Name: Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 배우세요 Drosophila 중기 원장기 배아에서 1차 신경 세포 배양을 준비하는 방법을. 이 기술은 전기적 흥분성과 시냅스 전달을 연구하여 신경 발달 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. HHMI 교수 부여에서 DKOD이 작업에 대한 추가 지원합니다.

I. Drosophila의 배아 컬렉션 <ol><li> 달걀 수집 번호판을 준비 <ol><li> 8g의 한천과 함께 삶아 200 ML DH 2 O </li><li> 50 쿨 ° C </li><li> 2 ML EtOH 2 ML 초산 추가 </li><li> 35mm 플라스틱 배양 접시, 정상에 따르다 </li><li> 4 쿨 공기 꽉 컨테이너에 가게 ° C </li><li> 약 80 접시를 만듭니다 </li></ol></li><li> 효모 붙여넣기 준비 <ol><li> 붙여넣기 양식 물에 Fleishmans 적극적인 제빵 효모를 디졸브 </li><li> 누룩을 죽일 20-30초에 대한 마이크 로파 (끓어에 대한 조심) </li><li> 4 ° C에 대한 이주 10 CC 주사기 (바늘없이)에 저장 </li></ol></li><li> 파리 : 달걀 수집에 사용되는 어른들이 신선한 음식에 접근할 수 있었 것을 제공하고, 3시 사이에 14 일 신흥 후 일반적으로 가장 비옥한 있습니다. 대부분의 돌연변이 주식 계란 누워있는 그들이 가장 생산되는의 시대에 변화의 인하 속도에 자신을 매니 페스트 수 있습니다 다산을 감소했습니다. 일반적으로, 수백 성인은 좋은 계란 - 누워있는 인구에 대한합니다. </li><li> 절차 : 달걀 수집 접시에 붙여넣 효모의 얇은 레이어를 펴. 이것은 계란의 부설을위한 유리한 기판을 제공합니다. 전송 성인 병의 입구에 깨끗한 달걀 수거 용기 및 테이프 수집 판을 난다. 습도가 상승하고 파리가 붙여넣기와 병의 양쪽에 붙어가는대로 더 이상 3~4시간보다 이런 병에 파리를 두지 마십시오. </li></ol> II. 블리치와 함께 배아 Dechorionation <ol><li> 흡인기에 부착된 필터 플라스크에 연결된 부흐너 퍼널을 설정합니다. 퍼널의 왓먼 # 1 종이를 넣어. 흡입을 실행으로 멸균 증류수로 종이가 젖었어. </li><li> 세척 병의 물 흐름으로 여과지에 수집 접시에서 배아를 씻어. </li><li> 멸균 물 몇 권에서 그들을 린스, 흡인기를 해제하고, 다음 50 % 표백제의 퍼널 볼륨을 추가합니다. 계란 5-10 분 정도 앉아 보자. chorions는 1-2분에 녹아있는,하지만 더 이상 당신이 훼손 효모의 이상이 파괴되는 표백제의 배아를 떠날 것입니다. 접시를 씻어서 갖고있는 성인이나 애벌레를 선택하십시오. </li><li> 멸균 증류수와 멸균 페트리 접시 (조직 배양되지 않음)에 배아를 씻어. 그것이 미리 침수되지 않은 경우 배아의 많은 접시의 바닥에 붙어 것입니다. 이 접시에 멸균 물을 여러 번 씻어. </li><li> 중간 gastrula 단계 배아를 선택할 전송 빛의와 태아를 검사합니다. </li></ol> III. 단일 배아 문화의 준비 <ol><li> DDM1를 (섹션 IV의 요리법 참조) 확인 </li><li> 직전 culturing에 배아의 그릇에서 물을 붓다. 무균 미디어와 배아를 커버. </li><li> 3, 35mm 배양 접시를 설정합니다. 각 접시 4 autoclaved 원형 coverslips 넣어. 각 coverslip에 중간 5 μl를 넣어. Bellco coverslips - 낮은 납 유리 coverlips을 사용합니다. Bellco 생물 유리 800-257-7043 고양이 # 1943-00012 </li><li> 몇 가지 매우 좋은 pipets을 당기세요. 우리가 사용하는 pipets는 Narishige PP - 83의 풀러에 뽑아 있습니다. pipet의 정확한 크기는 중요하지 않습니다 우리는 보통 우리가 원하는보다 세밀한들을 뽑아 그들의 크기를 측정하기 위해 배아로보기 같은 분야의 팁을를 끊다. 한 가지의 배아를 모두 빨아 싶지 않다, 그리고 그것이 조직을 빨아 5 분 정도 소요되는 끝 이렇게 작은 싶지 않아요. 어딘가 사이에 목표. 전송 빛의와 배아를 검사하고 배아의 내용을 제거 pipet에 연결된 입 흡입 튜브를 사용합니다. 가능한 coverslip 가까운 부드럽게 세포를 추방하여 준비 coverslip에 세포를 해산. 당신은 높은 전력에서 coverslips을 검사할 더 나아가 같은 방법으로 세포를 흩어 수 있습니다. </li><li> 전지은 10 분이다 위해 앉아 보자. 홍수는 미디어와 접시와 인큐베이터에 넣어 4-5 %의 CO 2 환경 정의 매체를 사용하는 경우. 22-24 사이의 온도 ° C. 우리는 일상적으로 23 ° C와 95 %의 습도를 사용합니다. 습도는 증발을 피하기 위해 원하는만큼 중요합니다. 당신은 23으로 설정 온도 제어와 coldroom에 배치 표준 포유 동물 배양기 ° C.를 사용할 수 있습니다 </li></ol> IV. 문화를 성장을위한 DDM1 정의 매체 <ol><li> 100 햄의 F12/DME 미디어 (DMEM) (어바인 과학 # 9052)의 MLS :. DMEM 만들기 <ol><li> 0.476 g Hepes (20mM) (시그마 #은 H - 3375)를 추가합니다. 섞는다. </li><li> 1.25 ML L - 글루타민 200 MM을 (# 9317 어바인 과학) 추가합니다. 섞는다. </li><li> 0.2 μm의 아세테이트 주사기 필터 (2 필터가 필요)와 후드 필터. </li><li> 산도는 6.64 및 Osm 288입니다. </li><li> 15ml 원심 튜브에 10ml의 aliquots하십시오. </li><li> 4 스토어 ° C 이상의 이주되지 않습니다. 참고 : 항상 미디어와 보조제만을 위해 예약된 용기에 autoclaved 필터링된 물을 사용합니다. 아래 추가 보조 : 산도 전극을 넣어하거나 Media.To 다른 목적을 위해 사용 막대를 저어 쓰지 DDM1을culturing에 DMEM하기 직전. </li></ol></li><li> DMEM 추가의 10 MLS : <ul><li> 100 μl 트랜스페린 </li><li> 100 μl Putrescine </li><li> 100 μl 셀레늄 </li><li> 100 μl Progesterone </li><li> 50 μl 인슐린 </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

