Name: 비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 출생 후 쥐 뇌에 비바이럴 유전자 전달 방법을. 생체 전기천공을 활용해 신경과학 연구에서 특정 뇌 영역을 효율적으로 표적화하고 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

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우리는 비디오 사운드 트랙 녹음, 전투 편대 - EGFP 플라스미드 준비 3D 애니메이션 박사 피터 Blaesse에 대한 이반 Molotkov와 관련하여 도움이 예카 Karelina 감사합니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성, 핀란드어 문화 재단과 핀란드의 아카데미의 센터에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 소개 유전자 변형 동물의 창조 동물 1 생활과 무너지고 질병 메커니즘 2,3뿐만 아니라 세포 4 속성을 조작을위한 유전자 기능 조사의 강력한 방법입니다. 그러나, 절차 따라서 이러한 바이러스 주사 5, electroporation 6과 utero electroporation 7,8에서 신생아 심실 주입과 같은 다른 유전자 전달 방법의 사용을 warranting, 매우 시간이 소요되고 비용이 상당히 힘드는입니다. ; 관심 지역의 지역 표현식 패턴을 만들 가능성, 비 철새 세포 유형의 현장 transfection에, 예를 들어 대뇌 피질 이외의 바이러스 유전자 구조의 사용 : 출생 후의 비 심실 주입과 electroporation의 방법은 장점의 고유 설정을 가지고 astrocytes. 이 비디오에서는, 우리는 CMV 확장기 (pCAG - EGFP) 9 닭고기 베타 굴지 프로 모터에서 향상된 녹색 형광 단백질에 대한 플라스미드 인코딩을 사용하여 신생아 쥐의 뇌에 출생 후의 유전자 전달의 세부 절차를 보여줍니다. 우리는 얇은 유리 pipettes의 제조 및 stereotactic 악기에 microinjector의 조립, 플라스미드 함유 사출 솔루션의 준비를 보여줍니다. 그럼 우리가 사출 및 절차에 대한 집게 전극 및 생체내의 porator의를 사용하여 electroporation에 대해, 수술을 수행에 대한, isoflurane와 쥐 새끼를 anaesthetizing 이야기. 마지막으로, 우리는 간단히 예상 결과 관점 이러한 실험을하는 동안 발생할 수있는 어려움을 논의합니다. 2. Electroporation에 대한 플라스미드 준비 <ol><li> 우리는 일반적으로 200 μl 얇은 벽 튜브의 플라스미드 주입 용액 10 μl를 준비합니다. 이 솔루션은 여러 가지 실험을 위해 충분합니다. </li><li> 우리는 10X PBS 1 μl (재료 및 장비를 참조) 0,1 % 빠른 그린 수용액 (재료 및 장비를 참조) 1 μl와 플라스미드 솔루션 8 μl를 (재료 및 장비를 참조) 섞는다. </li><li> 사출 솔루션에 플라스미드의 최종 농도는 μg / μl 1 ~ 3해야합니다. 높은 DNA 농도는 유리 모세관의 얇은 팁을 통해 사출 너무 점성되지만 플라스미드 DNA의 낮은 농도는 transfection 효율을 줄일 수 있습니다. </li></ol> 3. 