Name: 모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 Candida albicans 바이오필름 형성 및 항진균제 감수성 테스트 방법을 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여. 이 기술은 대사 활성 측정을 통해 최소 억제 농도를 평가하며 진균 감염 치료 연구에 활용됩니다.

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실험실에서 Biofilm 관련 작업은 부여에 의해 자금 치과 &amp; Craniofacial 연구 및 알레르기 및 전염병 (JLL - R 있습니다.)에 대한 국립 연구소의 국립 연구소에서 R21DE017294 및 R21AI080930 번호가 있습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDCR, NIAID 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. C.의 준비 albicans C. albicans는 위험 그룹 1/BSL1 미생물입니다. 항상이 미생물과 함께 일을 잘 무균 / 살균 기술을 사용하여 생물 학적 물질의 적절한 처리를위한 제도적 절차를 따르도록 기억 해요. <ol><li> C.의 야간 문화를 준비 C.의 단일 식민지 inoculating하여 YPD (효모 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 매체 albicans YPD 25 ML에 albicans. </li><li> 30 ° C 하룻밤에 궤도 쉐이크 (180 RPM)에서 문화를 품다. 대부분의 C. albicans 변종이 조건 하에서 효모 세포로 성장합니다. </li><li> 야간 문화를 (약 3,000 RPM, 5-10분) 원심 분리기, 멸균 PBS로 두 번 세포를 씻어하고, 산도 7.0과 미리 예열을 165 MM morpholinepropanesulfonic의 산성과 버퍼 RPMI 1640 매체의 20-25에 대해 ML의 마지막 펠릿을 resuspend 37 ° C가 (이 매체에 지금부터 간단하게 "RPMI 1640"이라고합니다). </li><li> hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 계산 후, 1.0 X 10 6 세포 / RPMI 1640에 ML의 최종 농도에서 세포 현탁액을 준비합니다. 참고 : 세포가 집계하는 경향을 가지고 있기 때문에,이 세탁 사이 pipetting 전에 적극적으로 와동하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. Biofilm의 형성을위한 96 - 웰 플레이트 Microtiter 설정 <ol><li> 멀티채널 피펫을 사용하면 C. 100 μL를 추가 96 - 웰 플레이트 microtiter (- S)의 선택 우물에 albicans 서스펜션. 이들은 부정적인 조절 역할을하므로, 열 12 우물에 전지를 추가하지 마십시오. </li><li> 원래 뚜껑이있는 전체 microtiter 접시, parafilm와 인감, 37 24 H에 대한 보육 및 품어 안으로 장소 ° C. 표지 부화의 길이는 특정 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 다른 시간 지점 (즉 2, 4, 8, 12, 24 및 48 H)에서 여러 개의 접시를 시딩 각 플레이트를 처리하여 48 시간은 됐어 - 예를 들어, 24의 기간 동안 biofilm 형성의 속도론을 조사 할 수 있습니다 </li><li> biofilm 형성 후, 멀티채널 피펫을 사용하는 것은 신중로 우물 각 형성 biofilms를 만지거나 방해하지 매체를 대기음. </li><li> 멸균 PBS (물론 당 200 μL)에서 멀티채널 피펫 세척 접시 세 번 사용합니다. 또는 자동 microtiter 접시 세척기를 사용합니다. 세척 사이에, 특히 마지막 세척 후, 잔여 PBS를 제거하기 위해 종이 타월과 모래 바닥으로 바뀌 위치에 접시를 물기. 