Name: 이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 Xenopus 난모세포에서 패치 클램프와 재관류 시스템을 이용한 BK 이온 채널 활성화 기록 방법. 전압과 칼슘 농도에 따른 채널 활성화 메커니즘을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 보조금 R01 - HL70393 및 JCJC에 R01 - NS060706 국립 연구소에 의해 지원되었다 스펜서 T. 올린 엔다우먼트에 의생명 공학 교수이다.

1. Oocytes에 mRNA의 분사 <ol><li> 0.05을 주사 - Nanoject II 자동 Nanoliter 주입기 (드루먼드 과학 회사, 모델 3-000-204)를 사용하여 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)로 체외에서 베꼈는데했습니다 50 NG 전령 RNA합니다. 각각의 mRNA에 대한 열 oocytes에서 주사를 반복합니다. </li><li> 두 번 사용하여 주입 oocytes 씻어 ND를 - 96 솔루션 (96 MM 나트륨 염화물 (NaCl, 미스터 58.44 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, 미스터 74.56 g / 몰), 1.8 MM의 염화칼슘 (CaCl 2 • 2 시간 2 O 씨 147.02), 1 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O 씨, 203.31 g / 몰), 5 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, 미스터 238.31 g / 몰), 2.5 MM 나트륨 pyruvate (씨 110.04 g / 몰) 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신. 산도 7.6)은 다음 18 문화 판과 부화에 배치 ° 2 +의 일 C. </li></ol> 2. 재관류 시스템 준비 <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 자동화 ValveLink 16 재관류 시스템의 일러스트. 재관류 시스템은 재관류의 tubings 통해 솔루션 저수지의 재관류 솔루션을 밖으로 밀어 가압 질소를 사용하고, 재관류의 연필과 팁합니다. 재관류 솔루션의 각 스트림의 흐름을 한 저수지 밸브 하나의 전자 밸브에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜에서는, 저수지 중 하나는 폐기물 수집뿐 아니라 압력 릴리스 메커니즘으로 가압 및 기능하지 않습니다. (사진은 공급 업체의 웹 사이트 http://www.autom8.com에서 적응) <ol><li> 재관류의 연필에 tubings를 연결합니다. 전자 밸브 컨트롤러의 전원을 켜고 전자 밸브를 엽니다. </li><li> 탈이온수 가득한 주사기를 사용하여 각 튜브를 통해 deionized (DI) 물을 밀어 tubings 및 재관류의 연필이 나막신과 공기 거품없는 것을 확신합니다. </li><li> 솔루션 저수지에 tubings를 연결하고 가압 질소를 적용하는 실린더 가스의 밸브를 엽니다. </li><li> 저수지 솔루션 튜빙을 채우기 위해 저수지 밸브를 엽니다. 필요한 경우 솔루션에 거품을 제거하기 위해 저수지 밸브를 버려. 튜빙이 솔루션으로 가득 후 밸브를 닫습니다. </li><li> 물로 세례 팁을 입력하고 재관류의 연필에 그것을 나사. 팁을 연결할 때 모든 거품을 함정하지 않도록주의하십시오. </li><li> 모델링 점토를 사용하여 목욕 단계에 재관류의 연필을 수정. 재관류 팁는 목욕 공간에 있는지 확인하십시오. 재관류 시스템은 지금 설정됩니다. </li><li> 욕조에 물을 DI를 ​​추가합니다. 재관류 팁이 물 속에 빠져들 있는지 확인하십시오. </li><li> 각 재관류 솔루션이 제대로 재관류 팁 나오는 것 테스트합니다. 