유리 니들 준비 <ol><li> 유리 피펫의 준비, 우리는 최대 매개 변수를 당기는 난방에 필라멘트와 모세관 borosilicate 유리 (재료 및 장비를 참조)과 수직 전극 유리를 풀러 (재료 및 장비를 참조)을 사용합니다. </li><li> 그런 다음 직경의 팁을 10-20 μm의를 달성하기 위해 종이를 사용하여 피펫의 팁을 휴식. </li><li> 우리는 현미경 목표 아래 팁 직경과 모양을 확인합니다. </li></ol> 4. Microinjector은 조립 <ol><li> 모세관 얇은 중합체 (재료 및 장비를 참조) 우리는 (재료 및 장비를 참조) 광유와 (과​​ 재료 및 장비를 참조) 약 삼분의 일 10 μl 해밀턴 주사기의 볼륨을 채우기를 사용하여. 공기 방울을 피하십시오! </li><li> 그렇다면 우리는 미네랄 오일과 유리 피펫을 입력하고 해밀턴 주사기에 피펫를 삽입합니다. 공기 방울을 피하십시오! </li><li> 유리 피펫과 주사기는 다음 (재료 및 장비를 참조) 컨트롤러에 연결된 microinjector에 고정됩니다. </li><li> stereotactic 악기 (재료 및 장비를 참조)에 고정 microinjection 설정은 우리가 안전하게 플라스미드 주입 솔루션으로 튜브에 유리 피펫의 팁을 젖어 수 있습니다. </li><li> 팁이 솔루션의 표면을 접촉하면 추가로 1 또는 2mm를 찍어 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 사출 믹스의 약 1 μl로 피펫을 채울. </li></ol> 5. Anaesthetizing 동물 모든 절차를 여기에 소개는 동물 실험에 대한 규제 헬싱키 대학에 따라 수행되었다. <ol><li> 각 실험에 대한, 우리는 (재료 및 장비를 참조) isoflurane의 약 2 ML과 가스 기밀 주사기 (재료 및 장비를 참조) 작성하십시오. </li><li> 주사기가 공기 흐름 소스에 연결된 마취 장치 (재료 및 장비를 참조)에 고정보다, 동물 상자와 마스크 stereotactic 설정에 고정. </li><li> 마취 장치에, 우리는 약 250 ML / 분 및 isoflurane 수준 4 %까지로 공기 흐름을 조정합니다. </li><li> 우리는 2~5분에 대한 동물의 상자에 강아지 쥐를 놓습니다. </li><li> 강아지 중지가 이동할 때, stereotactic 설치에 부착된 가열 패드 (재료 및 장비를 참조)에 놓으십시오. </li><li> anaesthetizing 마스크로 강아지의 머리의 주동이의 일부를 놓으십시오. </li><li> 그것은을 위해 5~10분 걸립니다깊은 마취를 입력 펍. </li><li> 꼬리 핀치와 마취의 깊이를 확인하고 2.0-1.5 % 정도로 isoflurane 유입을 감소. </li></ol> 6. 수술, Microinjection 및 Electroporation <ol><li> 70 % 에탄올로의 강아지 머리에 피부를 취급. </li><li> 작은 가위 (재료 및 장비를 참조) 얇은 집게를 사용하면 (재료 및 장비를 참조), 그 이마에 강아지의 아저씨로부터 피부를 잘라. </li><li> 옆으로 피부 조각 벤드와 약간 머리와 피부 고정에 대한 두개골의 청각 orifices에 귀 막대를 가져옵니다. </li><li> 쌍안경 현미경을 사용하여, 우리는 두개골에 bregma 지점을 찾습니다. </li><li> stereotactic 좌표를 사용하여 관심 영역을 식별합니다. </li><li> 이 지역 위의 사출 피펫을 위치하고 두개골 표면에 분사 솔루션의 25-50 NL 놓아 그것을 표시합니다. </li><li> 액체가 뚫고 영역에 나타날 때까지 현미경 고속 수술 훈련 (재료 및 장비를 참조)를 사용하여 표시된 지점에 부드럽게하고 신중하게 두개골을 드릴. </li><li> 좋은 전도성을 달성하기 