이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

이 절차의 전반적인 목표는 제어된 전압에서 BK 채널 활성화를 기록하는 동시에 세포 내 용액을 제어하는 것입니다. 이는 먼저 Xenopus Cytes의 BK 채널에 BK 채널 mRNA를 주입하여 발현함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 관류 시스템을 준비하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 난모세포 막과 패치 피펫 사이에 기가 밀봉을 형성하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 멤브레인 패치를 절제하는 것입니다. 궁극적으로 풍부한 시스템과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 얻은 결과는 BK 채널이 전압 및 칼슘 농도의 변화에 의해 활성화된다는 것을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 제이미 주스 박사 연구실의 조영 교수입니다. 이 방법은 이온 채널 활성화를 위한 분자 메커니즘에 관한 질문을 포함하여 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하겠습니다.

절차의 첫 번째 단계는 패치 클램핑 며칠 전에 시작되며 in vitro에서 전사된 BK 채널 mRNA를 사용합니다. Xenopus Lavu Cytes 5-6기를 채취한 후 0.05-50 나노그램의 BK 채널 mRNA를 cyte에 주입합니다. 나노 주입 2 개의 자동 나노 리터 주입기를 사용합니다.

주사 후 각 mRNA에 대해 12개의 난모세포에 대해 주사를 반복합니다. ND 96 용액을 사용하여 난모세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 난모세포를 배양판에 넣고 난모세포가 BK 채널을 발현할 시간을 확보하기 위해 섭씨 18도에서 2일 이상 배양합니다.

2-5일의 배양 후 난모세포는 BK 채널을 발현해야 하므로 이미 패치 클램핑을 위한 것입니다. 난모세포를 다루기 전에 관류 시스템부터 시작하여 패치 클램핑에 필요한 모든 것을 설정하십시오. 여기에 표시된 시스템은 자동화 밸브 링크입니다.

16 Profusion System 가압 질소는 Profusion 튜브를 통해 용액 저장소에서 Profusion Pencil과 Tip으로 Profusion 용액을 밀어냅니다. 풍성한 해결책의 각 시내의 교류는 1개의 reservoir 벨브 및 1개의 전자 벨브에 의해 통제됩니다. 이 프로토콜에서 저장소 중 하나는 압력이 가해지지 않으며 폐기물 수집기 및 압력 방출 메커니즘으로 작동합니다.

칼슘 또는 마그네슘 농도가 다른 관류 용액을 실험 전에 준비할 수 있습니다. 관류 용액을 저장소에 추가하고 각 용액에 칼슘 또는 마그네슘의 농도를 표시하도록 표시합니다. 풍력 시스템을 먼저 설정하려면 튜브를 풍력 연필에 연결하십시오.

그런 다음 전자 밸브 컨트롤러를 켜고 전자 밸브를 열어 튜브와 풍성한 연필에 막힘과 기포가 없는지 확인합니다. 탈이온수로 채워진 주사기를 사용하여 각 튜브를 통해 탈이온수를 밀어 넣습니다. 이 시점에서 튜브를 용액 저장소에 연결하고 가스 실린더의 밸브를 열어 질소에 가압을 적용합니다.

하나의 저장 탱크 밸브를 열어 튜브에 저장 용액 중 하나를 채웁니다. 필요한 경우 저장 탱크 밸브를 클릭하여 용액의 기포를 제거합니다. 튜브에 용액이 채워진 후 저장 밸브를 닫고 관류 팁에 물을 채운 다음 관류 연필에 나사로 고정합니다.

거품이 끼지 않도록 주의하세요. 팁을 연결할 때 모델링 클레이를 사용하여 관류 연필을 목욕 단계에 고정하고 풍성한 팁이 목욕 공간에 있는지 확인하십시오. 이제 풍요로운 시스템이 설정되었습니다.

이 시점에서 욕조에 탈이온수를 넣으십시오. 풍성한 팁이 물에 잠겨 있는지 확인하십시오. 각 관류 용액이 관류 팁에서 올바르게 나오는지 테스트합니다.

폐기물 수집기의 튜브에 연결된 전자 밸브를 닫고 풍부한 용액 중 하나에 대한 밸브를 엽니다. 현미경으로 관류 팁에서 나오는 풍성 유체의 제트를 관찰하십시오. 그 풍부한 용액의 밸브를 닫고 폐기물 수집기의 밸브를 엽니다.

풍성한 제트기는 거의 사라져야 합니다. 각 관류 용액에 대해 동일한 테스트를 반복합니다. 모든 관류 용액이 올바르게 흐르는 것을 확인했으면 수조의 탈이온수를 원하는 수조 용액으로 교체하십시오.

이제 녹음 장치를 설정할 차례입니다. 각 패치 cl 전에 은 기록 전극을 염화은으로 다시 코팅해야 합니다.amping 세션. 먼저 피펫 홀더에서 전극 와이어를 제거하고 전극 와이어의 끝 절반을 새 표백제가 들어 있는 바이알에 최소 15분 동안 담그십시오.

이것은 와이어에 염화은 층을 침전시킵니다. 전극선을 탈이온수로 헹구고 두드려 건조시킵니다. 그런 다음 은염화은 전극을 피펫 홀더에 다시 설치합니다.

이제 컴퓨터를 켜십시오. 하드웨어 키를 컴퓨터의 프린터 포트에 꽂습니다. HEA pulse인 데이터 수집 소프트웨어를 사용하려면 하드웨어 키가 연결되어 있어야 합니다.

