유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

다음 실험의 전반적인 목표는 InVivo 모델 시스템에서 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성을 분석하는 것입니다. 이 분석법의 재현성과 상대적 단순성으로 인해 베타 아밀로이드 독성에 대한 약물, 환경 조건 또는 유전자 변형을 신속하게 테스트할 수 있습니다. 이 분석을 개발하는 데 있어 핵심 요인은 베타 아밀로이드 펩타이드의 근육 특이적 온도 유도 발현을 가진 형질전환 cl egan's worms의 생성입니다.

이러한 온도에 민감한 발현은 비정상적으로 긴 3개의 프라임 미번역 영역을 포함하는 전이유전자를 구축함으로써 설계되며, 따라서 이 전이유전자의 mRNA 감시 표적으로 만드는 전이유전자 mRNA의 발현은 전이유전자 mRNA의 분해로 인해 기능적 mRNA 감시 시스템을 갖춘 야생형 웜에서 좋지 않습니다. 이 전이유전자가 mRNA 감시 시스템의 필수 구성 요소에 돌연변이를 포함하는 유전자 배경에 도입되면 전이유전자 발현이 상당히 높아질 것입니다. 유전적 배경이 mRNA 감시 시스템에서 온도에 민감한 돌연변이를 포함하는 경우, 비허용 온도에서 이 트렌치겐 균주의 증식은 트렌치 유전자 mRNA 분해를 차단하고 이 시스템을 사용하여 베타 아밀로이드 펩타이드 온도의 체벽 근육 발현을 조절하는 높은 트렌치 유전자 발현 트렌치 생성 웜을 초래합니다. 베타 아밀로이드 펩타이드의 높은 축적은 근육 세포의 기능 장애와 시간의 웜 측정의 마

이 참호벌레의 개체군은 온도가 지나면 마비됩니다. Upshift는 베타 아밀로이드 독성에 대한 민감한 분석법입니다. 이는 마비 분석을 위한 새로운 선충 성장 배지 플레이트를 만들어 달성되며, 이는 마비 속도에 영향을 줄 수 있는 환경 변수를 최소화하는 데 도움이 됩니다.

두 번째 단계로, 트렌치제닉 웜 또는 시작된 개체군의 연령을 동기화하여 전이유전자 발현에 대한 발달 단계의 영향을 최소화합니다. 다음으로, 동기화된 세 번째 유충 단계는 섭씨 16도에서 섭씨 25도로 상향 이동하여 전이유전자 mRNA의 안정성을 높이고 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적으로 이어집니다. 각 웜에 대해 상향 이동에서 마비까지의 시간을 측정하면 근육 기능 장애의 속도를 포착할 수 있으며, 이를 통해 베타 아밀로이드 펩타이드 축적의 독성 효과를 분석함으로써 내인성으로 발현된 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성에 대한 특정 치료의 효과를 보여주는 결과를 얻을

따라서 약물 활성을 분석하기 위해 형질전환 마우스 모델을 사용하는 것과는 대조적으로 우리 기술의 주요 장점은 훨씬 더 빠르고 훨씬 저렴하게 수행할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 마비 분석에서 L 4개의 벌레를 채점하는 것은 배우기가 매우 어렵습니다.

따라서 마비된 L 4 웜을 득점할 때 보고 싶은 것은 웜의 머리 부위의 고립된 헤일로 움직임입니다. 일단 그것이 움직이고 벌레의 몸 전체가 마비되면, 우리는 그 벌레가 마비된 것으로 점수를 매길 것입니다. 마비 에세이는 CL egan의 증식 및 유전학에 일상적으로 사용되는 표준 선충 성장 배지 또는 NGM의 플레이트에서 수행됩니다.

플레이트를 준비하려면 삼각 플라스크에 염화나트륨, 한천 및 펩타이드를 함유한 NGM 용액인 오토클레이브를 준비한 다음 함께 제공되는 서면 프로토콜에서 찾을 수 있는 다음 멸균 용액을 적절한 양으로 첨가합니다. 각 60mm x 15mm 페트리 접시에 10ml의 액체 NGM을 분취합니다. NGM이 실온에서 밤새 응고되도록 합니다.

화합물 또는 추출물의 효과를 테스트하는 경우 추출물을 각 플레이트에 분취하고 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 고르게 분포시킵니다. 접시를 실온에서 밤새 말리십시오. 1밀리리터 이상의 부피는 건조하는 데 더 많은 시간이 필요합니다.