위해 현재의 전도성 젤로 두개골의 측면에 electropotation의 집게 전극을 (재료 및 장비 참조) (재료 및 장비를 볼 수) 이후의 수정 프로그램입니다. </li><li> 작은 탐폰을 사용하여 뚫고 구멍에서 액체 방울 (재료 및 장비를 참조) 제거하고 사출 사이트의 좌표에 따라 구멍에 유리 바늘을 찍어. </li><li> 5-20 NL / 초의 속도로 사출 솔루션의 25-100 NL을 달이다. </li><li> 신속하게 피펫을 제거하고 즉시 electroporate. Electroporation는 1 Hz의 주파수에서 99 V의 50 MS와 진폭의 기간이있는 5 직사각형 펄스를 적용하여 수행됩니다. </li><li> 전극과 귀 바 제거합니다. </li><li> 바보 (재료 및 장비를 참조)과 날카로운 집게, 외과 스레드 (재료 및 장비를 참조)의 조합을 사용하여 피부를 잘라 바느질. </li><li> 마취 후의 복구를 돕기 위해 15-30분에 대한 따뜻한 챔버에 강아지를 놓습니다. </li><li> 다음 강아지 다시는 어머니의 케이지에 넣어. </li></ol> 7. 대표 결과 성공적으로 transfected 세포에 transgene의 표현은 electroporation 후 약 10 시간이 나타납니다, 그리고 그것은 몇 주 동안 안정적으로 유지됩니다. 위에서 설명한대로 우리는 깊은 대뇌 피질 레이어 또는 출생 후의 일 2 (P2) 위스타 랫 새끼의 striatum 지역에 중 플라스미드를 microinjected 및 생체내 electroporation에서 수행했습니다. 뇌 슬라이스 (두께 400 μm의)은 2~6일 후 절단 (P4 - P8) (Hepes은 얼의 밸런스드 소금 솔루션을 버퍼) 차가운 깔끔히 매체 10 vibrotome을 사용 하였다. 이미지 수집은 상온에서 깔끔히 매체 자이스 혈구 Axioplan이 LSM5 파스칼 공촛점​​ 현미경 (자이스 혈구, 독일)를 사용하여 수행되었습니다. 깊은 대뇌 피질의 레이어와 striatum에 주입 사이트는 직경 (그림 1A, B)에서 약 200-300 μm의의 소형 지역에 위치하고 있었다 EGFP을 표현하는 여러 transfected 세포가 포함되어 있습니다. transfected 세포 내에 EGFP 표현 수준은 다른 모양 (그림 1D)와 축삭 번들 (그림 1E)의 쪽이과 dendrites을 포함하여 얇은 세포 프로세스 (그림 1C)의 이미징을 허용하도록 충분히 높습니다. EGFP뿐만 아니라 electroporation 후 세포 생존의 강력한 안정성은 대뇌 피질 터미널 (그림 1 층)로 axons의 말초 부분 (최대 1.5-2 mm까지 세포 기관에서) 추적 허용. <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. (A) 성공적으로 플라스미드 주사 사이트를 delineating P4 랫 두뇌의 striatum 지역에서 세포를 transfected. (B) P5 랫 두뇌의 깊은 피질 층에서 Transfected 세포 (대뇌 피질의 표면 아래 약 1000 μm의). P8 쥐 두뇌의 striatum 지역 (C) transfected 세포. (D) P8 쥐 두뇌의 striatum 지역에서 transfected 세포의 돌기 프로세스, 화살표가 돌기 쪽이 및 filopodia의 다른 유형을 나타냅니다. (E) 부수적인 경로 내에 transfected 세포 Axons. (F) Axons는 P8 쥐의 피질 (화살촉)의 pial 표면에 종료. 스케일 바는 A, B, E와 F에 100 μm의되며 C와 D. 10 μm의

