Name: 유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 학습하세요 C. elegans를 이용한 β-아밀로이드 독성 분석 방법을. 온도 유도형 근육 특이 발현 시스템으로 마비 표현형을 측정하여 알츠하이머병 관련 신경퇴행 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 프로토콜을 개발하는 데 도움 특히, 여기 원래 프로 시저를 개발 긴 폰트를 설명하는 링크 실험실의 현재와 전 회원에게 감사를 표합니다. 이 작품은 CDL에 NIH (AG12423) 및 알츠하이머 협회 (제니스 대상)에서 수상에 의해 지원되었습니다

1) 마비 분석에 대한 선충류 성장 미디어 번호판을 준비. 마비의 assays는 정기적으로 C.에 사용되는 표준 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 수행됩니다 엘레간스 전파 및 유전학 (Stiernagle, 2006). <ol><li> NaCl, Erlenmeyer 플라스크에 아가르 및 펩톤가 포함된 NGM 솔루션을 압력솥 및 살균 CaCl 2, 유라실, 콜레스테롤, 1M MgSO 4와 1M KPO 4의 적절한 금액을 추가합니다. 각 60mm X 15mm 페트리 접시에 액체 NGM의 나누어지는 10 ML. NGM는 실온에서 하룻밤 응고 수 있습니다. </li><li> 각 플레이트에 화합물 / 추출, 나누어지는 추출물의 효과에 대한 테스트 및 균일하게 접시의 표면에 걸쳐 추출을 배포하는 확장기를 사용하는 경우. 실온에서 하룻밤 건조 추출 수 있습니다. 1 ML 이상의 볼륨은 건조 시간이 더 필요합니다. </li><li> E. 250 μL와 각각의 접시 스팟 콜리 변형 OP5O는 0.4-0.6의 광학 밀도에 대한 야간 LB 미디어 재배. 박테리아가 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 관련 변수 접시의 나이는 나이가 접시 밖으로 건조하는 경향으로 마비 분석에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 사용 번호판 마비가 분석 한 주일 이내에 부어. 이상의 결과를 얻으려면, 3-4일 [(2) 아래 참조] 동기 웜 인구의 개시 전에 접시를 붓는다. 모든 실험은 같은 배치에서 부어 접시만을 사용합니다. 잔디밭의 크기 (즉, 발견 대 보급) 및 / 또는 박테리아의 종류를 변경하면 벌레의 동작을 변경합니다. 마비의 assays는 대체 E.를 사용하여 수행할 수 음식 소스 (예 : RNAi 실험을 먹이에 사용되는 HT115 변형)하지만,이 때문에 적절한 내부 통제가 필요 마비의 속도론을 변경할 수있는 대장균의 변종. 연령 동기 웜 인구 2) 준비 스트레인 CL4176 (smg - 1 (cc546 TS) I; dvIs27 [묘는 - 3 /는 Aβ minigene는 + rol - 6 (su1006) 마커 유전자]는 X 가장 일반적으로 Aβ 유발 마비 시금에 사용이 부담 및 기타 유전자 변형 모델을 사용할 수 있습니다. Caenorhabditis 유전학 센터 (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)에서 소정의 수수료 학술 연구자 수 있습니다. <ol><li> 그것이 동기 부모 세대와 함께 시작하는 것이 바람직합니다 테스트 인구의 연령 synchrony을 극대화합니다. 주일 전에는 시험 인구의 마비 분석을 시작, 16 시에 누워 2 시간 달걀에 대한 OP50로 확산 여러 10cm의 NGM 플레이트에 20-30 gravid 성인 전송하는 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 ° C (CL4176에 대한 허용 온도 ). gravid 어른을 제거하고 자손 어떤 시간에 그들이 gravid 성인 "두번째 날"될 것입니다 7 일 동안 성장할 수 있습니다. </li><li> (1 일) 두 번째 일 gravid 성인 연령 동기 테스트 인구를 준비하는 데 사용됩니다. 각 실험 조건에 대해 개체가 50-75 연령 동기 벌레가 들어있는 세중의 플레이트를 생성하는 것입니다. 