이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

본 절차의 전반적인 목적은 세포 내 용액을 제어하면서 제어된 전압 하에서 BK 채널의 활성화를 기록하는 것입니다. 이는 먼저 BK 채널 mRNA를 주입하여 Xenopus Cytes에서 BK 채널을 발현시킴으로써 달성됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 관류 시스템을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 난자 막과 패치 피펫 사이에 기가 씰(giga seal)을 형성하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 막 패치를 절제하는 것입니다. 최종적으로, 프로퓨전 시스템(profusion system)과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 얻은 결과는 BK 채널이 전압 및 칼슘 농도의 변화에 의해 활성화됨을 보여줍니다.

안녕하세요, 워싱턴 대학교 Jamie Zus 박사님 연구실의 진조영입니다. 이 방법은 이온 채널 활성화의 분자적 기전을 포함하여 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

절차의 첫 번째 단계는 패치 클램핑 며칠 전부터 시작되며, in vitro에서 전사된 BK 채널 mRNA를 사용합니다. Xenopus Lavu Cytes 5~6단계를 수확한 후, 사이트(cyte) 하나에 0.05~50 ng의 BK channel mRNA를 주입합니다. 이때 nano inject two auto nanoliter injector를 사용하십시오.

각 mRNA에 대해 12개의 난자에 주입 과정을 반복합니다. ND 96 용액을 사용하여 난자를 두 번 헹굽니다. 그 다음, 난자를 배양 플레이트에 넣고 18 °C에서 2일 이상 배양하여 난자가 BK 채널을 발현할 수 있도록 합니다.

2~5일간의 배양 후, 난세포는 BK 채널을 발현하게 되며 패치 클램핑 준비가 완료됩니다. 난세포를 다루기 전에, 퍼퓨전 시스템부터 시작하여 패치 클램핑에 필요한 모든 장비를 준비하십시오. 여기에 표시된 시스템은 automate valve link입니다.

16 profusion 시스템의 가압 질소는 profusion 용액을 용액 저장조에서 profusion 튜빙을 통해 profusion 펜슬과 팁으로 밀어냅니다. 각 profusion 용액 흐름의 유량은 하나의 저장조 밸브와 하나의 전자 밸브에 의해 제어됩니다. 본 프로토콜에서는 저장조 중 하나에 압력을 가하지 않아 폐기물 수집기 및 압력 방출 기전으로 활용합니다.

실험 전에 서로 다른 농도의 칼슘 또는 마그네슘을 포함한 관류액을 준비할 수 있습니다. 관류액을 저장조에 넣고 각 저장조에 칼슘 또는 마그네슘의 농도를 표시하십시오. 관류 시스템을 설정하려면 먼저 튜브를 관류 펜슬에 연결하십시오.

그런 다음 전자 밸브 컨트롤러를 켜고 전자 밸브를 열어 튜빙과 프로퓨전 펜슬에 막힘이나 기포가 없는지 확인합니다. 탈이온수로 채운 시린지를 사용하여 각 튜빙에 탈이온수를 통과시킵니다. 이 단계에서 튜빙을 용액 저장조에 연결하고 가스 실린더의 밸브를 열어 질소를 가압하여 공급합니다.

저장조 밸브 하나를 열어 저장조 용액 중 하나로 튜브를 채웁니다. 필요한 경우, 저장조 밸브를 클릭하여 용액 내의 기포를 제거합니다. 튜브에 용액이 채워지면 저장조 밸브를 닫고, 관류 팁에 물을 채운 후 관류 펜슬에 나사식으로 고정합니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 팁을 연결할 때, 모델링 클레이를 사용하여 퍼퓨전 펜슬을 배스 스테이지에 고정하고, 퍼퓨전 팁이 배스 공간 내에 있는지 확인하십시오. 이제 퍼퓨전 시스템 설정이 완료되었습니다.

이 단계에서 배스에 탈이온수를 추가하십시오. 퍼퓨전 팁이 물에 잠겼는지 확인하십시오. 각 퍼퓨전 용액이 퍼퓨전 팁을 통해 제대로 나오는지 테스트하십시오.

폐액 수집기 튜브에 연결된 전자 밸브를 닫고, 관류액 중 하나에 해당하는 밸브를 엽니다. 현미경 하에서 관류 팁으로부터 나오는 관류액 제트를 관찰합니다. 해당 관류액의 밸브를 닫고 폐액 수집기의 밸브를 엽니다.

관류 제트가 거의 사라져야 합니다. 각 관류 용액에 대해 동일한 테스트를 반복하십시오. 모든 관류 용액이 올바르게 흐르는 것을 확인한 후, 배스의 탈이온수를 원하는 배스 용액으로 교체하십시오.

이제 기록 장치를 설정할 차례입니다. 매 패치 클램핑 세션 전에 은 기록 전극을 염화은으로 다시 코팅해야 합니다. 먼저, 피펫 홀더에서 전극 와이어를 제거하고 전극 와이어의 팁 부분을 신선한 표백제가 담긴 바이알에 최소 15분 동안 담그십시오.

이렇게 하면 와이어에 염화은 층이 증착됩니다. 전극 와이어를 탈이온수로 헹구고 닦아 건조시킵니다. 그런 다음 염화은 전극을 피펫 홀더에 다시 설치합니다.