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</ol>

생활 쥐 두뇌에 유전자 전달 방법은 잘 출생 후의 electroporation 6보다 최근 utero electroporation 7,8,11,12에 대한 설립하고 있습니다. 그러나 이러한 방법은 여러 어플 리케이션에 제한 수있는 플라스미드 DNA의 심실 주사를 기반으로합니다. 예를 들어, 이러한 방법은 해마, 대뇌 피질이나 ast​​rocytes 같은 비 철새 세포 유형의 transfection와 같은 특정 뇌 영역에서 세포를 대상으로 허용하지 않습니다. electroporation과 함께 비 심실 분사 먼저 소뇌 뉴런 13로 유전자 전달을 위해 사용되었다. 우리 프로토콜은 쥐 두뇌의 다른 지역에 비 심실 방법의 확장을 보여줍니다. 우리는 우리의 방법 론적 접근 방식이 출생 후의 쥐 뇌에 5 이내에 관심이 제한된 지역에 유전자 전달의 바이러스 방법에 유용한 대안이라고 제안합니다. <p class="jove_c...

<table><tbody><tr><td>2A-sa dumb 핀셋, 115mm</td><td>장비</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>수술 조작 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>스테인리스강 가열 패드가 포함된 생물학적 온도 조절기</td><td>장비</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 포함된 붕규산 유리관</td><td>재료</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>유리 니들</td></tr><tr><td>일회용 드릴</td><td>재료</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&amp;rsquo;s PBS 10X</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 포셉, 110 mm</td><td>장비</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>수술 조작 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>Ealing 마이크로&amp;#8211;전극 풀러</td><td>장비</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>수직 전극 유리 풀러</td></tr><tr><td>Ethilon 단사 폴리아미드 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>재료</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>EH7177H</td><td>수술용 실</td></tr><tr><td>Exmire 마이크로 시린지 10.0 ml</td><td>장비</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>가스 타이트 시린지</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>포셉 전극</td><td>장비</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>사용 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>Foredom 드릴 컨트롤러</td><td>장비</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>수술용 드릴 전원 공급 장치 및 컨트롤러. 현재 이용 가능한 유사 제품은 마이크로모터 키트 K.1070 (Foredom)임</td></tr><tr><td>Foredom 마이크로 모터 핸드피스</td><td>장비</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>현재 이용 가능한 유사 제품은 마이크로모터 키트 K.1070 (Foredom)임</td></tr><tr><td>마우스용 가스 마취 플랫폼</td><td>장비</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>정위 고정 장치에 조립됨</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>시약</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 드레싱 포셉, 105 mm</td><td>장비</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>수술 조작 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>재료</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>마이크로 시린지 충전용 모세관</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 시린지 10 microliter</td><td>장비</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton 시린지</td></tr><tr><td>plasmid CAG-EGFP</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen)로 추출 및 정제한 후 nuclease free water에 녹여 1.5 mg/ml 농도로 준비</td></tr><tr><td>펄스 발생기 CUY21Vivo-SQ</td><td>장비</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller 전극 젤</td><td>시약</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>전도성 젤</td></tr><tr><td>소동물용 정위 고정 장치</td><td>장비</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;lting 마우스 및 신생 쥐 어댑터</td><td>장비</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>정위 고정 장치에 조립됨. 수술 조작 전 소독을 위해 이어바(earbar)를 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>학생용 홍채 가위, 직형 11.5 cm</td><td>장비</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>수술 조작 전 소독을 위해 70% ethanol로 처리</td></tr><tr><td>Sugi 흡수성 스왑 17 x 8 mm</td><td>재료</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>수술용 탐폰</td></tr><tr><td>UMP3 마이크로시린지 펌프 및 Micro 4 마이크로시린지 펌프 컨트롤러</td><td>장비</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>마이크로 인젝터 및 컨트롤러</td></tr><tr><td>Univentor 400 마취기</td><td>장비</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

비 심실 플라스미드 주입 및 electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

유전자 변형 동물의 창조는 생체내에 대한 관심의 유전자의 기능을 연구의 표준 방법입니다. 그러나 대부분의 녹아웃이나 유전자 변형 동물은 수정 유전자가 표현하거나 전체 유기체에서 삭제됩니다 이러한 경우에는 가능한하지 않습니다. 또한, 보상 메커니즘의 다양한 종종 어려운 결과를 해석하는 있도록. 보상 효과는 어느 타이밍 유전자 발현이나 transfected 세포의 양을 제한하여 완화된 수 있습니다. 출생 후의 비 심실 microinjection 및 생체내의 electroporation의 방법은 직접 신생아 쥐 두뇌에 대한 관심의 작은 지역으로 유전자, siRNA 또는 염료 분자 타겟으로 배달을 허용합니다. 기존의 심실 사출 기술에 대조적으로,이 방법 이외의 철새 세포 유형의 transfection 수 있습니다. 방법 여기에서 설명한 방식으로 transfected 동물 생체내 이미징이나 급성 뇌 조각에 electrophysiological 실험에서 두 광자에 대한 예를 들어, 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 살아있는 쥐 두뇌의 특정 영역에 유전자 구성의 제공이 아닌 바이러스 방법을 설명합니다. 방법은 플라스미드 준비, micropipette 제조, 신생아 쥐 새끼 수술, 구조의 microinjection과로 구성되어 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt; electroporation.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

형질전환 동물의 제작은 생체 내(in vivo)에서 관심 유전자의 기능을 연구하는 표준적인 방법입니다. 그러나 많은 녹아웃 또는 형질전환 동물들이...

