Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

신경 과학에서 가장 중요한 목표 중 하나는 시냅스 형성의 초기 단계를 지시하는 분자 신호를 이해하는 것입니다. 따라서 시냅스 연결성의 변화를 정량화하기 위한 객관적인 접근 방식을 개발하는 것이 필수적이 되었습니다. 다양한 실험 제제에서 시냅스 수를 정량화하기 위해 배양된 뉴런 또는 극저온 절편 뇌 조직 제제는 뉴런 간의 시냅스 접촉 지점을 라벨링하기 위해 선택적 시냅스 전후 마커로 염색됩니다.

그런 다음 세포 또는 조직을 형광 현미경에서 이미지화하고 두 개의 면역조직화학 마커에 해당하는 각 채널에 필요한 8비트 이미지를 이미지화합니다. 이미지는 퐁타 분석기와 함께 이미지 J 1.29를 사용하여 분석됩니다. 시냅스 마커 전과 후 사이의 공동 국소화 정도를 결정하기 위해, 그런 다음 공동 국소화 지점을 사용하여 제제에 존재하는 시냅스의 수를 결정할 수 있습니다.

전자 현미경과 같은 기존 방법에 비해 여기에 설명된 기술의 주요 장점은 시냅스 분석을 통해 훨씬 더 높은 처리량의 분석 및 시냅스 수의 정량화가 가능하다는 것입니다. 이 기술의 주요 함의는 알츠하이머병, 간질 또는 자폐증과 같은 임상 장애의 진단 및 치료로 확장되며, 이러한 장애에서는 이상 및 시냅스 연결성이 기저 병리학의 기초로 연루되어 있습니다. 이 기술은 영향을 받은 뉴런이 서로 시냅스를 형성하는 능력에서 볼 수 있는 결함을 줄이거나 개선할 수 있는 개입 형태를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법은 뇌 발달을 연구하는 데 유용하지만, 모든 접촉 부위의 반대쪽 각 면에 선택적으로 레이블을 지정할 수 있는 세포 간 접촉의 수를 연구하거나 정량화하는 데 관심이 있는 다른 모델 유기체 또는 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 쥐의 망막에서 정제된 쥐의 망막 신경절 세포를 poly de lycine으로 코팅된 유리 커버 슬립에 P 5 - 7마리의 동물에서 채취하여 도금하여 신경 세포 배양을 준비합니다. 24 웰 플레이트에서, 세포는 형질주입 전 3 내지 5일 동안 섭씨 37도에서 성장할 수 있다.

형질주입 후 추가로 7-8일 동안 세포를 배양하여 도금된 세포가 충분히 성숙했을 때 시냅스가 발달할 수 있도록 합니다. 웰에서 배양 배지를 제거하고 7분 동안 고정된 각 웰에 500마이크로리터의 예열된 4% 파라 포름알데히드를 추가합니다. 고정 후 실온에서 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 헹굽니다.

세포가 우물에서 건조되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 완충액이 우물에서 제거되면 즉시 다음 완충액으로 교체해야 합니다. 노멀 염소 세럼 50%와 트리톤 X 100 0.2%를 함유한 블로킹 버퍼를 준비합니다.

각각에서 PBS를 제거한 후 각 웰에 200마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하고 30분 동안 차단합니다. 실온에서 차단 버퍼를 제거하고 세 번 헹굽니다. PBS를 사용하여 선택한 시냅스 전후 항체 쌍을 포함하는 90% 항체 완충액, 10% NGS 용액에서 1차 항체 희석액을 준비합니다.

여기에 토끼 antis synapsin, 시냅스 전 마커 및 마우스 anti homer가 있습니다. 포스트 시냅스 마커는 침전된 항체를 제거하기 위하여 이용된 분리기, 벤치탑 분리기에 있는 최대 속도로 5 분 동안 1 차 항체 희석, 그 후에 각각에 1 차적인 항체 해결책의 200 마이크로리터를 추가합니다. 1차 용액의 건조를 방지하기 위해 플레이트를 가습 용기에 잘 놓습니다.

1차 항체로 배양한 후 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 각 우물을 세 번 헹굽니다. PBS를 이용하여 적절한 2차 항체 200마이크로리터를 첨가하고, 10%NGS를 함유하는 항체 완충액에 1000으로 희석하여 제조한다.