다음으로 LB 배지에서 하룻밤 동안 0.4 - 0.6의 광학 밀도로 성장한 250마이크로리터의 대장균 균주 OP 50이 있는 각 플레이트를 찾아 박테리아가 실온에서 밤새 건조되도록 합니다. 플레이트의 수명은 마비 속도에 상당한 영향을 미치며, 따라서 오래된 플레이트는 건조되는 경향이 있습니다. 플레이트는 마비 분석 후 1주일 이내에 부어야 합니다.

이상적으로는, 모든 실험에 사용되는 동기식 달걀 낳기 3-4일 전에 부어진 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 모든 플레이트는 모두 잔디밭의 크기를 변경하는 동일한 배치에서 나와야 하며, 그렇지 않으면 박테리아도 벌레의 행동을 변경해야 합니다. 마비 분석은 대체 대장균 균주를 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어, HT one 15는 RNAi 실험에 사용됩니다. 그러나 이는 마비 분석의 역학을 변화시킬 수 있습니다.

따라서 적절한 Strain인 내부 제어 장치를 사용해야 합니다. CL 476은 베타로 인한 마비를 분석하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 균주 및 기타 형질전환 모델은 Saint Ahadi Genetic Center에서 소액의 비용으로 학술 연구자에게 제공됩니다.

테스트 모집단의 연령 동기화를 최대화하려면 이것이 바람직합니다. 동기화된 부모 세대로 시작하십시오. 테스트 집단에 대한 마비 분석을 시작하기 일주일 전에 백금 지렁이 피커를 사용하여 20-30명의 무덤 성체를 여러 개의 10cm NGM 플레이트로 옮깁니다.

OP 50으로 CL 4 1 76의 허용 온도인 섭씨 16도에서 2시간 동안 알을 낳습니다. GR 성충을 제거하고 자손이 7일 동안 자라도록 하면 두 번째 날 무덤 성인이 됩니다. 둘째 날 중력.

성인은 각 실험 조건에 대한 연령 동기 테스트 모집단을 준비하는 데 사용됩니다. 목적은 백금 웜 피커를 사용하여 50-75 개의 나이 동기 웜을 포함하는 삼중 플레이트를 생성하는 것입니다.하루 중 10-12 명을 OP 50으로 발견 된 60mm NGM 플레이트로 2 명의 더 큰 성인을 전송합니다. 벌레가 섭씨 16도에서 2시간 동안 알을 낳도록 한 다음 성충을 골라내고 알이 부화하여 섭씨 16도까지 자라도록 합니다.

이 시점에서는 플레이트에 점수를 매기지 않을 사람이 점수를 매겨 점수가 실험 조건에 대해 알 수 없도록 코드를 작성하는 것이 가장 좋습니다. 알을 낳을 때의 배아 발달 단계, 즉 최적의 조건에서 야생형 기생충의 경우 약 26 세포 단계는 성체의 나이와 영양 상태에 따라 달라지는 기능입니다. 알을 낳는 데 사용되는 중력 성체가 더 나이가 많거나 굶주린 경우 나중에 단계화된 알을 낳고 동기 개체군을 달성하지 못하여 마비 분석의 동역학에 영향을 미칩니다.

모든 종류의 박테리아 오염이 이 분석에 심각한 영향을 미칠 수 있으므로 대장균, OP 50과 같은 단일 유전자 박테리아 배양을 사용하는 것이 필수적입니다. 삼중 플레이트에 비슷한 수의 벌레가 있는 경우 재현성이 가장 높습니다.전이유전자를 유도하고 마비 분석을 수행합니다. 플레이트를 섭씨 25도로 상향 변속합니다.

동기식 알이 끝난 후 48시간이 지나면 기생충은 세 번째 유충 단계에 있어야 합니다. 플레이트는 플레이트가 이 온도에 도달할 수 있도록 섭씨 25도의 인큐베이터에 쌓이지 않고 배열해야 합니다. 동시에, 상향 이동이 시작된 후 18-20 시간에 벌레의 마비를 점수 매기기 시작하십시오.

이 시점에서 개체군의 모든 벌레는 네 번째 유충 단계에 도달해야 하며, 각 판의 모든 벌레가 마비될 때까지 2시간 단위로 계속 점수를 매겨야 합니다. 알 수 없는 이유로, 마비는 몸 전체에 걸쳐 일어나지 않는다. 머리 부분은 지렁이가 움직임을 멈추는 마지막 부분입니다.