이 시점에서 우물의 바닥에 형성 biofilms도 육안으로 분명히 볼 수 있어야하며 거꾸로 현미경 (그림 1)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. Biofilms 지금 antifungal 자화율 시험 assays을 위해 처리될 준비가 된 것입니다. (실험의 주요 목적은 biofilm 형성의 범위를 평가하는 경우에는 번호판 colorimetric 방법을 사용하여 처리할 준비가 된 것입니다.이 경우, XTT / 메나 디온 시약은 (아래 3 단계 참조) 결과 색상을 추가하고 수 ) microtiter 플레이트 판독기를 사용하여 읽어보십시오. </li></ol> 3. Biofilms의 Antifungal 자화율 테스트 <ol><li> 재고 솔루션 또는 분말에서, 테스트되는 각 antifungal의 RPMI 1640 배지에서 작업 솔루션을 준비합니다. 전형적인 높은 농도는 1,024 fluconazole에 대한 μg / ML, 16 amphotericin B와 caspofungin 모두 μg / ML 있습니다. 다른 농도가 다른 에이전트에 사용할 수 있습니다. </li><li> 멀티채널 피펫을 사용하여 곰팡이 biofilms를 포함하는 각 microtiter 접시 컬럼의 1에 해당 우물에 antifungal의 높은 작업 농도 200 μL를 추가합니다. </li><li> 10 열 2 각 잘하는 RPMI 1640 100 μL를 추가합니다. </li><li> 열 11 우물에 RPMI 1,640 100 μL를 추가합니다. </li><li> 열 1의 우물에서 antifungal 요원 100 μL를 제거 및 열 2의 인접 우물 (이미 매체의 100 μL를 포함)에 추가할 수 있습니다. </li><li> 잘 직렬 두 배로 희석을 수행하고 위아래로 pipetting하여 내용을 혼합하고, 도움말을 제거합니다. </li><li> 오른쪽 혼합 후 열 10 우물에서 최종 100 μL 볼륨이 삭제되는 열의 후 10 우물, 이동 때까지 반복합니다. 이러한 방법으로 관심의 에이전트 (- S)의 dilutions을 배로 일련의이 생성되었습니다; 대부분 열 10 우물에 최소 농축 열 1의 우물에 집중되어에서. 열 11 도전받지 않은 biofilms 긍정적인 컨트롤로 제공되며, 열에 12 빈 우물은 부정적인 제어 역할을합니다. </li><li> 37 그들의 뚜껑, 24 -48 H에 대한 parafilm과 부화로 도장과 번호판을 커버 ° C. </li><li> 잠복기 후 (3 X PBS) 이전 단계 2.4로 접시를 씻으십시오. </li><li> 멀티채널 피펫을 사용하면 배경 X의 측정에 대한 부정적인 제어 우물에 잘 미리 씻어 biofilm을 포함하는 각각의뿐만 아니라 XTT / 메나 디온 솔루션 100 μL를 추가TT - colorimetric 수준. <ol><li> XTT는 0.5 0.22 μm의 - 기공 크기의 필터를 사용하여 필터 소독해야 멸균 링거스 락테이트, PBS 또는 호수에 G / L에서 포화 솔루션으로 준비가되어 있습니다. XTT 솔루션은 민감한 빛 때문에, 그것은 준비 중에 알루미늄 호일으로 덮여 있어야합니다. -70 번에 준비 및 필터 - 소독, 10 ML 작업 볼륨으로 나누어지는하고, 저장 ° C. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다. 사용하기 직전 특정 실험에 필요한 많은 튜브로만 해동. </li><li> 메나 디온은 작은 볼륨 (약 50 μL)로 aliquoted과 -70에 저장된 100 % 아세톤에 10 MM 주식 솔루션 ° C.으로 준비가되어 있습니다 해동 XTT 솔루션 10 ML을 포함하는 튜브에 메나 디온의 주식 솔루션 1 μL를 추가하여, 사용하기 직전 XTT / 메나 디온 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 37 2 H 동안 짙은 어둠 속에서 알루미늄 호일과 부화에 번호판을 커버 ° C. </li><li> 번호판을 발견. 