쓰레기 수집기의 튜브에 연결된 전자 밸브를 닫고 한 번에 하나의 재관류 솔루션 (140 MM의 칼륨 수산화 (코에 대한 밸브를 열어 M R 56.1 g / 몰), 20 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) -1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰), 1 MM 에틸렌 글리콜 - 비스 (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N' - tetraacetic 산 (EGTA, M R 380.35 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰), CA 2 7.1-7.2하도록 조정됩니다 +이나 Mg2 + 필요할 때) 원하는 농도에 추가됩니다.이 현미경, 재관류 팁 나오는 재관류 유체의 제트를 관찰합니다. 재관류 솔루션을위한 밸브를 닫고 쓰레기 수집기를 위해 밸브를 엽니다. 재관류 제트는 거의 사라질 것입니다. 모든 재관류 솔루션에 대해 동일한 시험을 반복합니다. </li><li> 제대로 모든 재관류 솔루션 흐름을 확인했으면, 목욕 솔루션 욕조 (140 MM의 칼륨 수산화 (코에서 DI 워터를 교체 M R 56.1 g / 몰), 20 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰))에 의해 7.1-7.2로 조정됩니다. </li></ol> 3. 패치 클램핑 <ol><li> Recoat AgCl과 자세 기록 전극은 각 패치는 세션을 클램핑하기 전에. 첫째, 피펫 홀더 및 잠수함 적어도 15 분 동안 신선한 표백제가 들​​어있는 유리병에 전극 와이어의 끝에 절반의 전극 와이어를 제거합니다. 와이어에 AgCl의이 예금은 레이어. </li><li> 탈이온수으로 전극 와이어를 씻어 건조 얼룩. 다음 피펫 홀더에 다시 자세 / AgCl 전극을 설치합니다. </li><li> headstage에 목욕 (참조) 전극을 연결하고 목욕에 놓으십시오. 이것은 기록을위한 전극을 준비합니다. </li><li> 이제 데이터 수집을위한 준비. 컴퓨터를 켜고 컴퓨터의 프린터 포트에 하드웨어 키를 꽂습니다. 당신이 HEKA 파동있는 데이터 수집 소프트웨어를 사용하는 하드웨어 키를 연결해야합니다. </li><li> (액슨 인 스트 루먼트, AXO 앰프에 스위치패치 200B) 및 시작 HEKA 펄스. 같은 자극 규모로, 프로토콜 파일을로드하고 구성 설정을 조정합니다. 구성 설정을 조정 목표는 테스트 가능성이 명령 잠재 정확히 같다는 것을 보증하는 것입니다. 이것은 데이터 수집 장비를 준비합니다. </li><li> oocytes를 준비합니다. 스트립 솔루션에서 잠수함 oocyte (200 MM N - 메틸 - D - glucamine (NMG, M R 195.22 g / 몰), 200 MM의 Aspartate (NO K +) (M R 133.1 g / 몰), 2 MM 염화칼륨 (KCl , M R 74.56 g / 몰), 10 MM 에틸렌 글리콜 - 비스 (2 - aminoethylether) - N, N, N ', N' - tetraacetic 산 (EGTA, M R 380.35 g / 몰), 1 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O, M R 203.31 g / 몰), 10 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R 238.31 g / 몰)는 산도가 (NaOH, 수산화 나트륨에 의해 7.4로 조정됩니다 5 M R 40.0 g / 몰) -. 10 분 스트립 솔루션은 가능한 vitelline 막 제거하기 위해서 만드는 플라즈마 막에서 vitelline 멤브레인를 분리합니다. </li><li> 부드럽게 포셉 두 쌍을 사용하여 oocyte에서 vitelline 막을 스트립. devitellinized oocyte 필요로 작은로 매우 연약하기 때문에 이동해야합니다. </li><li> 공기 또는 거품에 devitellinized oocyte를 노출되지 않도록 돌보는 것은 욕조에 oocyte를 전송하기에 충분한 해결책 가득한 유리 피펫을 사용합니다. 이 기록에 대한 oocyte를 준비합니다. </li><li> 패치 pipettes 준비. 