안녕하세요, 저는 RI Ov입니다. 그리고 저는 Alexia Ying입니다. 저희는 Cent University의 대학원생입니다. 이번 영상에서는 전뇌 조직의 특정 부위에 표적 유전자를 전달하기 위한 in vivo electroporation 방법을 소개하겠습니다.자, 살펴보겠습니다. In vivo 전기천공법은 관심 유전자나 소형 간섭 RNA를 살아있는 뇌 조직으로 전달하는 신속하고 효율적인 방법을 제공합니다.이는 형질전환 동물의 생성 및 바이러스 유전자 전달 방식에 대한 저비용의 대안을 제공합니다. 본 영상에서는 신생 쥐의 대뇌 피질에 대한 출생 후 유전자 전달의 상세 절차를 시연하겠습니다. CMV 인핸서가 포함된 치킨 beta actin 프로모터와 강화 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 사용하겠습니다.멸균 상태를 유지하고 동물의 세균 또는 진균 오염 위험을 최소화하기 위해 모든 수술 조작은 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내에서 수행합니다. 피질로의 플라스미드 전달을 위해, 전자 제어기가 포함된 WPI 마이크로 인젝터와 정위 고정 조작기(stereotactic manipulator)에 장착된 10 µL Hamilton 시린지를 사용합니다. 적색 쥐 새끼는 박스와 마스크로 구성된 마취 장치를 사용하여 마취시킵니다.그 다음, 정위 고정 장치(stereotactic manipulator)에 연결된 가열 테이블 위에서 이어 바(ear bars)를 사용하여 새끼 쥐를 고정합니다. 수술적 조작과 미세 주입 모니터링을 위해 쌍안 현미경을 사용합니다. 전기천공법(electroporation)을 위해서는 포셉 형태의 전극이 장착된 CYV 21 in vivo 전기 수술기를 사용합니다.새끼 쥐의 회복을 위해 마취 후 가온 챔버를 사용합니다. 일반적으로 200 µL 얇은 벽 튜브에 플라스미드 주입 용액 10 µL를 준비하며, 이 용액의 양은 여러 번의 실험에 충분합니다.플라스미드 용액 8 µL를 10 XPBS 1 µL 및 0.1% fast green 수용액 1 µL와 혼합합니다. 주입 용액 내 플라스미드의 최종 농도는 1~3 µg/µL 사이여야 합니다. 플라스미드 DNA 농도가 이보다 낮으면 형질전환 효율이 감소하며, 농도가 너무 높으면 점도가 지나치게 높아져 유리 모세관의 얇은 팁을 통해 주입하기 어렵습니다.유리 피펫 준비를 위해, 필라멘트가 포함된 보라실리케이트 유리 모세관과 최대 풀링 및 가열 파라미터로 설정된 수직 전극 유리 풀러를 사용합니다. 그런 다음 종이 조각을 사용하여 피펫의 끝을 부러뜨려 직경 10 to 20 µm의 팁을 만듭니다. 현미경 대물렌즈를 통해 팁의 직경과 모양을 확인합니다.얇은 폴리머 모세관을 사용하여 10 µL Hamilton 시린지 부피의 약 3분의 1을 채웁니다. 이때 기포가 생기지 않도록 미네랄 오일을 사용합니다. 그런 다음 유리 피펫을 미네랄 오일로 채우고, 이 피펫을 Hamilton 시린지에 삽입합니다.다시 한번 공기 방울이 생기지 않도록 주의합니다. 이후 유리 피펫이 장착된 시린지를 컨트롤러에 연결된 마이크로 인젝터에 고정합니다. 정위 고정 장치에 고정된 마이크로 인젝션 설정 장치를 통해 유리 피펫의 팁을 플라스미드 주입 용액이 담긴 튜브에 안전하게 담글 수 있습니다.팁이 용액 표면에 닿으면, 1~2mm 정도 더 깊게 담급니다. 그런 다음 마이크로 인젝터 컨트롤러를 사용하여 파이펫에 Injection mix를 약 1µL 채웁니다. 여기에 제시된 모든 실험은 헬싱키 대학교의 동물 실험 규정에 따라 수행되었습니다.각 실험마다 가스 밀폐형 주사기에 이소플루레인(isofluorine)을 채웁니다. 