따라서 최근에 마비를 시작한 기생충은 판을 가로질러 이동할 수 없지만 머리를 움직일 수 있으므로 앞쪽 주위의 박테리아를 제거하고 제거된 박테리아의 후광을 남길 수 있습니다. 이 벌레는 항상 완전히 마비되므로 후광이 있는 벌레는 마비된 것으로 특징지어집니다. 일부 벌레는 후광이 없지만 자발적인 움직임을 보이지 않습니다.

이것들은 웜 피커로 찌르는 것으로 테스트됩니다. 찌르는 벌레가 찌르는 시 전신 파동 전파를 겪을 수 없는 경우, 효율적인 득점을 위해 마비된 것으로 점수가 매겨집니다. 마비된 웜을 플레이트의 발견되지 않은 구역으로 이동하여 다음 득점 기간에 의도치 않게 다시 득점되지 않도록 하는 것이 가장 쉽습니다.

이것은 또한 잘못 분류된 웜이 움직임을 보여줄 수 있도록 하여 점수 보정을 통해 마비 곡선을 생성할 수 있습니다. 각 시점에서 마비되지 않은 각 플레이트의 웜 비율은 백분율로 변환되고 평균 비교할 수 없는 백분율은 상향 이동이 시작된 시점부터의 시간에 대해 표시됩니다. 결과 곡선은 공식적으로 생존 곡선과 유사하므로 표준 비모수 생존 통계량을 사용하여 분석할 수 있습니다.

형질전환 myo three A 베타 웜의 상향 이동은 마비가 시작되기 위해 L 4단계 중반까지 수행되어야 합니다. Myo three promoter는 발달적으로 조절됩니다. 기생충이 L 4세 후반 또는 성충이 되면 발현 수준이 현저히 감소합니다.

기생충이 굶주리면 전이유전자의 발현이 차단되므로 실험 내내 기생충에게 충분한 먹이를 주는 것이 매우 중요합니다. 우리는 마비된 벌레가 어떤 조건에서도 회복되는 것을 관찰한 적이 없습니다. 12-16시간의 상향 변속 후 CL 41 76은 마비되며, 변형으로 16도로 하향 이동하더라도 마비를 유발하는 전이유전자 발현의 CL 41 76 상향 조절이 더 낮은 온도에서 발생할 수 있습니다.

그러나 마비 속도는 타이밍에 영향을 받는다는 점에 유의하십시오. 마비 속도는 사용된 특정 전이유전자 균주에 따라 다릅니다. 당사는 CL 41 76보다 마비 속도가 빠르거나 느린 myo three A 베타 균주를 구성했으며, 이에 따라 마비 분석에 대한 스코어링 창을 조정해야 합니다.

여기에 표시된 것은 치료되지 않고 6.27 밀리몰 카페인에 노출된 CL 4 1 76에 대한 마비 곡선 그래프입니다. 이 치료법은 약 4시간의 마비 지연을 통계적으로 매우 유의하게 초래하며, 이는 베타 독성의 억제를 나타내는 것으로 해석됩니다. 이 모델에서이 실험은 커피에서 발견되는 또 다른 화합물의 효과를 분석했습니다.

이 플롯은 베타 독성에 영향을 미치지 않는 치료에 대해 일반적입니다. 두 실험 모두에서 처리되지 않은 CL 4 1 76 집단의 약 절반이 24시간에 마비되고 28시간까지 마비가 완료됩니다. 이것은 통제 마비의 전형적인 시간대입니다.

CL 4 1 7 6 개체군에서 이 시기에서 현저한 편차는 환경 조건의 변화 또는 전이유전자 사본의 자발적인 결실을 나타냅니다. 균주 CL 4 1 76에 대한 추가 정보는 동봉된 프로토콜을 참조하십시오. 이 절차를 시도하는 동안 판의 나이, 지렁이 개체군의 단계, 지렁이의 마비 속도를 점수화할 수 있는 능력을 염두에 두는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이 sea elgan 시스템을 사용하여 베타 아밀로이드 독성을 신중하게 분석하는 방법을 잘 알게 될 것입니다. 다양한 환경 또는 약물 치료의 이러한 독성에 대한 매우 미묘한 영향을 감지할 수 있어야 합니다. 우리가 이야기한 변수들은 주의를 기울여야 하는 중요한데, 그 이유는 이렇게 하면 매우 재현성 있고 일관된 마비 역학으로 분석을 수행할 수 있기 때문입니다.

이것은 실제로 실험실에서 다른 시간에 다른 사람들이 수행한 결과를 비교하거나 이 모델 시스템을 사용하는 다른 연구자와 결과를 비교하려는 경우 매우 중요합니다.