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 OP50와 함께 발견 60mm (10 ML 볼륨) NGM 플레이트에 2 일 gravid 성인의 10-12를 전송할 수 있습니다. 웜은 다음 어른을 선택하고 계란이 부화 수 있도록 16에서 성장, 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 낳기 위해 ° C. 허용 이 시점에서 그것을 코드에 번호판을 채점하지 않습니다 누군가를 위해 최상이고, 득점은 실험 조건에 장님이 될 것입니다. </li></ol> 관련 변수 계란이 여자랑 아르 배아 발달의 단계 (~ 최적의 조건 하에서 야생 타입 벌레에 대한 26 세포 단계)가 성인 연령과 영양의 기능입니다. 테스트 인구의 준비에 사용되는 gravid 성인 나이가 아니면 굶어 죽었을 경우, 나중에 무대 달걀은 인구 및 마비의 속도론의 재현성의 나이 synchrony 감소 마련됩니다. 그것은 문화가 (미생물 오염이 심각한이 분석에 영향을 줄 수 있습니다) 사용되는 모노 axenic (즉, 전용 OP50 박테리아)보다 필수적이며, 세중의 플레이트는 벌레 비슷한 숫자가있는 경우 재현성이 높은 것입니다. 3) Transgene 유도 및 마비 분석 <ol><li> (3 일) 25 Upshift 번호판 ° C 48 시간 동기 계란의 끝 이후에 누워, 벌레는 세 번째 단계 애벌레 (L3)에 있어야합니다. 접시는 모든 접시가 동시에 25 ° C에 도달 수 있도록 25 ° C 배양기에서 스태킹없이 배치하여야한다. </li><li> (주 4) upshift의 개시 후 18-20 시간에 벌레의 마비 (변형 CL4176)를 채점 시작합니다. 이 시점에서, 인구의 모든 벌레는 네 번째 애벌레 (L4) 단계에 도달한다. 접시의 각 모든 벌레가 마비가 될 때까지 두 시간 단위로 계속 점수. 알 수없는 이유로 마비도 신체의 길이에 걸쳐되지 않습니다 머리 지역은 이동 중단에 대한 웜의 마지막 부분입니다. 따라서, W최근 마비를 시작했습니다 옴스은 접시를 통해 번역할 수는 없지만,이를 통해 자신의 앞쪽에 주변 박테리아를 지우고 삭제 박테리아의 "후광"를 떠나, 그들의 머리를 이동할 수 있습니다. 이 벌레는 결국에 완전히 마비 될 것입니다, 그리고 마비로 따라서 halos과 벌레가 분류됩니다. 일부 웜은 halos을하지 않습니다뿐만 아니라 자발적인 움직임을 보이지 않습니다, 이러한 웜 따는로 괴롭히는하여 테스트합니다. prodded 웜이 괴롭히는시 몸 전체에 웨이브 전파를 받아야 수없는 경우 마비로, 그것도 점수입니다. 효율적인 채점을 위해, 그것은 그들이 실수로 다음 채점 기간을 rescored되지 않습니다 않도록 접시의 얼룩이없는 분야에 마비가 벌레를 이동하는 가장 쉬운 방법입니다. (이 또한 점수 정정을 허용함으로써, 잘못 분류 웜은 움직임을 보여줄 수 있습니다.) </li><li> 마비 곡선을 생성하려면 각 시점에 마비되지 않은 각 접시에 벌레의 분율은 비율로 변환되며, 평균 "unparalyzed"비율 upshift 개시부터 시간이 역모를 꾸몄다입니다. (이 방식으로 음모를 꾸미고에 대한 근거는 결과 곡선은 생존 곡선을 공식적으로 유사하고, 따라서 표준이 아닌 파라메 트릭 생존 통계를 사용하여 분석할 수있다.) </li></ol> 관련 변수 그들이 묘 - 3 발기인이 발달 규제로 시작되어야하고, 상당히 늦은 L4 또는 성인 웜의 표현을 감소했습니다 마비에 대한 중간 L4 단계에 도달하기 전에 유전자 변형 myo-3/Aβ의 웜의 upshift가 발생합니다. 마찬가지로,이 transgene 표현이 웜은 굶어 될 경우 차단하므로 벌레들이 실험을하는 동안 잘 공급되는 필수입니다. 그들이 16 ° C.에 downshifted 경우에도, 우리는 어떠한 조건에서 복구하기 마비 벌레 관찰 적이 있고, upshift의 12-16 시간 후, 모든 CL4176 벌레가 마비됩니다 변형 CL4176에서 transgene 표현의 충분한 upregulation 마비의 타이밍이 변경될 수 있지만 마비 (즉, 20-25 ° C) 낮은 온도에서 발생할 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 마비의 비율이 사용하는 특정 유전자 변형 응력 (우리가 CL4176보다 빠르고 느린 속도 모두 myo-3/Aβ 변종을 만들었다는)에 의존하므로 다른 변종으로 점수 창이 조정해야 할 수도 있습니다. 4) 대표 결과 치료과 카페인 6.27 MM (NGM 플레이트에 최종 농도)에 노출 모두에 대해 CL4176 마비 곡선의 플롯은, 그림 1에 표시됩니다. 