서터 P - 97 플라밍 / 브라운 Micropipette 풀러에 유리 모세관 (VWR 인터내셔널, 고양이 # 53432-921)을 삽입 후 유리 pipettes을 당기세요. 팁 모양과 개방 직경을 결정하는 현미경 pipettes을 준수. 여는 직경 2-4 micrometers해야합니다. </li><li> 녹화 중에 용량성 전류를 감소하고 부드러운 팁, 코팅 왁스로 끝부분을 보장하기 위해 다음을 해고 - 폴란드어. </li><li> (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, M R - 피펫 솔루션 (140 MM의 칼륨 수산화 (코, M R 56.1 g / 몰), 20 MM 네 안에있는 피펫의 팁을 배치하여 피펫 팁을 작성 238.31 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, M R 74.56 g / 몰), 2 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O, M R 203.31 g / 몰)는 산도가 methanesulfonic으로 7.1-7.2로 조정됩니다 산성 (MeSO 3, M R 96.1 g / 몰))와 플런저를 그리기. 이것은 끝에 오줌 싼다. </li><li> 주사기를 사용하여 피펫 솔루션 피펫 전체 1 / 3 입력하고 자세 / AgCl 전극 내부 피펫 솔루션 문의와 피펫 홀더에 피펫을 놓으십시오. 이것은 패치 피펫을 준비합니다. </li><li> 준비 oocyte에서 소비세 내부 아웃 패치를하려면, 현미경 oocyte의 명확한 가장자리를 찾으십시오. 조작하는 사람을 사용하여 oocyte 가까운 패치 피펫을 이동합니다. 피펫의 일련 저항을 기록합니다. 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 피펫 솔루션 가득, 욕실 솔루션에 빠져들 때 MΩ 1-1.5 사이입니다. </li><li> 저항이 약 두 배로 때까지 천천히 oocyte에 대한 피펫 밀어. </li><li> 기가 - 옴 밀봉을 얻을 때까지 피펫 홀더에 연결된 흡입 튜브를 통하여 입안으로 멤브레인에 부드러운 흡입을 적용합니다. 몇 분 동안은 전압 -30 MV에서 개최하여 패치를 안정화. </li><li> 빨리 oocyte에 추가로 피펫을 밀고하고 부드럽게 그것을 철수하여 내부 아웃 패치, 소비세에게 패치를 구하십시오. </li><li> 내부 아웃 패치 클램핑 이제 준비가되었습니다. 재관류 팁의 개통 떨어져 약 100 미크론에 내부 아웃 패치를 들고 피펫 이동합니다. </li><li> 폐기물 수집에 대한 전자 밸브를 닫고 원하는 재관류 솔루션을위한 저수지의 밸브를 열어 </li><li> 패치를 통해 전류를 녹음 시작합니다. 원하는대로 전압과 재관류 솔루션을 변경합니다. </li><li> 당신은 녹음을 완료하면, 나막신을 피하기 위해 탈이온수을 통해 추진하여 재관류의 tubings, 연필 및 팁을 청소하십시오. </li></ol> 4. 대표 결과 패치 클램프에 대한 oocytes의 준비 기간 동안, 스트립 솔루션의 50-10 분 치료 vitelline 막가 벗겨진 가능하게 플라즈마 막에서 vitelline 멤브레인를 분리합니다. 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 피펫 솔루션 가득, 욕실 솔루션에 빠져들 때 MΩ 1-1.5 사이입니다. 다음은 oocyte 막 패치에 야생 형 BK 채널의 대표적인 기록이다. 50 MV 50 MV의 증가 200 MV 전압 증가의 두 번째 단계 - 왼쪽 상단에서 광장 파도 패치에 적용된 전압을 나타냅니다. 아래 재관류 솔루션 공칭 0 칼슘 2 + (무료 [칼슘 2 +]는 약 0.5 nm의)이 해당 현재의 흔적입니다. 에현재 진폭의 포복 절도는 BK 채널의 개방 가능성이 전압 증가시킬 수있다는 것을 나타냅니다. 오른쪽에서 동일한 패치는 1.0 μm의 칼슘 2 perfused입니다 + 같은 전압 프로토콜 적용하면. 현재 진폭은 오픈 확률 [칼슘 2 +]로 증가시킬 수있다는 것을 나타내는 같은 전압에 따라 더 증가합니다. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2">