midgastrula 스테이지 배아에서 준비 Drosophila 문화에서 뉴런은 체외에서 분화하기 전에 분할 많은 중 neuroblast의 엽 성의 전구 물질에서 발생. 이 시스템의 연결을 따라서 개발의 매우 초기 단계 (로보어 외., 2003)에서 중요한 유전과 환경 요인의 탐험에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 간단한 정의 매체 성장 뉴런도 (; 리 O 다우드, 1999 O 다우드, 1995) 기능 시냅스 연결을 형성 전기 고르기 뉴런으로 차별화하는 것으로 나타났습니다. .이 모델 시스템은 전기 흥분과 시냅스 전송 (하지스 외, 2002 년 개발에 관련된 역할 유전자와 환경 요인을 탐구하는 데 사용할 수있는 표준 전체 세포 녹음 기술과 함께, 돌연변이 및 / 또는 약리 조작의 분석을 사용하여, 리 그리고 O 다우드, 2000; 리 외, 2003)..

이 미디어에서 만든 문화는 약 22-24 ° C.에서 5 % CO2 배양기에서 유지되어야합니다 우리는 인큐베이터가 추운 방에 배치 표준 포유류의 조직 문화를 사용하여 23 ° C.으로 가열 항상 autoclaved 여과 물, 미디어 및 보충만을 위해 예약된 컨테이너에서 확인를 사용합니다. 산도 측정기를 넣어하거나 미디어에 다른 목적으로 사용되는 막대를 저어 마십시오.