이전과 마찬가지로 접시를 가습실에 넣고 2차 배양 후 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS로 각 우물을 3-4회 헹굽니다. DPI가 있는 벡터 쉴드 장착 매체 한 방울을 유리 슬라이드에 놓습니다.

그런 다음 셀이 있는 커버 유리를 드롭에 뒤집어 장착합니다. 마지막으로 커버 슬립의 가장자리 주위에 투명한 매니큐어를 바릅니다. 적용 중 커버가 미끄러지거나 살짝 움직이지 않도록 주의하십시오.

이렇게 하면 세포가 공유되므로 건조하고 어두운 곳에서 슬라이드를 최소 30분 동안 건조시킵니다. 여기에서 이미징은 적절한 필터 세트와 63회 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 zes axio 이미저 형광 현미경을 사용하여 수행됩니다. transfection되지 않은 세포가 포함된 슬라이드를 microscope stage에 놓습니다.

세포핵을 시각화하기 위해 DPI 필터 세트를 사용하여 가장 가까운 이웃에서 최소 2개의 세포 직경만큼 떨어져 있는 세포를 선택합니다. 이 단계에서 DPI를 사용하면 바이어스를 방지하고 셀 선택의 임의성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 선택된 각 셀에 대해 적절한 필터 세트(이 경우 GFP 및 Texas Red)를 사용하여 8비트 이미지를 얻습니다.

중첩된 유사 색상 이미지는 시냅스 전후 마커를 각각 빨간색과 녹색으로 표시해야 합니다. 다음으로, 형질주입된 세포가 포함된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 여기서 세포는 TD 토마토 발현 벡터로 형질 주입되었습니다.

이 마커를 사용하여 이전과 같이 셀을 선택합니다. 선택한 각 세포에 대해 적절한 필터 세트(이 경우 GFP, Texas Red 및 Sci five)를 사용하여 8개의 핏 이미지를 얻습니다. 중첩된 유사 색상 이미지에는 빨간색, 녹색 및 파란색의 시냅스 후 마커가 있어야 합니다.

여기서 펑크 분석기 프로그램은 co-localized synaptic puncture의 정량화에 사용됩니다. Puncta 분석기 플러그인은 Barry Walk가 작성했으며 이미지 J 1.26에서 요청 시 사용할 수 있습니다. 수집된 이미지 중 하나를 엽니다.

원형 선택 도구를 사용하여 관심 있는 SOR 주위로 방사상으로 약 1 셀 지름의 영역을 선택합니다. 관심 영역을 선택한 상태에서 Plugins 메뉴로 이동하여 Select Red Channel Green Channel이 나타나는 분석 옵션 창에서 펑크 분석기를 선택합니다. 첫 번째는 배경을 빼고 결과 파일을 설정합니다.

확인을 클릭합니다. 그런 다음 결과를 저장할 위치를 정의합니다. 이러한 결과는 나타나는 창에서 추가 분석을 위해 Excel로 내보낼 수 있습니다.

그런 다음 롤링 볼 반경 50이 선택되어 있는지 확인하고 흰색 배경 옵션의 선택을 취소합니다. 이 수정은 필수는 아니지만 응용 프로그램 사용자가 선호하는 경우가 많습니다. 쉽게 시각화하려면 확인을 클릭합니다.

빨간색 채널 이미지에 해당하는 마스크와 함께 새 창이 나타납니다. 빨간색 마스크가 가능한 한 많은 신중한 개별 펑크로 일치할 때까지 임계값을 조정합니다. 너무 많은 소음을 일으키지 않고 완료를 클릭합니다.

최소 펑크 크기를 4픽셀로 설정합니다. 다른 것은 수정하지 마십시오. 확인을 클릭합니다.

이번에는 녹색 채널에 대해 이전 단계를 반복합니다. 녹색 채널로 이 작업을 반복한 후 플러그인은 각 채널의 puncta에 해당하는 수량화를 개별적으로 제공하고 두 채널 사이에 co-localized puncta를 제공합니다. 여기에 표시된 시냅스 분석은 뇌의 냉동 절편과 척수 또는 망막과 같은 다른 신경계 조직에 적용할 수 있습니다.

