Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.

제 이름은 다이애나 다우드(Diana Dowd)이고, UC 어바인(UC Irvine)의 발달 및 세포 생물학과 해부학 및 신경생물학과 교수입니다. 그리고 오늘 저는 초파리 배아에서 1차 신경 배양을 준비하는 방법을 시연하려고 합니다. 그리고 이것은 실제로 중간 위장 단계인 초파리 배아에서 모든 세포를 제거하고 이를 세포 배양에 넣는 것을 수반합니다.

그리고 우리가 이러한 배양을 사용하는 것은 초파리 뉴런 사이의 전기적 흥분성과 시냅스 전달을 조절하는 데 중요한 유전자와 환경적 요인이 무엇인지 진정으로 이해하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 초파리 배아를 수집해야 합니다. 이를 위해 우리는 계란 수집 플레이트를 가져다가 그 위에 약간의 효모 페이스트를 펴 바릅니다.

성충 파리가 알을 낳기에 유리한 기질입니다. 우리는 이 접시를 보통 100마리에서 200마리의 파리가 들어 있는 성충 파리가 들어 있는 병에 놓습니다. 그런 다음 우리는 파리, 성충 파리가 약 2-3시간 동안 알을 낳도록 내버려 둡니다.

그런 다음 난자 채취 플레이트를 제거하는데, 이것이 배양 절차에 사용하는 배아입니다. 절차의 다음 단계는 배아를 Dec로 코팅하는 것인데, 이는 실제로 코리온을 제거하는 것을 의미합니다. 우리는 배아를 Buechner 깔때기로 씻어내고 그 위에 여과지 조각을 넣어 배아를 잡는 방식으로 이를 수행합니다.

우리는 그들이 50% 표백제 용액의 Buchner 깔때기에 앉을 수 있도록 합니다. 이 50% 표백제 용액은 코리온을 용해시킬 뿐만 아니라 멸균 절차의 일부로서 역할을 합니다. 우리는 실제로 이 절차를 후드 안이 아니라 후드 밖에서 하기 때문에 배아가 염소 처리되면 페트리 접시에 씻습니다.

그들은 실제로 코리안이 사라지면 비엘 막이 상당히 끈적거리고 페트리 접시에 잘 붙을 것입니다. 그런 다음 그 위에 증류수를 붓고 증류수를 두세 번 제거한 다음 실제로 물을 버리기만 하면 배아가 페트리 접시에 달라붙습니다. 조직 배양 플라스틱 접시를 사용하지 마십시오.

그들은 그것에 집착하지 않습니다. 우리는 배아의 페트리 접시를 채취하여 층류 후드에 넣음으로써 절차의 무균 부분을 시작합니다. 이것은 벨코 커버 슬립입니다.

그들은 코팅되지 않았지만 오토클레이브였으며 세척되지 않았습니다. 우리는 그들이 잘 작동하지 않는다는 것을 알았습니다. 세탁할 때 보통 4개의 커버 슬립을 꺼내 하나의 페트리 접시에 넣습니다.

그래서 우리는 각 페트리 접시에 4개의 배아 배양을 만들 것입니다. 자, 페트리 접시는 기본적으로 우리가 배양을 시작할 준비가 되었고, 저는 보통 한 번에 12-16개의 문화를 12개의 문화로 만듭니다. 그래? 우리가 사용하는 배양 배지는 비교적 간단하게 정의된 배지입니다.

A-D-M-E-M 베이스이며, 우리는 이 액체 매체를 2주에 한 번씩 만들어 냉장고에서 2주 동안 보관할 수 있습니다. 이것은 살균 처리되었습니다. 0.2미크론 멸균 필터를 거친 다음 5가지 보충제를 배지에 추가합니다.

그들은 두 달에 한 번 준비된 다음 10mil의 액체 매체에 첨가되는 분취액에서 냉동됩니다. 그래서 우리는 내용물을 제거합니다. 마지막으로, 이것은 그냥, 우리는 이 미디어를 부드럽게 반전시켜 혼합하고 갈 준비가 되었습니다. 그래.