멀티채널 피펫을 사용하면 새로운 microtiter 접시의 해당 우물에 각각 잘하고 전송에서 발생하는 색깔 뜨는의 80 μL를 제거합니다. </li><li> 490 NM에서 microtiter 플레이트 판독기에서 접시를 (- S) 참조하십시오. </li><li> colorimetric 판독의 50 % 80퍼센트 감소가 antifungal 약물의 부재에 형성된 제어 biofilms에 비해 (이 경우 항목에 11 값을 감지되는 antifungal 농도의 고착의 최소 억제 농도 SMIC50과 SMIC80를 계산 ,) 만 XTT를 포함하는 열에 12 우물에서 부정적인 컨트롤에서 값을 빼야하는 것도 기억나요. SMIC 결과는 표 (여러 antifungals에 대해 즉, 여러 개의 격리) 혹은 다른 방법으로, 각 antifungal에 대한 격리 각 곰팡이에 대한 검색 결과가 antifungal 농도 비교 %의 억제를 계획하여 그래프로 제시 수 있듯이 제시하실 수 있습니다. </li></ol> 예 : 대조군의 값을 공제한 후, 열 11 형성된 제어 biofilms의 평균 OD가 1.32입니다. SMIC50이 경우보다 1.32 X 100분의 50가 = 0.66에서 colorimetric 낭독의&gt; 50 % 감소로 이어지는 가장 낮은 농도 antifungal입니다. 마찬가지로, SMIC80이 경우보다 1.32 X 1백분의 20가 = 0.264에서 colorimetric 낭독의&gt; 80 % 감소로 이어지는 가장 낮은 농도 antifungal입니다. 4. 대표 결과 그림 1은 C.의 microphotograph을 보여줍니다 albicans biofilm은 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 96 잘 microtiter 접시에있는 우물의 바닥에 형성. 그림 2는 C. 11 biofilms 각 XTT - colorimetric 신호 (OD 490 값을)를 보여줍니다 albicans 야생 유형 스트레인 같은 96 잘 microtiter 접시의 8 가지 행을 각 형성. 그림 3은 C.에 대해 서로 다른 농도에서 amphotericin B의 활동을 보여줍니다 albicans biofilms; 화살표 SMIC50과 SMIC80 값을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. (A) 패널은 C.의 거꾸로 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 촬영한 microphotograph을 보여줍니다 albicans biofilm은 RPMI 매체와 PBS와 후속 세탁의 열망 후 우물의 바닥에 형성. 전형적인 C의 (B) 현미경 albicans biofilm은 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 시각. 바 패널 각각 A와 B 100 μm의 10 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 여러 동등한 C.의 형성 96 - 웰 microtiter 접시에 albicans biofilms. C. 형성 biofilms의 XTT - 감소 assays에서 Colorimetric 판독 (OD 490 값이) microtiter 접시의 우물에서 albicans 야생 입력합니다. 값은 동일한 96 잘 microtiter 접시 8 다른 행의 각 형성 11 독립 biofilms위한 것입니다. 다른 행에 대한 결과는 편도 분산 분석 및 변동의 균질성 및 Bonferroni의 다중 비교 후 시험에 바틀 테스트를 사용하여 비교했다. (P&gt; 0.05) 서로의 모든 행을 쌍을 비교하면 아무 통계적으로 의미있는 차이는 언급되지 않았다. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. C. 반대 antifungal 자화율 시험의 일반적인 결과 C.의 biofilms에 대한 다른 amphotericin B로 농도의 효능의 전형 결과를 묘사한 albicans biofilms. 그래프 albicans 야생 유형 변형. 값은 우물을 제어에 비해 XTT - 감속 assays 평균 퍼센트 colorimetric 수치로 표현됩니다. SMIC50과 SMIC80 값은 화살표로 표시됩니다.

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</ol>

JLL - R은 antifungal 요원을 개발 MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사에 지분을 소유하고 있습니다. MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사는 이러한 연구에 대한 재정 지원을 제공하지 않습니다.