공기 흐름원(airflow source)에 연결된 마취 장치에 주사기를 고정하고, 동물이 보행하는 상태에서 정위 고정 장치(stereotactic setup)에 마스크를 고정합니다. 마취 장치에서 공기 흐름을 약 250 milliliters minute로, 이소플루레인 농도를 4%로 조절합니다. 그 후 동물 상자에 레드 팝(red pop)을 2~5분 동안 배치합니다.P의 움직임이 멈추면, 정위 고정 장치에 부착된 가열 패드 위에 놓습니다. P 머리의 주둥이 쪽(rostral part)을 마스크에 맞춥니다. 새끼 쥐가 깊은 마취 상태에 도달하는 데는 보통 5~10분이 소요됩니다.그 상태가 되면, 이소플루란 유량을 약 1.5~2%로 낮춥니다. 작은 거즈와 얇은 핀셋을 사용하여 강아지 머리의 피부를 70% 에탄올로 소독합니다. 강아지의 목덜미부터 이마까지 피부를 절개하고, 피부 조각을 옆으로 젖힌 뒤 귀 고정 바(ear bars)를 두개골의 외이도 쪽으로 살짝 밀어 넣어 머리와 피부를 고정합니다. 실체 현미경을 사용하여 두개골의 bregma 지점을 찾고, 정위 좌표를 이용해 관심 영역을 식별합니다. 주입 피펫을 이 영역 위에 위치시킨 후, 주입 용액 25~50 nanoliters를 두개골 표면에 떨어뜨려 표시합니다.현미경 하에서 고속 외과용 드릴을 사용하여 표시된 지점의 두개골을 액체가 나타날 때까지 조심스럽고 부드럽게 천공합니다. 두개골 양측에 전기천공 포셉과 전극을 고정합니다. 전도성을 높이기 위해 전도성 젤을 도포합니다.작은 탐폰을 사용하여 천공 부위의 액체 방울을 제거하고 유리 니들을 구멍에 삽입합니다. 주입 위치의 좌표에 따라, 초당 5~20 nL의 속도로 주입 용액 25~100 nL를 주입합니다. 그 후 빠르게 피펫을 제거하고 즉시 전기천공법을 진행합니다.전기천공법은 99 V의 펄스 진폭과 1 Hz의 주파수에서 50 ms 지속 시간의 펄스를 5회 가하여 수행합니다. 전극과 이어 바를 제거합니다. 둔단 및 예단 포셉과 수술용 봉합사를 사용하여 절개된 피부를 봉합했습니다.마취 후 회복을 돕기 위해 새끼 쥐를 온열 챔버에 15~30분 동안 두었습니다. 그 후 새끼 쥐를 어미의 케이지로 돌려보냈습니다. 성공적으로 형질전환된 세포에서 외래유전자의 발현은 전기천공법 시행 약 10시간 후에 나타나며, 수 주 동안 안정적으로 유지됩니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를...

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

여기서 제시된 것은 성체 제브라피쉬 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA 전달 및 에펜디모글리아 세포 라벨링을 위한 전기개공 방법이다. 이 프로토콜은 개별 ependymoglial 세포를 구상하고 추적하는 빠르고 효율적인 방법이며 광범위한 유전 조작에 전기 증시인을 적용할 수있는 새로운 가능성을 열어줍니다.

성체 얼룩말 기피 텔렌세팔론에서 플라스미드 DNA의 생체 내 전달을 위한 전기 개공 방법

본 프로토콜은 유전자 편집 및 약물 전달을 위해 신생아 마우스에서 척수강내 주사를 수행하기 위한 단계별 지침을 설명합니다.

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

학습하세요 출생 후 쥐 뇌에 비바이럴 유전자 전달 방법을. 생체 전기천공을 활용해 신경과학 연구에서 특정 뇌 영역을 효율적으로 표적화하고 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

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