모든 것이 설정되었습니다. 나는 준비된 문화 접시, 또는 4개의 커버 슬립이 있는 페트리 접시를 가지고 있습니다. 이제 저는 배아와 함께 접시를 가져갈 것이고, 배아는 이제 증류수에 담겨 있습니다.

증류수는 털어내는 것만으로 제거합니다. 이것이 내가 쓰레기통에 바로 넣는 방법입니다. 이제 저는 이 배아에 약 2밀의 배지를 부을 것이고, 이제 그것들은 제가 실제로 유리 바늘을 개별 배아에 삽입하고 내용물을 제거할 준비가 되었습니다.

미디어는 외부에 있어야 합니다. 분명히 거기에 물이 있었다면 삼투압 쇼크를 겪었을 것입니다. 이제 배아의 내용물을 제거하기 직전에 실제로 배양을 준비할 준비를 하기 위해 실제로 5마이크로리터 방울을 커버 슬립에 떨어뜨렸습니다.

너무 오래 방치하면 매체의 pH가 변합니다. 자, 이제 4개의 커버 슬립 각각의 중앙에 5마이크로리터 방울을 떨어뜨릴 것입니다. 실제로 이러한 방울이 가능한 한 그대로 유지되는 것이 중요합니다.

매체가 커버 슬립 전체에 퍼지면 세포가 일부에 도금되고 매우 얇은 유체 층이 어렵습니다. 당신은 그들이 세포를 멋진 둥근 액체 방울로 도금하기를 원합니다. 보시다시피, 우리는 4개의 멋진 둥근 액체 방울을 준비했습니다.

이제 제가 뽑은 피펫 중 하나를 이 입 피펫 튜브에 부착하겠습니다. 원하는 튜브를 모두 사용할 수 있지만 이 튜브의 좋은 점은 실제로 VWR 파이프에 보정된 100마이크로리터 피펫이 함께 제공된다는 것입니다. 그리고 이것들에는 여기에 작은 고무 개스킷

입 피펫을 삽입할 수 있는데, 유리 피펫을 피펫터의 이 끝에 삽입할 수 있습니다. 그리고 나서 제가 배아의 내용물을 빨아들일 때, 저는 배아가 좁아지기 시작하는 이 영역보다 더 이상 올라가지 않을 것입니다. 그래서 여기 위의 마우스 흡입을 사용하여 저를 분리하는 이 거대한 영역이 있습니다.

따라서 오염에는 문제가 없습니다. 실수로 내용물을 이 영역으로 빨아들이면 엄청난 오염 문제가 발생합니다. 우리의 층류 후드에는 스코픽 기반의 해부 현미경이 있습니다.

이를 통해 배아 아래에서 빛이 들어올 수 있고, 이를 통해 우리는 두부 고랑과 중장을 실제로 볼 수 있으며, 실제 배아를 볼 때 볼 수 있는 상상력을 볼 수 있습니다. 그리고 이것이 우리가 실제로 배아의 내용물을 제거하기 위해 배양에 중요한 배아의 단계를 선택하는 방법입니다. 우리는 유리 피펫을 사용하고, 패치 기록 피펫을 만드는 데 사용하는 일반 마이크로 전극 풀러를 당깁니다.

우리는 설정이 무엇인지 실제로 신경 쓰지 않습니다. 우리는 우리가 정말로 원하는 크기로 배아 옆의 접시에서 피펫을 부술 것이기 때문에 아주 미세한 피펫을 뽑습니다. 그런 다음 이 유리 피펫을 가져다가 배아의 빌리엘 막을 통해 삽입하고 피펫 뒤쪽에 부착된 구강 흡입 튜브를 사용합니다.

그런 다음 전체 배아의 내용물을 추출합니다. 그런 다음 피펫을 꺼내 5마이크로리터 용지를 떨어뜨린 커버 슬립이 있는 다른 접시로 이동합니다. 그리고 우리는 배아의 내용물을 5마이크로리터 방울로 배출합니다.