여기 XTT를 사용하여 biofilm 내에서 세포의 대사 활동을 측정 colorimetric 방법으로 결합 캔디다 biofilms의 형성을위한 단순하고 신속하고 경제적이며 높은 재현성 96 웰 플레이트 microtiter 모델을 설명합니다. biofilm 형성을위한이 96 잘 microtiter 플레이트 모델은 원래 C. 위해 개발되었습니다 albicans하지만 다른 캔디다 종에 사용될 수 있습니다. 쉽게 다른 곰팡이 유기체에 대한 적응. 방법은 여러 매개 변수 및 biofilm 형성에 영향을 미치는 요인을 조사하고 여러 곰팡이 격리 및 / 또는 돌연변이 종자의 biofilm - 형성 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 하지만 아마도 가장 중요한 것은,이 방법은 biofilms 내에서 세포의 antifungal 자화율 테스트 결정에 매우 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>Sabouraud-dextrose agar</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>분리된 진균의 신선한 하위 배양을 위한 플레이트 준비용</td></tr><tr><td>YPD: Yeast peptone dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>하룻밤 동안의 액체 배양 증식용 배지</td></tr><tr><td>L-glutamine이 첨가된 sodium bicarbonate 미함유 RPMI-1640</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>바이오필름 형성을 위한 액체 배지</td></tr><tr><td>Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>RPMI 1640 완충용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>세척용 완충액</td></tr><tr><td>XTT sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>조제 방법은 위 내용을 참조</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s lactate</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>XTT 용액 조제용</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>주의: 피부 접촉, 흡입 또는 섭취 시 위험함</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원추형 원심분리 튜브</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원추형 원심분리 튜브</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96-well 마이크로타이터 플레이트: 폴리스티렌, 평평한 바닥, 조직 배양 처리됨</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 및 팁</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배양기</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로타이터 플레이트 리더</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

모니터링 형성과 antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

캔디다 albicans 지금은 미국 병원에서 세 번째로 가장 일반적인 감염 위험 환자와 칸디다 증의 확대 인구의 곰팡이 감염의 가장 빈번한 원인 남아있다. 칸디다 증의 발현은 다른 호스트 조직 및 / 또는 의료 기기 (즉 카테터)에 두 biofilm 형성과 관련이 있습니다. biofilms 내에서 세포가 면역 반응 호스트로부터 antifungals의 행동으로부터 보호되면서 Biofilm 형성은 부정적인 임상 영향을 수행합니다. 우리는 C. 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한에서 체외 모델을 개발 또한 biofilm antifungal 자화율 시험에 사용할 수있는 96 잘 microtiter - 접시를 사용 albicans의 biofilms. 이 분석의 판독은 metabolically 활성 곰팡이 biofilm 세포에 의해 XTT의 감소 (tetrazolium 소금)을 기반으로, colorimetric입니다. 전형적인 실험은 antifungal 자화율 시험에 대한 추가 24 H와 biofilm 형성에 대한 약 24 H 걸립니다. 때문에 단순하고 일반적으로 사용 가능한 실험실 재료 및 장비의 사용이 기술은 biofilm 조사를 democratizes 및 곰팡이 biofilms의 antifungal 자화율 테스트 표준화 향한 중요한 단계를 나타냅니다.