단, 적절한 pre-synaptic marker pair(시냅스 전후 마커 쌍)가 있는 경우. 출혈로 안락사되고 PBS가 풍부해진 쥐의 뇌 조직을 채취하는 것으로 시작하십시오. 다음날 하룻밤 동안 섭씨 4도의 PBS에 4%파라알데히드를 뇌 전체에 넣습니다.

PBS로 뇌를 세 번 헹굽니다. Cryo는 30% 자당에 넣어 뇌를 보호합니다. PBS에서.

조직은 처음에 떠 있으며 조직이 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도를 유지합니다. 이 단계에서 극저온 보호가 완료됩니다. 다음으로, 20% 슈크로스에서 OCT 및 PBS에 대한 2:1 용액으로 절단을 위해 원하는 방향에서 브레인을 삽입합니다.

예를 들어, 시상면 또는 관상동맥이 있습니다. 그런 다음 드라이 아이스 양동이 위에 평평한 금속 표면을 놓습니다. 내장된 뇌를 그 위에 올려 놓아 얼린 후 얼린 다음 뇌를 냉동 백에 옮겨 최대 1년 동안 섭씨 영하 80도에서 절편

저온 유지 장치 극저온 절편을 사용하여 조직을 12-16 미크론 절편으로 나누고 유리 슬라이드에 장착합니다. 그런 다음 슬라이드를 섭씨 37도의 오븐에 넣어 건조시킵니다. 그런 다음 PBS로 세 번 헹구어 잔류 OCT를 제거합니다.

파라핀 펜은 활주의 주위에 소수성 방벽을 창조하기 위하여 사용되고 막는 완충기는 파라핀 국경에 의해 활주 떨어져 흐르는 것에서 막는 활주에 추가됩니다. 다음 장소를 막기 위하여 실내 온도에 1 시간 동안 PBS에 있는 20%normal 산양 혈청에 있는 활주를 두십시오. PBS에서 0.3%의 트리톤 및 10%의 정상 염소 혈청으로 희석된 1차 항체의 절편.

여기서, 토끼 antitit, PSD 95는 글루타메이트성, 시냅스후 구획을 라벨링하는 데 사용되며 Guinea pig anti v glu two는 글루타메이트성 시냅스 전 말단을 라벨링하는 데 사용됩니다. 슬라이드를 섭씨 4도에 놓고 배양 후 36-60시간 동안 배양합니다. 슬라이드를 PBS에 각각 15분 동안 세 번 담궈 1차 항체를 씻어냅니다.

이 단계가 끝나면 슬라이드를 직사광선으로부터 보호해야 합니다. PBS에서 1-200으로 희석된 2차 항체를 0.3%의 트리톤과 10%의 정상 염소 혈청으로 적용합니다. 여기, 염소 안티 기니피그.

Alexa 4 8 8 및 염소 안티 토끼. Alexa 5 9 4가 사용됩니다. 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

슬라이드를 PBS에 각각 15분 동안 4번 담가 장착하여 세척합니다. dappy로 벡터 쉴드 장착 매체를 작은 방울 떨어뜨리고 슬라이드 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립의 움직임을 억제하기 위해 매니큐어를 바르십시오.

조직 절편의 이미징은 각 절편 이미지에 대해 63회 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 적절한 레이저가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 수행해야 하며, 총 5미크론의 깊이에 걸쳐 0.33미크론 간격으로 연속 광학 절편을 사용하여 총 15개의 광학 절편을 수행해야 합니다. 각 동물에서 최소 3개의 단면을 이미지화해야 하며 주어진 실험 조건에서 최소 3개의 동물이 포함되어야 합니다. 3개의 연속된 섹션 그룹에서 최대 강도 투영을 생성하여 각각 1미크론의 깊이를 나타내는 5개의 투영을 생성합니다.