이제 컴퓨터의 전원을 켭니다. 컴퓨터의 프린터 포트에 하드웨어 키를 연결하십시오. 데이터 수집 소프트웨어인 HEA pulse를 사용하려면 하드웨어 키가 반드시 연결되어 있어야 합니다.

증폭기를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다. HEA 펄스. 프로토콜 파일을 불러온 후 자극 스케일과 같은 구성 설정을 조정합니다.

구성 설정을 조정하는 목적은 테스트 전위가 명령 전위와 정확히 일치하도록 보장하는 것입니다. 이제 난자를 준비할 준비가 되었습니다. 배양기에서 난자를 꺼내십시오.

난자를 stripping solution에 5~10분 동안 담급니다. stripping solution은 투명대(vitelline membrane)를 세포막으로부터 분리시켜 투명대를 제거할 수 있게 합니다. 5~10분 후, 난자에서 투명대를 조심스럽게 제거합니다.

두 개의 핀셋을 사용합니다. 분리된 난모세포 부위는 매우 취약하므로 필요한 최소한으로만 이동시켜야 합니다. 분리된 난모세포가 공기나 기포에 노출되지 않도록 주의하면서, 충분한 용액이 채워진 유리 피펫을 사용하여 난모세포를 배양액으로 옮깁니다.

이제 난모세포 막의 채널들이 노출되어 패치 피펫을 사용할 준비가 되었습니다. 유리 모세관을 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)에 삽입하여 패치 피펫을 제작하십시오. 현미경으로 피펫을 관찰하여 팁의 모양과 개구부 직경을 확인하십시오.

기록 중 정전 용량 전류를 줄이기 위해 개구 직경은 2~4 µm가 되어야 하며, 팁을 매끄럽게 만들기 위해 팁에 왁스를 바른 후 가열하십시오. 현미경 하에서 연마하십시오. 피펫 팁을 피펫 용액 속에 넣고 플런저를 당겨 피펫 팁을 채우십시오.

이렇게 하면 피펫 팁이 적셔집니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 피펫의 3분의 1을 피펫 용액으로 채웁니다. 그런 다음 은/염화은 전극이 들어 있는 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다.

와이어 전극이 피펫 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 다음 단계는 준비된 난모세포에서 inside out 패치를 절제하는 것입니다. 먼저, 현미경 하에서 난모세포의 투명한 가장자리를 찾으십시오.

조작기를 사용하여 패치 피펫을 난세포 가까이로 이동시키고, 피펫이 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 목욕 용액 내에서 피펫의 직렬 저항을 기록합니다. 피펫 용액이 채워진 상태에서 목욕 용액에 잠겼을 때 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 1에서 1.5 milli ohms 사이입니다.

이제 저항이 약 두 배가 될 때까지 피펫을 난자에 천천히 밀착시킵니다. 피펫 홀더에 연결된 흡입 튜브를 통해 입으로 부드럽게 흡입하여 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성합니다. 기가 씰이 형성된 것을 확인한 후, -30 millivolts 상태로 몇 분간 유지하여 패치를 안정화합니다.

Inside-out 패치를 얻으려면, 피펫을 OO 부위로 빠르게 더 밀어 넣은 다음 조심스럽게 당겨서 패치를 절제하십시오. 이제 Inside-out 패치에서 패치 클램핑을 수행할 준비가 되었습니다. Inside-out 패치를 잡고 있는 피펫을 관류 팁의 입구에서 약 100 microns 떨어진 곳으로 이동시키십시오.

폐액 수집용 전자 밸브를 닫고 원하는 관류액의 저장조 밸브를 엽니다. 패치 양단에 흐르는 전류의 기록을 시작합니다. 필요에 따라 전압과 관류액을 변경합니다.

녹화를 마친 후에는 막힘을 방지하기 위해 탈이온수를 통과시켜 perfusion 튜빙의 펜슬과 팁을 세척하십시오. 여기서 얻은 패치 클램프 기록은 난자 막 패치의 야생형 BK 채널이 전압과 칼슘 모두에 반응함을 보여줍니다. 이 그림은 perfusion 용액 내의 칼슘 농도가 명목상 0인 상태에서의 패치 기록을 보여줍니다.

전류 트레이스 위의 사각파는 패치에 인가된 전압을 나타냅니다. 50 millivolts에서 200 millivolts까지 50 millivolts 간격으로 네 가지 전압이 인가되었습니다. 최대 전압인 200 millivolts에서 약 two nano amps의 최대 전류가 측정되었습니다.

전압 증가에 따른 전류 진폭의 이러한 증가는 BK 채널의 개방 확률이 전압과 함께 증가했음을 나타냅니다. 이 그림은 다양한 전압에 대한 inside-out 패치의 반응을 보여줍니다. 관류액에 1 µM의 calcium이 포함되었을 때 전압 단계(voltage steps)를 가하였습니다.

이전 그림에서와 같이, 200 millivolt 전압 단계에 대한 반응에서, Perfu eight에 calcium이 있을 때의 상단 반응은 calcium이 없을 때의 2 nano amps와 비교하여 약 3 nano amps까지 증가하였습니다. 이는 calcium이 존재할 때 BK 채널의 개방 확률이 증가했음을 나타냅니다. 요약하자면, 이 패치 클램핑 절차는 BK 채널이 전압 및 calcium 의존적임을 보여주었습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 프로 연료 공급 시스템과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 철 채널 활성을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.