우리는 세포를 분산시키기 위해 여러 번 위아래로 피펫을 삐걱 거렸고, 그런 다음 접시에 두 개의 매체를 주입하기 전에 약 10 분 동안 덮개를 접시에 넣었습니다. 플레이팅된 세포의 접시는 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다. 우리가 사용하는 배지는 중탄산염 완충 배지이기 때문에 이것은 매우 중요합니다.

우리는 거기에 약간의 HEP를 가지고 있지만 공기 환경에서 버퍼링하기에 충분하지 않습니다. 따라서 5%CO2 인큐베이터를 사용해야 합니다. 그러나 22도에서 23도 정도의 비교적 낮은 온도

그래서 우리는 포유류 배양에서 사용되는 표준 CO2 인큐베이터를 가져다가 37도까지 가열합니다. 우리가 하는 일은 히터를 끄고, 실험실에 놓고, 인큐베이터 바닥에 얼음을 넣어 온도를 21도에서 25도 정도로 유지하는 것입니다. 우리가 사용하는 또 다른 기술은 표준 난방 CO2 인큐베이터 중 하나를 사용하여 인큐베이터를 냉장실에 두는 것입니다.

그런 다음 주변 온도가 차가운 실내 온도인 경우 실제로 인큐베이터를 23도까지 매우 효과적으로 가열할 수 있습니다. 그래서 이것이 우리가 표준 인장을 갖기 위해 사용하는 두 가지 방법, 즉 포유류 인장에서 인큐베이터로 우리가 생존할 수 있도록 하는 것입니다. 자, 이것은 1시간 전에 플레이팅 1시간 후 플레이팅 직후에 본 것과 동일한 배율로 플레이팅된 문화입니다.

여기서 우리는 약 이틀 동안 분화된 뉴런을 볼 수 있다. 문화에서 신경 아세포는 한 번 이상 분열한 다음 뉴런을 발생시켰으며, 이는 광범위하게 중첩되는 신경증 네트워크 작업을 형성하는 과정을 확장합니다. 여기 우리는 머리와 머리로 있는 두 개의 세포체를 가지고 있습니다.

위쪽은 11시 방향에서 프로세스를 확장하고 아래쪽은 5시 방향에서 프로세스를 확장하는 것입니다. 그것들이 그들의 주요 확장입니다. 그러면 그들이 더 미세한 가지를 형성하는 것을 볼 수 있습니다.

이것들은 유리 기판에 매우 밀접하게 부착되어 있으며, 다른 세포에서도 오는 과정이 겹치는 것을 볼 수 있습니다. 그리고 이것들은 잠재적인 시냅스 연결의 장소입니다. 우리는 이 세포들 중 하나를 패치할 것이고, 일반적으로 이 정도의 과정 정교화로, 그것들은 시냅스 기능적 시냅스 전류를 가질 것입니다.

이제 우리 세포는 도금 후 12시간 후에 배양에서 성장합니다. 그들은 꽤 좋은 프로세스를 확장 할 것입니다. 우리의 표준 생리학은 배양 후 약 1-2 개를 시작합니다.

그리고 앞으로 4-5일 동안 실제로 프로세스를 계속 성장시키는 것을 볼 수 있습니다. 우리는 세포에서 최대 2주까지 배양에 대해 기록했지만, 대부분의 기록은 이러한 배양에서 2일에서 6일 사이에 이루어졌고, 그 다음에는 중간 위장 단계의 초파리 배아를 준비했으며, 배양에서 소통하는 뉴런 네트워크가 있습니다. 우리는 실제로 이러한 세포의 발화 특성을 볼 수 있습니다.

그들은 다양한 소성 특성을 가지고 있습니다. 그들은 반복적으로 발화하고, 어떤 세포는 반복적으로 발화하고, 다른 세포는 태어날 때 발화하며, 이러한 세포는 주로 콜린성 또는 GABAergic입니다. 그리고 우리는 니코틴, Aach, H 수용체, GABA 수용체에 의해 매개되는 시냅스 전류를 볼 수 있습니다.