midgastrula 스테이지 drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화를 만들기위한 절차를 설명합니다. 표백제를 사용하는 배아하고 dechorionation를 수집하기 위해 방법은 증명하고 있습니다. 입 흡입 튜브에 부착된 유리 pipet을 사용하여, 우리는 하나의 배아에서 세포의 제거를 보여줍니다. uncoated 유리 coverslip에 대한 매체의 작은 (5 L) 드롭으로 각 embyro에서 세포를 분산하는 방법을 시연합니다. 도금 후 1 시간에 현미경을 통해보기 원하는 세포 밀도를 보여줍니다. 정의 매체 자라면 생존 세포의 대부분은 12-24시간로 neuritic 프로세스를 확장하기 전에 문화를 한 번 이상 나누어 neuroblasts 있습니다. 현미경을 통해 볼 수 neurite 가지의 수준을 보여줍니다과 체외에서 이일에 건강한 문화의 예상 분기. 문화가 22-24 ° C.에서 5 % CO 2 배양기에서 정의된 매체를 기반으로 간단한 중탄산염에서 재배 Neuritic 프로세스는 문화의 첫 번째 주 동안 정교한 계속하고 그들은 종종 기능 시냅스 연결을 형성 인접 세포에서 neurites과 접촉을 때. 이러한 문화의 뉴런 전압 - 게이 티드 나트륨, 칼슘, 그리고 칼륨 채널을 표현하고 전기 고르기가 있습니다. 이 문화 시스템의 연결을 차별화, 흥분, 그리고 버렸네 형성 / 기능을 조절 분자 유전과 환경 요인을 공부하는 데 유용합니다.

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

이 영상은 중위위배엽기(midgastrula stage) 초파리 배아로부터 일차 신경세포 배양물을 만드는 절차를 보여줍니다. 배아 수집 방법은...

제 이름은 Diana Dowd이며, UC Irvine의 발달 및 세포 생물학, 해부학 및 신경생물학 학과 교수입니다. 오늘은 초파리 배아로부터의 1차 신경세포 배양 준비 과정을 시연하겠습니다. 이 과정은 중장기(mid gastro stage)의 초파리 배아에서 모든 세포를 제거하여 이를 세포 배양 접시에 옮기는 작업을 포함합니다.이러한 배양물을 사용하는 목적은 초파리 뉴런 간의 전기적 흥분성과 시냅스 전달의 조절에 중요한 유전자와 환경 요인이 무엇인지 정확히 이해하기 위함입니다. 이 절차를 시작하려면 초파리 배아를 수집해야 합니다. 이를 위해 알 수집 플레이트를 준비하고, 그 위에 효모 페이스트를 소량 도포합니다.이는 성체 초파리가 알을 낳기에 적합한 배지입니다. 이 플레이트들을 보통 100마리에서 200마리의 성체 초파리가 들어 있는 병 위에 올려둡니다. 그런 다음 성체 초파리가 약 2~3시간 동안 알을 낳도록 둡니다.그 후 난자 수집 플레이트를 제거하며, 이들이 배양 과정에 사용할 배아들입니다. 절차의 다음 단계는 배아의 탈피막(Decoating) 과정으로, 이는 실제로 난막(chorion)을 제거하는 것을 의미합니다. 배아를 뷔히너 깔때기(Buechner funnel)로 씻어 내어 배아를 포집할 수 있도록 깔때기 위에 거름종이를 배치하여 이 과정을 수행합니다.우리는 이를 50% bleach 용액이 담긴 뷰흐너 깔때기에 둡니다. 이 50% bleach 용액은 corion을 용해시킬 뿐만 아니라, 멸균 과정의 일부로도 작용합니다. 이 과정은 실제로 후드 안이 아니라 후드 밖에서 수행하며, 배아의 염소 제거가 완료되면 페트리 접시로 씻어 옮깁니다.실제로 코리안(Corian)이 제거되면, 난막(viel membrane)이 매우 끈적해져서 페트리 접시에 잘 달라붙게 됩니다. 그 위에 증류수를 붓고 증류수를 두세 번 교체하며 씻어내는데, 이때 물을 그냥 따라 버리면 배아들이 페트리 접시에 달라붙어 있게 됩니다. 조직 배양용 플라스틱 접시(tissue culture plastic Dish)는 사용하지 마십시오.배아들이 달라붙지 않도록 합니다. 배아가 담긴 페트리 접시를 라미나 플로우 후드(laminar flow hood) 안으로 옮기면서 멸균 공정을 시작합니다. 이것들은 Bellco 커버 슬립입니다.이들은 코팅되지 않은 상태이며, 오토클레이브 멸균은 거쳤으나 세척되지는 않았습니다. 우리는 이러한 상태에서는 성능이 매우

preparation-neuronal-cultures-from-midgastrula-stage-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

우리는에서 dissociated 기본 세포를 준비 상세한 프로토콜을...

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

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Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

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