이 치료 우리가이 모델의 Aβ 독성의 억제 기준으로 나타내는 해석 약 4 시간의 마비에 높은 통계적으로 의미있는 지연을 초래합니다. 그림 2에 표시된 것은 cafestol, 커피에있는 다른 화합물의 효과를 시금 독립적인 실험이다. 이 음모는 Aβ 독성에 영향을주지 않습니다 치료에 대한 일반적입니다. 두 실험의 절반에 대한 치료 CL4176 인구가 24 시간에서 마비 및 마비 28 시간으로 완료됩니다. 이러한 제어 CL4176 인구의 마비에 대한 전형적인 timeframes 있습니다. 이시기의 중요한 편차는 변경 환경 조건이나 transgene 사본의 자발적인 삭제 나타내는 있습니다. (CL4176은 myo-3/Aβ transgene의 복사본이 여러 개있는 chromosomally 통합 유전자 변형 배열이 포함되어 있습니다.이 유전자 변형 배열이 정상적으로 상당히 안정이지만, 온도에서 변형의 전파는&gt; 16 ° C는 A를받은 희귀한 벌레에 대한 선택합니다 Aβ 표현과 느린 마비 결과를 감소해야합니다 변종의​​ 발생 transgenes의 자발적인 삭제,.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. CL4176 웜 치료 또는 6.27 MM의 카페인 (시그마)에 노출 변형율에 대한 마비의 ​​곡선. 표시된 시간은 온도 upshift의 개시부터입니다. 오류 바 = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 0.48 MM cafestol (시그마)에 노출 CL4176 벌레에 대한 마비 커브. 오류 바 = SEM

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 설명이 프로토콜은 효율적으로 분석 Aβ 독성에 대한 화합물의 효과를 위해 사용될 수 있습니다. 게시 예제는 징코 빌로바 추출물의 성분의 영향 (우 외. 2006)과 reserpine을 (아리아 외. 2009 년) 등이 있습니다. 다른 시스템에서 Aβ 독성에 대한 보호되었습니다 화합물도 (예, memantine, 우리되지 않은 결과)이 모델에서 보호하는 표시되었습니다. 이 모델 수립을위한 중요한 근거는 C.에서 잘 개발된 유전자와 분자 도구를 사용할 수 있습니다 엘레간스는 Aβ 독성의 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 Aβ 독성에 미치는 영향 특정 돌연변이 (예, DAF - 2 손실 기능 돌연변이, Florez - 매클루레 외. 2007 년 도입하여 신호와 같은 인슐린을 줄이는 효과) assayed,이 모델은 또한 수 있습니다 과잉 표현 transgenes (폰트 외. 2008)의 영향을 조사하는 데 사용됩니다. 우리는 최근 Aβ의 단일 아미노산 대체 (게시되지 않은 데이터)의 독성에 미치는 영향을 조사하기 위해이 모델의 광범위한 사용을 만들었습니다. 유전자 변형 모델은 assays에게 여기에 근육 세포 기능에 급성 Aβ 표현의 효과를 설명했다. 마비 근육 세포 및 sarcomere 시에 손상되며, 마비의 표현형 근육 세포 사망의 결과 없습니다. 그러나, 마비 후 (초기 upshift 후 ~ 48 시간) 근육 무결성 및 웜의 최종 죽음의 고장이 있습니다. 우리는 Aβ 표현이 다운 스트림 효과를 조사하거나 독성 표지로 사용하지 않았습니다. 여기에 설명된 inducible의 Aβ 표현 모델은 글 β - 아밀로이드 형성을 조절 치료를 조사에 적합하지 않습니다. 제정 Aβ 표현 양식을 쉽게 감지 아밀로이드 침전물과 함께 유전자 변형 벌레가지만 (.. 페이 외 1998; 링크 외 2001), inducible의 Aβ의 표현과 함께 유전자 변형 벌레 거의 아밀로이드 침전물이없고 마비의 표현형은 아밀로이드 증착 (드레 이크 외 독립 나타납니다. 2003). 결과는보기와 일치하는 가용성 oligomeric Aβ의 축적이 아니라 아밀로이드 증착에서 유도 Aβ 표현 결과의 급성 독성.