스위치를 켜다 ampliifier를 선택하고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. HEA 펄스. 프로토콜 파일을 로드하고 자극 스케일과 같은 구성 설정을 조정합니다.

구성 설정을 조정하는 목표는 테스트 전위가 명령 전위와 정확히 동일한지 확인하는 것입니다. 이제 난모세포를 준비할 준비가 되었습니다. 인큐베이터에서 난모세포를 회수합니다.

난모세포를 스트리핑 용액에 5-10분 동안 담급니다. 스트리핑 용액은 원형질막에서 viel membrane을 분리하여 viel membrane을 스트리핑하는 것을 가능하게 합니다. 5분에서 10분 후, 난모세포에서 유리막을 부드럽게 떼어냅니다.

두 개의 집게를 사용합니다. divi OC 사이트는 매우 취약하므로 필요한 만큼 적게 움직여야 합니다. Devi 난모세포가 공기나 거품에 노출되지 않도록 주의하고 난모세포를 욕조로 이동시킬 수 있을 만큼 충분한 용액으로 채워진 유리 피펫을 사용하십시오.

이제 난모세포 막의 채널이 노출되어 패치 피펫을 사용할 준비가 되었습니다. 유리 모세관 튜브를 마이크로 피펫 풀러에 삽입하여 패치 피펫을 당깁니다. 현미경으로 피펫을 관찰하여 팁 모양과 개구부 직경을 측정합니다.

개구부 직경은 녹음 중 정전 용량 전류를 줄이기 위해 2-4마이크로미터여야 하며, 부드러운 팁을 보장하기 위해 팁을 왁스로 코팅한 다음 발사해야 합니다. 현미경으로 닦으십시오. 피펫 팁을 피펫 용액 내부에 놓고 플런저를 당겨 피펫 팁을 채웁니다.

이것은 피펫의 끝을 적십니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 피펫 용액으로 피펫을 1/3 정도 채웁니다. 그런 다음 은, 염화은 전극이 내부에 있는 피펫 홀더에 피펫을 넣습니다.

와이어 전극이 피펫 용액과 접촉하고 있는지 확인하십시오. 다음 단계는 준비된 난모세포에서 내부 패치를 절제하는 것입니다. 먼저 현미경으로 난모세포의 투명한 가장자리를 찾습니다.

매니퓰레이터를 사용하여 패치 피펫을 난모세포 가까이로 이동하여 난모세포가 물에 잠겼는지 확인합니다. 수조 용액에서 피펫의 직렬 저항을 기록하십시오. 패치 피펫의 이상적인 직렬 저항은 피펫 용액으로 채워지고 수조 용액에 담길 때 1-1.5 밀리 옴입니다.

이제 피펫의 저항이 약 두 배가 될 때까지 피펫을 난모세포에 대고 천천히 밀어 넣습니다. 피펫 홀더에 연결된 흡입 튜브를 통해 입으로 부드럽게 흡입하여 기가 옴 밀봉을 얻습니다. 기가 씰이 형성된 것을 확인한 후 몇 분 동안 영하 30밀리볼트로 유지하여 패치를 안정화합니다.

인사이드 아웃 패치를 얻으려면 피펫을 OO 부위로 빠르게 밀어 넣은 다음 부드럽게 당겨 패치를 절제하십시오. 이제 내부 외부 패치가 패치 클램핑을 위한 준비가 되었습니다. 인사이드 아웃 패치를 고정하는 피펫을 관류 팁의 개구부에서 약 100미크론 떨어진 곳으로 이동합니다.

폐기물 수거를 위해 전자 밸브를 닫고 원하는 풍부한 용액을 위해 저장 밸브를 엽니다. 패치 전체의 전류를 기록하기 시작합니다. 원하는 대로 전압 및 풍력 솔루션을 변경합니다.

녹음이 끝나면 막힘을 방지하기 위해 탈이온수를 밀어 넣어 풍성한 튜브 연필과 팁을 청소합니다. 여기에서 얻은 패치 클램프 기록은 난모세포 막 패치의 야생형 BK 채널이 전압과 칼슘 모두에 반응한다는 것을 보여줍니다. 이 그림은 관류 용액에서 공칭 칼슘이 0인 패치 기록을 보여줍니다.

전류 트레이스 위의 구형파는 패치에 적용된 전압을 나타냅니다. 50 밀리 볼트에서 200 밀리 볼트까지 50 밀리 볼트씩 증가하는 4 가지 전압이 적용되었습니다. 최대 전류, 약 2 나노 암페어는 200 밀리 볼트의 최대 전압으로 얻어졌습니다.

전압이 증가함에 따라 전류 진폭이 증가한다는 것은 BK 채널의 개방 확률이 전압에 따라 증가함을 나타냅니다. 이 그림은 서로 다른 전압에 대한 인사이드 아웃 패치의 응답을 보여줍니다. 관류 용액에 1 마이크로 몰 칼슘이 있을 때 전압 단계가 적용되었습니다.

진행 그림과 같이 200 밀리 볼트 전압 단계에 대한 응답, 칼슘이없는 2 나노 암페어에 비해 Perfu 8에 칼슘이 있을 때 최대 응답이 약 3 나노 암페어로 증가했습니다. 이는 칼슘이 있을 때 BK 채널의 개방 확률이 증가했음을 나타냅니다. 요약하면, 이 패치 클램핑 절차는 BK 채널이 전압과 칼슘에 의존한다는 것을 보여주었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 프로 연료 공급 시스템과 결합된 패치 클램프 기술을 사용하여 Iron Channel 활성화를 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 지금. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.