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<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

oocyte 표현 시스템은 내생 채널 상대적으로 낮은 배경에 의한 전압 - 의존 이온 채널의 electrophysiological 특성에 이상적입니다. 또한, 그것이 일시적 표현 시스템이기 때문에, 그것은 이러한 채널의 돌연변이 유발 연구를 수행하는 효율적인 방법을 제공합니다. 그러나, 그것이 oocyte 표현 시스템은 포유 동물 세포에서 다른 것을 지적해야하므로 다른 subunits와 포스트 translational 수정 및 결사의 차이가있을 수 있습니다. 또한 지질 농도는 채널의 기능적 속성을 영향을 미칠 수있는 두 셀 사이에 다를 수 있습니다. 재관류의 tubings, 연필과 팁은 DI 워터와 방해할을 피하기 위해 실험 후 매번 청소해야합니다. 항상 그것이 녹음이 정확합니다 그렇지 않으면, AgCl로 코팅되어 있는지 확인하는 자세 전극 와이어를 치료하기 위해 새로운 표백제를 사용합니다. 테스트 잠재력이 명령 잠재력을 정확히 동일하므로 데이터 수집에 대한 구성 설정을 조정...

<table><tbody><tr><td>Nanoject II 자동 나노리터 인젝터</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>P-97 화염/브라운 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>관류 시스템 및 전자 컨트롤러</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>관류 팁 내경: 100 microns</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>화염/브라운 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 인터페이스</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>헤드스테이지</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

여기에 제시 프로토콜은 대형 전도, 전압 및 칼슘 2 + - 활성 K + (BK)이 채널의 활성화를 연구하기 위해 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체 1 구조 - 기능 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. BK 채널 널리 여러 조직에서 표현되고 평활근의 수축 규제, 내부 세포의 주파수 튜닝 및 신경 전달 물질 릴리스 2-6 규제 등 많은 생리 기능에 연루되어있다. BK 채널 막에 의해 탈분극 및 세포내 칼슘 2 +와 MG 2 + 6-9로 활성화됩니다. 따라서 프로토콜은 막 전압과 세포내 솔루션을 모두 제어할 수 있도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에서는 BK 채널 메신저 RNA는 18 ° C 10-13에서 부화 후 2-5 일 뒤에 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)에 주입합니다. 하나 또는 여러 개의 BK 채널을 포함하는 막 패치는 내부 아웃 구성을 패치 클램프 기법 10-13 사용에 excised됩니다. 패치의 세포 측면은 서로 다른 조건에서 채널 정품 인증 심사 수 있도록 녹음 중 원하는 솔루션을 perfused 있습니다. 요약하면, BK 채널의 mRNA는 oocyte 막에 채널 단백질을 표현하는 Xenopus laevis의 oocytes로 주입되며 패치 클램프 기법 제어 ​​전압과 세포내 솔루션에서 채널을 통해 흐르는 전류를 기록하는 데 사용됩니다.

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로 표현됩니다<em&gt; Xenopus의 oocytes</em&gt; 메신저 RNA를 주입하여. 패치 클램프 레코딩하는 동안 세포 솔루션은 재관류 시스템에 의해 제어됩니다.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

본 프로토콜은 대전도도 전압 및 Ca2+ 의존성 K+ (BK) 채널의 활성화를 연구하기 위해 설계되었습니다. 본 프로토콜은...

