.

멸균 상태를 유지하고 동물의 세균 또는 진균 오염 위험을 최소화하기 위해 모든 수술 조작은 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내에서 수행합니다. 피질로의 플라스미드 전달을 위해, 전자 제어기가 포함된 WPI 마이크로 인젝터와 정위 고정 조작기(stereotactic manipulator)에 장착된 10 µL Hamilton 시린지를 사용합니다. 적색 쥐 새끼는 박스와 마스크로 구성된 마취 장치를 사용하여 마취시킵니다.

그 다음, 정위 고정 장치(stereotactic manipulator)에 연결된 가열 테이블 위에서 이어 바(ear bars)를 사용하여 새끼 쥐를 고정합니다. 수술적 조작과 미세 주입 모니터링을 위해 쌍안 현미경을 사용합니다. 전기천공법(electroporation)을 위해서는 포셉 형태의 전극이 장착된 CYV 21 in vivo 전기 수술기를 사용합니다.

새끼 쥐의 회복을 위해 마취 후 가온 챔버를 사용합니다. 일반적으로 200 µL 얇은 벽 튜브에 플라스미드 주입 용액 10 µL를 준비하며, 이 용액의 양은 여러 번의 실험에 충분합니다.

플라스미드 용액 8 µL를 10 XPBS 1 µL 및 0.1% fast green 수용액 1 µL와 혼합합니다. 주입 용액 내 플라스미드의 최종 농도는 1~3 µg/µL 사이여야 합니다. 플라스미드 DNA 농도가 이보다 낮으면 형질전환 효율이 감소하며, 농도가 너무 높으면 점도가 지나치게 높아져 유리 모세관의 얇은 팁을 통해 주입하기 어렵습니다.

유리 피펫 준비를 위해, 필라멘트가 포함된 보라실리케이트 유리 모세관과 최대 풀링 및 가열 파라미터로 설정된 수직 전극 유리 풀러를 사용합니다. 그런 다음 종이 조각을 사용하여 피펫의 끝을 부러뜨려 직경 10 to 20 µm의 팁을 만듭니다. 현미경 대물렌즈를 통해 팁의 직경과 모양을 확인합니다.

얇은 폴리머 모세관을 사용하여 10 µL Hamilton 시린지 부피의 약 3분의 1을 채웁니다. 이때 기포가 생기지 않도록 미네랄 오일을 사용합니다. 그런 다음 유리 피펫을 미네랄 오일로 채우고, 이 피펫을 Hamilton 시린지에 삽입합니다.

다시 한번 공기 방울이 생기지 않도록 주의합니다. 이후 유리 피펫이 장착된 시린지를 컨트롤러에 연결된 마이크로 인젝터에 고정합니다. 정위 고정 장치에 고정된 마이크로 인젝션 설정 장치를 통해 유리 피펫의 팁을 플라스미드 주입 용액이 담긴 튜브에 안전하게 담글 수 있습니다.

팁이 용액 표면에 닿으면, 1~2mm 정도 더 깊게 담급니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 파이펫에 Injection mix를 약 1µL 채웁니다. 여기에 제시된 모든 실험은 헬싱키 대학교의 동물 실험 규정에 따라 수행되었습니다.

각 실험마다 가스 밀폐형 주사기에 이소플루레인(isofluorine)을 채웁니다. 공기 흐름원(airflow source)에 연결된 마취 장치에 주사기를 고정하고, 동물이 보행하는 상태에서 정위 고정 장치(stereotactic setup)에 마스크를 고정합니다. 마취 장치에서 공기 흐름을 약 250 milliliters minute로, 이소플루레인 농도를 4%로 조절합니다. 그 후 동물 상자에 레드 팝(red pop)을 2~5분 동안 배치합니다.

P의 움직임이 멈추면, 정위 고정 장치에 부착된 가열 패드 위에 놓습니다. P 머리의 주둥이 쪽(rostral part)을 마스크에 맞춥니다. 새끼 쥐가 깊은 마취 상태에 도달하는 데는 보통 5~10분이 소요됩니다.

그 상태가 되면, 이소플루란 유량을 약 1.5~2%로 낮춥니다. 작은 거즈와 얇은 핀셋을 사용하여 강아지 머리의 피부를 70% 에탄올로 소독합니다. 강아지의 목덜미부터 이마까지 피부를 절개하고, 피부 조각을 옆으로 젖힌 뒤 귀 고정 바(ear bars)를 두개골의 외이도 쪽으로 살짝 밀어 넣어 머리와 피부를 고정합니다. 실체 현미경을 사용하여 두개골의 bregma 지점을 찾고, 정위 좌표를 이용해 관심 영역을 식별합니다. 주입 피펫을 이 영역 위에 위치시킨 후, 주입 용액 25~50 nanoliters를 두개골 표면에 떨어뜨려 표시합니다.

현미경 하에서 고속 외과용 드릴을 사용하여 표시된 지점의 두개골을 액체가 나타날 때까지 조심스럽고 부드럽게 천공합니다. 두개골 양측에 전기천공 포셉과 전극을 고정합니다. 전도성을 높이기 위해 전도성 젤을 도포합니다.

작은 탐폰을 사용하여 천공 부위의 액체 방울을 제거하고 유리 니들을 구멍에 삽입합니다. 주입 위치의 좌표에 따라, 초당 5~20 nL의 속도로 주입 용액 25~100 nL를 주입합니다. 그 후 빠르게 피펫을 제거하고 즉시 전기천공법을 진행합니다.

전기천공법은 99 V의 펄스 진폭과 1 Hz의 주파수에서 50 ms 지속 시간의 펄스를 5회 가하여 수행합니다. 전극과 이어 바를 제거합니다. 둔단 및 예단 포셉과 수술용 봉합사를 사용하여 절개된 피부를 봉합했습니다.

마취 후 회복을 돕기 위해 새끼 쥐를 온열 챔버에 15~30분 동안 두었습니다. 그 후 새끼 쥐를 어미의 케이지로 돌려보냈습니다. 성공적으로 형질전환된 세포에서 외래유전자의 발현은 전기천공법 시행 약 10시간 후에 나타나며, 수 주 동안 안정적으로 유지됩니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.