Name: Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: 학습하세요 면역세포화학법을 이용한 시냅스 수량화 방법으로, 배양 신경세포와 뇌 조직에서 시냅스 형성을 정량 분석합니다. 이 기술은 신경과학 연구에서 시냅스 연결성을 객관적으로 평가하는 데 필수적입니다.

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Puncta 분석기 플러그인 J는 배리 워크 (현재 주소 : Physion 컨설팅)에 의해 작성되었습니다 이미지를위한 벤 A. Barres의 연구실에서 (스탠포드 대학). 기금; <ul><li> 알프레드 P. 슬로언 재단 </li><li> 에스더 A. 요셉 Klingenstein 펀드, 주식 회사 </li><li> 광범위한 바이오 메디컬 연구 재단 </li><li> 헌팅턴의 질병 이니셔티브에 대한 치료 </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

위에서 설명한 버렸네 분석은 하나의 문화를 정화 또는 뇌 섹션에서, 우리는 RGCs의 흥분성의 예측에 주로 초점을했었습니다 우리의 실험 목표의 컨텍스트를 기반으로합니다. 우리는 흥분성의 시냅스 (표 1) 라벨을 위해 잘 작동 참조 테이블 목록 항체를 제공하고 있습니다. 이 버렸네 분석은 버렸네의 모든 인구의 연결 번호 또는 선택 사전 및 postsynaptic 마커가있는 다른 신경 subtype를 정할 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 버렸네 분석이 여기에 설명된는 적절한 사전 및 postsynaptic 마커 10,11를 사용하여 (같은 glutamatergic 반대) GABA - ergic 시냅스를 공부하고 적용할 수 있습니다. 이 버렸네 분석은 뉴런 사이의 시냅스 연결에 변화를 조사하는 실험실을위한 중요한 도구입니다. 그것이 전자 현미경 및 전기 생리학이 분석의 결과를 확증하기 위해 필요한 있지만, 그...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 항원 </td><td> 종 </td><td> Polyclonal / 단클론 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노동 희석 </td><td> 문화 웍스 </td><td> 섹션 웍스 </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presynaptic </td><td> Synapsin </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> 바순 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 분석 설계 </td><td> VAM - PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> 바순 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin 1 </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptophysin (C1.7.2) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> 기니피그 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptic </td><td> PSD - 95 (6G6 - 1C9 클론) </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 친화 바이오 시약 </td><td> MA1 - 045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD - 95 </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> 호머 </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> 호머 </td><td> 쥐 </td><td> Polyclonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> 토끼 </td><td> Polyclonal </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> 마우스 </td><td> 단클론 </td><td> 시냅스 시스템 </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> 표 1 : 우리가 성공적으로 버렸네 분석에 이용한다는 좋은 사전과 postsynaptic 마커 목록 예제. 이 사용할 수있는 모든 마커의 완전한 목록을지지 않습니다. Y = 예, N = 아니오, ND = 결정되지 않습니다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 고양이. 번호 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> 폴리 - D - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 로체 진단 GMBH </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 16,210 </td></tr><tr><td> DAPI로 VectaShield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H - 1200 </td></tr><tr><td> OCT </td><td> 조직 테크 </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> 트리스 -베이스 (50 ㎜) </td><td> 어부 </td><td> BP152 - 5 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> 리터 - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> L - 1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA 솔루션 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,711 </td></tr><tr><td> 입상 PFA </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 19,210 </td></tr><tr><td> 24 잘 문화 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 염소 항 마우스 알렉사 복합 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> 공급 </td><td> 회사 </td><td> 고양이. 번호 </td></tr><tr><td> 12mm, 번호 0 유리 coverslips </td><td> 칼 헥트 GMBH </td><td> 1,105,209 </td></tr><tr><td> 번호 1.5 유리 coverslip (조각)을 </td><td> VWR 과학 </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> 유리 슬라이드 </td><td> VWR 과학 </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 immunocytochemistry 기반 어세이

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

신경 과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 버렸네 형성의 초기 단계를 지시 분자 신호를 이해하는 것입니다. 따라서 그것은 시냅스 연결에 변화를 수치 객관적 방법을 개발하기 위해 필수적이되었습니다. 샘플 고정부터,이 프로토콜의 세부 내용은 방법 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 수치. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다. 이 colocalizations의 수는 ImageJ 분석 소프트웨어 플랫폼에 따라 Puncta 분석기 (요청시 가능합니다 바리 워크, c.eroglu @ cellbio.duke.edu 작성한)에 플러그를 사용하여 계량입니다. 이 프로토콜에 설명되어 버렸네 분석은 선택적 사전 및 postsynaptic 마커를 가지고있는 신경 조직이나 문화를 준비 적용할 수 있습니다. 이 버렸네 분석이 널리 시냅스 개발 연구에 활용할 수있는 귀중한 도구입니다.