본 절차의 전반적인 목적은 세포 내 용액을 제어하면서 제어된 전압 하에서 BK 채널의 활성화를 기록하는 것입니다. 이는 먼저 BK 채널 mRNA를 주입하여 Xenopus Cytes에서 BK 채널을 발현시킴으로써 달성됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 관류 시스템을 준비하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 난자 막과 패치 피펫 사이에 기가 씰(giga seal)을 형성하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 막 패치를 절제하는 것입니다. 최종적으로, 프로퓨전 시스템(profusion system)과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 얻은 결과는 BK 채널이 전압 및 칼슘 농도의 변화에 의해 활성화됨을 보여줍니다.안녕하세요, 워싱턴 대학교 Jamie Zus 박사님 연구실의 진조영입니다. 이 방법은 이온 채널 활성화의 분자적 기전을 포함하여 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.절차의 첫 번째 단계는 패치 클램핑 며칠 전부터 시작되며, in vitro에서 전사된 BK 채널 mRNA를 사용합니다. Xenopus Lavu Cytes 5~6단계를 수확한 후, 사이트(cyte) 하나에 0.05~50 ng의 BK channel mRNA를 주입합니다. 이때 nano inject two auto nanoliter injector를 사용하십시오.각 mRNA에 대해 12개의 난자에 주입 과정을 반복합니다. ND 96 용액을 사용하여 난자를 두 번 헹굽니다. 그 다음, 난자를 배양 플레이트에 넣고 18 °C에서 2일 이상 배양하여 난자가 BK 채널을 발현할 수 있도록 합니다.2~5일간의 배양 후, 난세포는 BK 채널을 발현하게 되며 패치 클램핑 준비가 완료됩니다. 난세포를 다루기 전에, 퍼퓨전 시스템부터 시작하여 패치 클램핑에 필요한 모든 장비를 준비하십시오. 여기에 표시된 시스템은 automate valve link입니다.16 profusion 시스템의 가압 질소는 profusion 용액을 용액 저장조에서 profusion 튜빙을 통해 profusion 펜슬과 팁으로 밀어냅니다. 각 profusion 용액 흐름의 유량은 하나의 저장조 밸브와 하나의 전자 밸브에 의해 제어됩니다. 본 프로토콜에서는 저장조 중 하나에 압력을 가하지 않아 폐기물 수집기 및 압력 방출 기전으로 활용합니다.실험 전에 서로 다른 농도의 칼슘 또는 마그네슘을 포함한 관류액을 준비할 수 있습니다. 관류액을 저장조에 넣고 각 저장조에 칼슘 또는 마그네슘의 농도를 표시하십시오. 관류 시스템을 설정하려면 먼저 튜브를 관류 펜슬에 연결하십시오.그런 다음 전자 밸브 컨트롤러를 켜고 전자 밸브를 열어 튜빙과 프로퓨전 펜슬에 막힘이나 기포가 없는지 확인합니다. 탈이온수로 채운 시린지를 사용하여 각 튜빙에 탈이온수를 통과시킵니다. 이 단계에서 튜빙을 용액 저장조에 연결하고 가스 실린더의 밸브를 열어 질소를 가압하여 공급합니다.저장조 밸브 하나를 열어 저장조 용액 중 하나로 튜브를 채웁니다. 필요한 경우, 저장조 밸브를 클릭하여 용액 내의 기포를 제거합니다. 튜브에 용액이 채워지면 저장조 밸브를 닫고, 관류 팁에 물을 채운 후 관류 펜슬에 나사식으로 고정합니다.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 팁을 연결할 때, 모델링 클레이를 사용하여 퍼퓨전 펜슬을 배스 스테이지에 고정하고, 퍼퓨전 팁이 배스 공간 내에 있는지 확인하십시오. 이제 퍼퓨전 시스템 설정이 완료되었습니다.이 단계에서 배스에 탈이온수를 추가하십시오. 퍼퓨전 팁이 물에 잠겼는지 확인하십시오. 각 퍼퓨전 용액이 퍼퓨전 팁을 통해 제대로 나오는지 테스트하십시오.폐액 수집기 튜브에 연결된 전자 밸브를 닫고, 관류액 중 하나에 해당하는 밸브를 엽니다. 현미경 하에서 관류 팁으로부터 나오는 관류액 제트를 관찰합니다. 해당 관류액의 밸브를 닫고 폐액 수집기의 밸브를 엽니다.관류 제트가 거의 사라져야 합니다. 각 관류 용액에 대해 동일한 테스트를 반복하십시오. 모든 관류 용액이 올바르게 흐르는 것을 확인한 후, 배스의 탈이온수를 원하는 배스 용액으로 교체하십시오.이제 기록 장치를 설정할 차례입니다. 매 패치 클램핑 세션 전에 은 기록 전극을 염화은으로 다시 코팅해야 합니다. 먼저, 피펫 홀더에서 전극 와이어를 제거하고 전극 와이어의 팁 부분을 신선한 표백제가 담긴 바이알에 최소 15분 동안 담그십시오.이렇게 하면 와이어에 염화은 층이 증착됩니다. 전극 와이어를 탈이온수로 헹구고 닦아 건조시킵니다. 그런 다음 염화은 전극을 피펫 홀더에 다시 설치합니다.이제 컴퓨터의 전원을 켭니다. 컴퓨터의 프린터 포트에 하드웨어 키를 연결하십시오. 데이터 수집 소프트웨어인 HEA pulse를 사용하려면 하드웨어 키가 반드시 연결되어 있어야 합니다.증폭기를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다. HEA 펄스. 프로토콜 파일을 불러온 후 자극 스케일과 같은 구성 설정을 조정합니다.구성 설정을 조정하는 목적은 테스트 전위가 명령 전위와 정확히 일치하도록 보장하는 것입니다. 이제 난자를 준비할 준비가 되었습니다. 배양기에서 난자를 꺼내십시오.난자를 stripping solution에 5~10분 동안 담급니다. stripping solution은 투명대(vitelline membrane)를 세포막으로부터 분리시켜 투명대를 제거할 수 있게 합니다. 5~10분 후, 난자에서 투명대를 조심스럽게 제거합니다.두 개의 핀셋을 사용합니다. 분리된 난모세포 부위는 매우 취약하므로 필요한 최소한으로만 이동시켜야 합니다. 분리된 난모세포가 공기나 기포에 노출되지 않도록 주의하면서, 충분한 용액이 채워진 유리 피펫을 사용하여 난모세포를 배양액으로 옮깁니다.이제 난모세포 막의 채널들이 노출되어 패치 피펫을 사용할 준비가 되었습니다. 유리 모세관을 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)에 삽입하여 패치 피펫을 제작하십시오. 