이는 성상교세포가 없을 때 형성된 시냅스의 수를 결정하기 위해 수정된 ROI와 함께 RG Cs에 대해 설명된 대로 이미지 J를 사용하여 정량화됩니다. 면역화학은 예상대로 빨간색으로 표시된 바순과 녹색으로 표시된 호머에 대한 항체를 사용하여 기저 성장 배지로 처리된 해리된 rgc에서 수행되었습니다. 성상세포 분비 분자가 형성된 시냅스의 수에 미치는 영향을 결정하기 위해 관찰된 시냅스 공동 국소화 지점은 매우 적으며, 시험관 내에서 해리된 RG C를 염색 후 총 12일 동안 3일마다 마우스 성상세포 조절 배지로 처리했습니다.

이 뉴런에는 수많은 시냅스가 분명했지만 곧 빨간색으로 표시됩니다. Homer는 세포질 Lee 발현 TD 토마토로 형질주입된 녹색 해리 RDCs에서 나타나며, 기초 성장만을 가지고 처리하였다. 중간 시냅스는 보이지 않습니다.

TD 토마토는 파란색으로 표시되고 시냅스 인은 빨간색으로 표시됩니다. 녹색으로 표시된 시냅스 후 마커 호머에 대해 보이는 신호는 거의 없습니다. 동일한 세포를 쥐 성상세포 조건 배지로 만성적으로 치료하면 많은 시냅스가 보입니다.

TD 토마토는 파란색, 시냅신은 빨간색, 호머는 녹색입니다. 정제된 망막 신경절 세포는 성상교세포 조절 배지로 처리되고 시냅스 전 빨간색으로 염색되고 시냅스 후 호머 녹색 마커로 염색된 것으로 표시되며, 천자 분석기를 사용하여 생성된 임계값 마스크는 존재하는 두 채널에 해당합니다. 공동 국소화 지점을 식별하면 Puncta 분석기는 이러한 지점의 그래픽 표현을 출력합니다.

수치 출력은 puncta analyzer에 의해 제공되며, 이는 두 채널 모두에서 식별되고 공동 국소화 지점에 대해 식별된 개별 puncta의 수를 나타냅니다. 이 뉴런의 분석에 의해 생성된 데이터는 중요한 성상세포 분비 시냅스 유전자 분자인 혈전 SPON에 대한 뉴런 수용체의 과발현에 의한 성상세포 유도 시냅스 형성의 강화를 입증하기 위해 시냅스 전후 면역조직화학적 표지의 공동 국소화를 정량화한 시냅스 분석법으로 여기에 표시된 시냅스 형성을 분비하는 성상교세포의 능력을 보여줍니다. 이 그림에서 보이는 것은 기저 성장 매체(basal growth media, gm) 또는 성상세포 조절 배지(astrocyte conditioned media)로 만성적으로 치료된 뉴런당 평균 시냅스 수입니다.

A-C-M-A-C-M은 빈 벡터를 과도하게 발현하는 세포에 비해 혈전 스폰 수용체를 발현하는 세포에 비해 망막 신경절 세포에서 시냅스 형성을 더 강력하게 촉진합니다. 생쥐의 시냅스 밀도를 정량화하기 위해, 상구(superior colliculus)와 시냅스(post-synaptic) 전후 구획을 구획 특이적 면역조직화학 마커(compartment specific immunohistochemical markers)를 사용하여 별도로 라벨링했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 출생 후 7일째부터 P 14일까지 시냅스 수가 증가했다.

이것은 이 발달 시간 창에 걸쳐 superior ulus의 시냅스 수가 증가했음을 보여줍니다. 일단 숙달되면, 이 프로토콜은 해리된 신경 세포 배양의 경우 약 2일 내에 완료할 수 있으며, 이 절차에 따라 동물로부터 채취한 뇌 절편의 경우 약 5일 내에 완료할 수 있습니다. 전기생리학 및 전자 현미경과 같은 다른 방법은 시냅스 수의 변화가 각각 기능적 시냅스와 초구조적으로 정상적인 시냅스의 변화를 반영하는지 확인하는 데 사용됩니다.

이 동영상을 시청한 후에는 시냅스 수를 정량화하기 위해 실험 준비에 면역조직화학을 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜은 격실 특이적 항체를 사용하여 시냅스 전후 격실을 선택적으로 라벨링하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 맥락에서 우리는 시냅스를 이러한 각 마커에서 얻은 신호 사이의 공동 국소화 지점으로 정의합니다.