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> Quantity/2L </td><td> 회사 소개 / 카탈로그 # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ S9888 </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 40g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ A7002 </td><td></td></tr><tr><td> 펩톤 </td><td> 5g </td><td> 시그마 - 알드리치 /​​ P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 147.02mg/mL </td></tr><tr><td> 유라실 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 2mg/mL </td></tr><tr><td> 콜레스테롤 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 에탄올의 5mg/mL (압력솥하지 않음) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> ddH 2 O에서 246.5mg/mL </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ddH 2 O, 산도의 ML, 48mg K2HPO4/mL </td></tr><tr><td> Erlenmeyer 플라스크 </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 c. 엘레간스 모델

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

β - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 축적은 일반적으로 알츠하이머 질병의 유도 중심으로 생각하지만, 독성의 관련 메커니즘 (들)은 아직 명확하지가있다는거다. Aβ는 또한 포함 바디 Myositis, 심한 인간 myopathy에 intramuscularly 입금됩니다. 강렬한 공부 선충류 웜 Caenorhabditis의 엘레간스는 transgenically 인간의 Aβ를 표현하기 위해 설계하실 수 있습니다. Aβ 표현의 조직이나 타이밍에 따라, 유전자 변형 벌레는 Aβ 독성의 읽기 아웃 역할을 쉽게 측정 phenotypes 수 있습니다. 세스 외, 예를 들어, 범 -의 연결 Aβ 표현과 함께 유전자 변형 벌레가 제정 근육 특정 표현과 함께 유전자 변형 웜은 프로 그레시브, 나이에 의존 마비의 표현형을 (링크 1995 표시하면서 결함이 연관 학습 (. Dosanjh 외 2009)입니다했습니다 . 2006). 하나는 특히 유용 C. 엘레간스 모델은 온도 upshift (링크 외. 2003)에 재현할 마비의 표현형의 결과, Aβ transgene의 온도 inducible 근육 표현을 엔지니어로 mRNA 감시 시스템의 온도에 민감한 돌연변을 사용합니다. 이 모델에서 카운터 Aβ 독성이 [예, 보호 transgene (핫산 외. 2009)의 표현이나 징코 빌로바 추출물 (우 외. 2006)에 노출] reproducibly 이러한 유전자 변형의 온도 upshift에 의해 유도된 마비의 속도를 변경할 것을 처리 웜. 여기 우리는이 유전자 변형 C.에 마비의 속도를 측정을위한 프로토콜을 설명 이 측정에 영향을 미칠 수 실험 변수에 특히주의와 엘레간스 모델.

강렬한 공부 선충류 벌레<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt;는 transgenically 인간 β - 아밀로이드 펩타이드를 (Aβ) 표현하는 설계하실 수 있습니다. 의 Aβ의 유도 표현<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 근육은 Aβ 독성을 조절 치료를 모니터링하는 데 사용할 수있는 신속하고 재현할 마비의 표현형로 ​​연결됩니다.

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

&beta;-아밀로이드 펩타이드(A&beta;)의 축적은 일반적으로 알츠하이머병 유발의 핵심으로 여겨지나, 관련된...