현미경으로 피펫을 관찰하여 팁의 모양과 개구부 직경을 확인하십시오.기록 중 정전 용량 전류를 줄이기 위해 개구 직경은 2~4 µm가 되어야 하며, 팁을 매끄럽게 만들기 위해 팁에 왁스를 바른 후 가열하십시오. 현미경 하에서 연마하십시오. 피펫 팁을 피펫 용액 속에 넣고 플런저를 당겨 피펫 팁을 채우십시오.이렇게 하면 피펫 팁이 적셔집니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 피펫의 3분의 1을 피펫 용액으로 채웁니다. 그런 다음 은/염화은 전극이 들어 있는 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다.와이어 전극이 피펫 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 다음 단계는 준비된 난모세포에서 inside out 패치를 절제하는 것입니다. 먼저, 현미경 하에서 난모세포의 투명한 가장자리를 찾으십시오.조작기를 사용하여 패치 피펫을 난세포 가까이로 이동시키고, 피펫이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 목욕 용액 내에서 피펫의 직렬 저항을 기록합니다. 피펫 용액이 채워진 상태에서 목욕 용액에 잠겼을 때 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 1에서 1.5 milli ohms 사이입니다.이제 저항이 약 두 배가 될 때까지 피펫을 난자에 천천히 밀착시킵니다. 피펫 홀더에 연결된 흡입 튜브를 통해 입으로 부드럽게 흡입하여 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성합니다. 기가 씰이 형성된 것을 확인한 후, -30 millivolts 상태로 몇 분간 유지하여 패치를 안정화합니다.Inside-out 패치를 얻으려면, 피펫을 OO 부위로 빠르게 더 밀어 넣은 다음 조심스럽게 당겨서 패치를 절제하십시오. 이제 Inside-out 패치에서 패치 클램핑을 수행할 준비가 되었습니다. Inside-out 패치를 잡고 있는 피펫을 관류 팁의 입구에서 약 100 microns 떨어진 곳으로 이동시키십시오.폐액 수집용 전자 밸브를 닫고 원하는 관류액의 저장조 밸브를 엽니다. 패치 양단에 흐르는 전류의 기록을 시작합니다. 필요에 따라 전압과 관류액을 변경합니다.녹화를 마친 후에는 막힘을 방지하기 위해 탈이온수를 통과시켜 perfusion 튜빙의 펜슬과 팁을 세척하십시오. 여기서 얻은 패치 클램프 기록은 난자 막 패치의 야생형 BK 채널이 전압과 칼슘 모두에 반응함을 보여줍니다. 이 그림은 perfusion 용액 내의 칼슘 농도가 명목상 0인 상태에서의 패치 기록을 보여줍니다.전류 트레이스 위의 사각파는 패치에 인가된 전압을 나타냅니다. 50 millivolts에서 200 millivolts까지 50 millivolts 간격으로 네 가지 전압이 인가되었습니다. 최대 전압인 200 millivolts에서 약 two nano amps의 최대 전류가 측정되었습니다.전압 증가에 따른 전류 진폭의 이러한 증가는 BK 채널의 개방 확률이 전압과 함께 증가했음을 나타냅니다. 이 그림은 다양한 전압에 대한 inside-out 패치의 반응을 보여줍니다. 관류액에 1 µM의 calcium이 포함되었을 때 전압 단계(voltage steps)를 가하였습니다.이전 그림에서와 같이, 200 millivolt 전압 단계에 대한 반응에서, Perfu eight에 calcium이 있을 때의 상단 반응은 calcium이 없을 때의 2 nano amps와 비교하여 약 3 nano amps까지 증가하였습니다. 이는 calcium이 존재할 때 BK 채널의 개방 확률이 증가했음을 나타냅니다. 요약하자면, 이 패치 클램핑 절차는 BK 채널이 전압 및 calcium 의존적임을 보여주었습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 프로 연료 공급 시스템과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 철 채널 활성을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

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표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

우리는 Xenopus 난모세포에서 효소의 이종 발현을 통해 K+-역수송 P형 ATPase의 활성을 정량화하고 원자 흡수 분광 광도법으로 개별 세포로의 Rb+ 또는 Li+ 흡수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소 플럭스 실험에 대한 민감하고 안전한 대안으로 복잡한 동역학 연구를 용이하게 합니다.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.

효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험

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<em&gt; Xenopus의</em형광 측정으로&gt; 난자 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

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Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경

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여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.

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배우세요 Xenopus 난모세포에서 패치 클램프와 재관류 시스템을 이용한 BK 이온 채널 활성화 기록 방법. 전압과 칼슘 농도에 따른 채널 활성화 메커니즘을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

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