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

신경과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 시냅스 형성의 초기 단계를 지시하는 분자적 신호를 이해하는 것입니다. 이에 따라 ...

신경과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 시냅스 형성의 초기 단계를 지시하는 분자적 신호를 이해하는 것입니다. 이에 따라 시냅스 연결성의 변화를 정량화하기 위한 객관적인 접근법을 개발하는 것이 필수적이 되었습니다. 다양한 실험 표본에서 시냅스 수를 정량화하기 위해, 배양된 뉴런이나 뇌 조직의 동결 절편 표본을 선택적 시냅스 전 및 후 마커로 염색하여 뉴런 간의 시냅스 접촉 지점을 표시합니다.그 다음, 세포 또는 조직을 형광 현미경으로 촬영하여 두 가지 면역조직화학 마커에 해당하는 각 채널당 8비트 이미지를 획득합니다. 이미지는 puncta analyzer가 포함된 Image J 1.29를 사용하여 분석합니다. 시냅스 전 및 후 마커 간의 공국소화(colocalization) 정도를 결정하기 위해, 공국소화 지점을 이용하여 표본 내에 존재하는 시냅스의 수를 결정할 수 있습니다.전자현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 여기서 설명하는 기술의 주된 장점은, 시냅스 분석법을 통해 시냅스 수의 정량화 및 분석을 훨씬 더 높은 처리량으로 수행할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 주요 응용 분야는 알츠하이머병, 간질 또는 자폐증과 같이 시냅스 연결성의 이상이 기저 병리의 원인으로 지목되는 임상 질환의 진단 및 치료로 확장됩니다. 또한, 이 기술은 영향을 받은 뉴런의 상호 시냅스 형성 능력에서 나타나는 결핍을 감소시키거나 개선할 수 있는 중재 방법을 식별하는 데 활용될 수 있습니다.이 방법은 뇌 발달 연구에 유용하지만, 각 접촉 부위의 마주 보는 면을 선택적으로 표지할 수 있는 능력이 있다면, 관심 있는 다른 모델 생물체나 장기 시스템에서 세포 간 접촉 수를 연구하거나 정량화하는 데에도 적용할 수 있습니다. P5-7 동물에서 수확한 쥐 망막에서 정제된 쥐 망막 신경절 세포를 poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버 슬립에 플레이팅하여 신경세포 배양물을 준비합니다. 24-well 플레이트에서 세포를 transfection 전까지 37 °C에서 3~5일 동안 배양합니다.형질전환 후, 도말된 세포가 충분히 성숙하여 시냅스가 형성될 수 있도록 세포를 7~8일 동안 추가로 배양합니다. 웰에서 배양액을 제거하고, 각 웰에 미리 데운 4% para formaldehyde 500 µL를 첨가하여 7분 동안 고정합니다. 상온에서 고정을 마친 후, phosphate buffered saline으로 세포를 3회 세척합니다.웰 내부의 세포가 절

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

출처: McLeod, F., et al. 해마 설치류 뇌 절편의 시냅스 밀도 평가. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 컨포칼 면역형광 분석을 사용하여 해마 뇌 절편에서 시냅스 마커를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 슬라이스는 시냅스전 및 시냅스후 마커를 표적으로 하는 1차 항체로 면역 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 면역 염색됩니다. 그런 다음 표지된 마커는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하여 공동 국소화를 통해 시냅스 구조를 평가합니다.

면역형광을 이용한 마우스 해마 절편의 시냅스 현미경 분석

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

학습하세요 면역세포화학법을 이용한 시냅스 수량화 방법으로, 배양 신경세포와 뇌 조직에서 시냅스 형성을 정량 분석합니다. 이 기술은 신경과학 연구에서 시냅스 연결성을 객관적으로 평가하는 데 필수적입니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

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