다음 실험의 전반적인 목표는 InVivo 모델 시스템에서 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성을 분석하는 것입니다. 이 분석법은 재현성이 높고 상대적으로 간단하여 베타 아밀로이드 독성에 대한 약물, 환경 조건 또는 유전자 변형을 빠르게 테스트할 수 있습니다. 이 분석법 개발의 핵심 요소는 베타 아밀로이드 펩타이드의 근육 특이적 온도 유도성 발현이 가능한 형질전환 cl egan's worms를 생성하는 것입니다.이 온도 민감성 발현은 비정상적으로 긴 3' 비번역 영역(untranslated region)을 포함하는 외래유전자를 구축하여, 외래유전자 mRNA가 mRNA 감시 체계의 표적이 되도록 설계되었습니다. 따라서 mRNA 감시 체계가 정상적으로 작동하는 야생형 벌레에서는 외래유전자 mRNA의 분해로 인해 해당 외래유전자의 발현이 낮게 나타납니다. 만약 이 외래유전자가 mRNA 감시 체계의 필수 구성 요소에 돌연변이가 있는 유전적 배경으로 도입되면, 외래유전자의 발현이 현저히 높아집니다. 유전적 배경에 mRNA 감시 체계의 온도 민감성 돌연변이가 포함되어 있다면, 비허용 온도에서 이 외래유전자 도입 균주를 증식시킬 때 외래유전자 mRNA의 분해가 차단되어 높은 외래유전자 발현이 유도됩니다. 이 시스템을 이용하여 체벽 근육에서 베타 아밀로이드 펩타이드의 발현을 조절하는 외래유전자 도입 벌레의 경우, 온도를 16 °C에서 25 °C로 올리면 베타 아밀로이드 펩타이드가 다량 축적되어 근육 세포의 기능 장애와 벌레의 마비가 발생하며, 그 소요 시간을 측정합니다.온도 상승 후 이러한 형질전환 벌레 집단이 마비되는 데 걸리는 시간을 측정하는 것은 베타 아밀로이드 독성에 대한 민감한 분석법입니다. 이는 마비 분석을 위해 신선한 nematode growth media 플레이트를 제작함으로써 달성되며, 이를 통해 마비율에 영향을 줄 수 있는 환경 변수를 최소화할 수 있습니다.두 번째 단계로, 연령이 동기화된 트랜스제닉(transgenic) 벌레 집단을 준비하며, 이는 발달 단계가 트랜스진 발현에 미치는 영향을 최소화하기 위함입니다. 다음으로, 동기화된 3기 유충(third larval stage)을 16 °C에서 25 °C로 온도를 높여 트랜스진 mRNA의 안정성을 높이고 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적을 유도합니다. 각 벌레의 온도 상승 시점부터 마비가 일어날 때까지의 시간을 측정하여 근육 기능 장애의 속도를 파악함으로써, 베타 아밀로이드 펩타이드 축적의 독성 효과를 분석합니다. 이를 통해 내인성으로 발현된 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성에 특정 처리가 미치는 영향에 대한 결과를 얻습니다.약물 활성을 분석하기 위해 형질전환 마우스 모델을 사용하는 것과 비교했을 때, 저희 기술의 주요 장점은 훨씬 더 빠르게 그리고 훨씬 더 저렴한 비용으로 수행할 수 있다는 점입니다. 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 마비 분석 실험에서 L4 단계 벌레의 점수를 매기는 법은 익히기가 매우 어렵기 때문입니다.따라서 마비된 L4 단계의 벌레를 평가할 때는 벌레 머리 부분의 분리된 후광 운동(halo movement)을 관찰해야 합니다. 벌레의 전신은 마비된 상태에서 머리 부분만 움직이는 경우, 해당 벌레를 마비된 것으로 판정합니다. 마비 분석법은 C. elegans의 증식 및 유전학 연구에 일상적으로 사용되는 표준 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 수행됩니다.플레이트를 준비하려면 염화나트륨, 한천, 펩타이드가 포함된 NGM 용액을 삼각 플라스크에 넣고 오토클레이브로 멸균한 후, 동봉된 서면 프로토콜에 기재된 적절한 양의 멸균 용액들을 추가합니다. 액상 NGM 10 milliliters를 60 millimeter by 15 millimeter 페트리 접시에 각각 분주합니다. NGM이 실온에서 하룻밤 동안 굳도록 둡니다.화합물이나 추출물의 효과를 테스트하는 경우, 추출물을 각 플레이트에 분주하고 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 고르게 도포합니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다. 1 mL 이상의 부피는 건조하는 데 더 많은 시간이 소요됩니다.다음으로, LB 배지에서 하룻밤 동안 배양하여 광학 밀도(optical density) 0.4에서 0.6이 된 E. coli strain OP 50 250 µL를 각 플레이트에 스팟팅하고, 상온에서 하룻밤 동안 박테리아를 건조시킵니다. 플레이트의 제작 시점은 마비율에 상당한 영향을 미치며, 오래된 플레이트일수록 건조해지는 경향이 있습니다. 플레이트는 마비 분석(paralysis assay) 실시 전 1주일 이내에 제작해야 합니다.이상적으로는 동기화된 산란을 위해 3~4일 전에 배양된 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 실험에 사용되는 모든 플레이트는 동일한 배치에서 준비되어야 하며, 로(lawn)의 크기나 박테리아를 변경하면 벌레의 행동 또한 변하게 됩니다. 마비 분석은 다른 E. coli 균주를 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어, RNAi 실험에서는 HT115가 사용됩니다. 하지만 이는 마비 분석의 역학을 변화시킬 수 있습니다.따라서 해당 균주에 적합한 내부 대조군을 사용해야 합니다. beta 유도 마비를 분석하는 데에는 CL 476 균주가 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 균주와 다른 형질전환 모델들은 Saint Ahadi Genetic Center에서 소정의 비용으로 학술 연구자들이 이용할 수 있습니다.시험 집단의 연령 동기화를 최대화하기 위해, 동기화된 부모 세대부터 시작하는 것이 바람직합니다. 시험 집단의 마비 분석을 시작하기 일주일 전, 백금선 웜 피커를 사용하여 성체 20~30마리를 여러 개의 10 centimeter NGM 플레이트에 옮깁니다.CL 4 1 76의 허용 온도인 16 °C에서 2시간 동안 OP 50과 함께 도말하여 알을 낳게 합니다. GR 성체를 제거하고 후손이 7일 동안 성장하도록 하며, 이 시점이 되면 이들은 2일 차 중년 성체가 됩니다. 2일 차 중년 성체.각 실험 조건에 맞는 연령 동기화된 테스트 집단을 준비하기 위해 성체 웜을 사용합니다. 목적은 백금선 웜 피커를 사용하여 연령이 동기화된 웜 50~75마리가 포함된 플레이트를 3반복으로 제작하는 것입니다. 1~2일 된 성체 웜 10~12마리를 OP 50이 도말된 60 mm NGM 플레이트로 옮깁니다. 웜이 16 °C에서 2시간 동안 알을 낳도록 한 다음, 성체를 제거하고 알이 16 °C에서 부화하여 성장하도록 합니다.이 단계에서는 플레이트를 평가하지 않을 사람이 코딩을 수행하여 평가자가 실험 조건을 알 수 없도록 블라인드 처리하는 것이 가장 좋습니다. 알이 산란되는 배아 발달 단계(최적 조건의 야생형 벌레의 경우 약 26 세포 단계)는 성체의 연령과 영양 상태에 따라 달라집니다. 산란에 사용된 성체가 너무 오래되었거나 굶주린 상태라면 더 후기 단계의 알이 산란되어 동기화된 개체군을 형성할 수 없으며, 이는 마비 분석의 역학에 영향을 미치게 됩니다.어떠한 종류의 세균 오염이라도 이 분석에 심각한 영향을 미칠 수 있으므로, e coli OP 50과 같은 단일 균주 세균 배양물을 사용하는 것이 필수적입니다. 삼중 반복 플레이트의 벌레 수가 비슷할 때 재현성이 가장 높습니다. 트랜스진을 유도하고 마비 분석을 수행하려면, 플레이트의 온도를 25 °C로 올리십시오.동기화된 산란이 끝난 지 48시간 후에 벌레는 3단계 유충 상태여야 합니다. 플레이트가 이 온도에 도달할 수 있도록 25 °C 인큐베이터에 겹치지 않게 배치하십시오. 동시에, 온도 상승이 시작된 후 18~20시간부터 벌레의 마비 상태를 점수화하기 시작하십시오.이 시점에서 집단의 모든 벌레는 4단계 유충 단계에 도달해야 하며, 각 플레이트의 모든 벌레가 마비될 때까지 2시간 간격으로 측정을 계속하십시오. 알 수 없는 이유로 마비는 몸 전체에 걸쳐 균일하게 일어나지 않습니다. 머리 영역은 벌레의 움직임이 가장 마지막으로 멈추는 부분입니다.따라서 최근에 마비가 시작된 벌레는 플레이트 전체를 가로질러 이동할 수는 없지만, 머리를 움직일 수는 있으며, 이에 따라 전단부 주변의 박테리아를 제거하여 박테리아가 제거된 헤일로(halo)를 남기게 됩니다. 이러한 벌레들은 예외 없이 완전히 마비되므로, 헤일로가 있는 벌레는 마비된 것으로 간주합니다. 일부 벌레는 헤일로가 없으면서 자발적인 움직임 또한 보이지 않을 수 있습니다.웜 피커(worm picker)로 자극하여 이를 테스트합니다. 자극을 받은 웜이 전신 파동 전파(full body wave propagation)를 일으키지 못하는 경우, 효율적인 점수 산정을 위해 마비된 것으로 판정합니다. 마비된 웜을 플레이트의 표시되지 않은 구역으로 이동시키면, 다음 판정 기간에 실수로 다시 점수가 매겨지는 것을 방지할 수 있어 편리합니다.이는 잘못 분류된 벌레들이 움직임을 보일 수 있게 하여, 점수 교정을 통해 마비 곡선을 생성할 수 있도록 합니다. 각 시점에서 각 플레이트 내 마비되지 않은 벌레의 분율을 백분율로 변환하며, 평균 비마비 백분율을 온도 상승(upshift)이 시작된 시점부터의 시간으로 도식화합니다. 결과적으로 생성된 곡선은 형태적으로 생존 곡선과 유사하므로 표준 비모수 생존 통계법을 사용하여 분석할 수 있습니다.마비가 시작되려면 형질전환 myo-3 A$\beta$ 벌레의 상향 이동(upshift)을 L4 단계 중반까지 완료해야 합니다. Myo-3 프로모터는 발달 과정에 따라 조절됩니다. 벌레가 L4 후기 또는 성체 단계에 도달하면 발현 수준이 현저히 감소합니다.웜이 굶게 되면 외래 유전자의 발현이 차단되므로, 실험 전 과정 동안 웜에게 충분한 먹이를 제공하는 것이 매우 중요합니다. 마비된 웜이 어떤 조건에서도 회복되는 사례는 관찰된 적이 없습니다. Upshift 후 12~16시간이 지나면 CL 41 76은 마비되며, 설령 온도를 16°C로 downshift 하더라도 마비가 일어납니다. CL 41 76 균주에서는 마비를 유발하는 외래 유전자의 발현 상향 조절이 더 낮은 온도에서도 발생할 수 있습니다.하지만 마비율의 발생 시점에는 차이가 있을 수 있음을 유의하시기 바랍니다. 마비율은 사용되는 특정 트랜스진 계통에 따라 달라집니다. 본 연구진은 CL 41 76보다 마비율이 더 빠르거나 느린 세 가지 myo A beta 계통을 제작하였으므로, 이에 맞춰 마비 분석의 평가 시간 범위를 조정해야 합니다.여기에 처리하지 않은 군과 6.27 millimolar caffeine에 노출시킨 군 모두에 대한 CL 4 1 76의 마비 곡선 그래프가 제시되어 있습니다. 이러한 처리는 마비 시점을 약 4시간 정도 상당히 통계적으로 유의미하게 지연시켰으며, 이는 beta 독성의 억제를 나타내는 것으로 해석됩니다. 이 모델에서, 본 실험은 커피에서 발견되는 또 다른 화합물의 효과를 분석하였습니다.이 그래프는 베타 독성에 영향을 주지 않는 처리군에서 전형적으로 나타나는 양상입니다. 두 실험 모두에서 처리하지 않은 CL 4 1 76 집단의 약 절반이 24시간에 마비되었으며, 28시간에는 마비가 완전히 진행되었음에 유의하십시오. 이는 대조군의 마비에 있어 전형적인 시간 범위입니다.CL 4 1 7 6 집단에서 이 시기와의 유의미한 편차는 환경 조건의 변화나 transgene 복제본의 자발적 결실을 나타냅니다. 균주 CL 4 1 76에 관한 추가 정보는 동봉된 프로토콜을 참조하십시오. 이 절차를 수행할 때는 플레이트의 사용 기간, 벌레 집단의 단계, 그리고 벌레의 마비율을 측정하는 능력을 염두에 두는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 베타 아밀로이드 독성을 정밀하게 분석하기 위해 이 sea elgan 시스템을 사용하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 다양한 환경적 요인이나 약물 처리가 이러한 독성에 미치는 매우 미묘한 영향까지 검출할 수 있을 것입니다. 지금까지 설명한 변수들은 매우 중요하므로 주의 깊게 살펴야 하며, 이를 통해 분석의 재현성을 높이고 일관된 마비 역학을 확보할 수 있습니다.이는 서로 다른 시기에 서로 다른 연구자가 수행한 실험 결과나, 본 모델 시스템을 사용하는 다른 연구자의 결과와 자신의 결과를 비교하고자 할 때 매우 중요합니다.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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