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을 설명<em&gt; 캔디다 albicans</embiofilms 내에서 세포의 antifungal 자화율 시험에 96 잘 microtiter 접시와 유틸리티를 사용하여&gt; biofilms.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans는 면역 저하 환자 집단이 증가함에 따라 여전히 가장 빈번한 진균 감염의 원인이 되고 있으며, 칸디다증은 현재 세 번째로...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 candida albicans 바이오필름을 형성하고, 항진균제에 대한 이들의 감수성을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 해당 진균 바이오필름을 형성시킨 후, 미리 형성된 바이오필름에 항진균제를 첨가하고 24~48시간 동안 배양함으로써 수행됩니다.바이오필름 내 세포의 대사 활동을 측정하는 비색법을 사용하여, 바이오필름에 대한 항진균제의 최소 억제 농도를 설정하기 위해 이들 항진균제의 활성을 측정합니다. 결과적으로, 비색 판독과 결합된 간단하고 용이한 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 통해 바이오필름 형성 능력과 항진균제 감수성 시험 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 방법이 간단하고 상대적으로 저렴하며, 재현성이 높고, 여러 개의 동일한 바이오필름 형성이 가능하다는 점입니다.또한, 이 방법은 대부분의 연구 및 임상 실험실에서 흔히 사용되는 96-웰 플랫폼 기술과 호환됩니다. 이 기술의 영향은 개과 동물의 치료까지 확장됩니다. 이러한 감염은 바이오필름 형성과 연관된 경우가 매우 많기 때문입니다.적절한 미생물 취급 기술을 사용하여, SAU dextrose copperplate Alan에서 신선하게 계대 배양된 albicans 세포를 루프 가득 채취하여 25 mL의 yeast pepane dextrose broth가 담긴 125 mL 삼각 플라스크에 접종합니다. 배양물을 180 RPM 및 30 °C로 설정된 오비탈 셰이커에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝난 후, 효모 배양액을 50 mL 원추형 튜브에 붓고 3000 RPM에서 5~10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 볼텍싱합니다.세포를 분리하기 위해 펠릿을 강하게 흔들어 줍니다. 그다지 배양액을 다시 원심분리하기 전에 멸균된 PBS를 첨가하여 세척합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복한 후 세포를 다시 부유시킵니다.pH 7.0로 완충된 165 millimolar mops 용액이 포함되어 37 °C로 예열된 RPMI 1640 배지 약 20 milliliters에 현탁합니다. 이 현탁액을 이용하여 표준 혈구계수기(hemocytometer)와 명시야 현미경을 사용해 1:100 희석액을 준비합니다. 세포 수를 측정합니다.그 후, 따뜻한 완충 RPMI 1640 배지를 사용하여 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 최종 세포 현탁액을 준비합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균된 96-웰 평저 마이크로타이터 플레이트의 선택된 웰에 세포 현탁액 100 µL를 분주합니다. 12번 열의 웰들은 음성 대조군으로 사용되므로 비워 둡니다.플레이트를 파라필름으로 덮고 밀봉한 후, 37 °C에서 24시간 동안 배양하여 바이오필름을 형성시킵니다. 배양이 끝나면 각 웰의 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이때 바닥에 형성된 바이오필름이 손상되지 않도록 주의하십시오.각 웰에 200 µL의 PBS를 가해 세척한 다음, 플레이트를 조심스럽게 뒤집어 종이 타월 더미에 눌러 액체를 제거합니다. 이 세척 단계를 3회 반복합니다. 이 시점에서 바이오필름은 육안으로 확인 가능하며, 도립 현미경이나 SEM을 사용하여 시각화할 수 있습니다.바이오필름이 필라멘트와 효모 세포가 서로 얽혀 있는 혼합물로 구성되어 있음을 확인할 수 있습니다. 바이오필름 형성이 확인되면, 완충된 RPMI 1640 배지를 사용하여 항진균제 테스트를 시작할 수 있으며, 테스트할 항진균제의 고농도 작업 용액을 준비합니다. 일반적인 고농도 기준은 fluconazole의 경우 1024 µg/mL, amphotericin B 및 CASPO fungi beri의 경우 16 µg/mL입니다.다음으로, 1열의 웰에는 항진균제 용액 200 µL를, 2열부터 11열까지의 웰에는 완충 RPMI 1640 배지 100 µL를 각각 첨가합니다. 1열 웰의 고농도 항진균제 용액 100 µL를 2열 웰로 옮기는 방식으로 연속 2배 희석을 수행합니다.가볍게 피펫팅하여 혼합한 후, 2열의 웰에서 100 µL를 취해 3열의 웰로 옮기고, 이를 10열까지 반복합니다. 11열은 양성 대조군으로 사용되므로 항진균 용액을 첨가하지 않으며, 10열 웰의 마지막 100 µL는 버립니다. 12열을 제외한 모든 웰에 적용합니다.최종 부피가 100 µL가 되어야 합니다. 플레이트를 덮고 파라필름으로 밀봉한 후, 37 °C에서 24~48시간 동안 배양하여 항진균제가 작용하도록 합니다. 배양 후, 앞서 설명한 대로 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 음성 대조군 웰을 포함한 모든 웰에 100 µL의 XTT 배지 용액을 첨가합니다.12번 열에 처리합니다. 플레이트를 덮고, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 뒤 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 색상이 발색될 수 있도록 플레이트의 호일을 제거합니다.초기에 투명했던 XTT 용액은 대사 활성 세포에 의해 처리된 후 오렌지색으로 변합니다. 색이 변한 상층액 80 µL를 새로운 평바닥 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다. 여기에 표시된 것처럼 490 nm 파장으로 설정된 비색 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 측정합니다. 항진균제가 없는 경우, 비색 측정값은 처리되지 않은 상태였습니다.SEA 도포제의 각 행별 바이오필름은 동일합니다. 먼저 테스트한 항진균 화합물의 효과를 평가하기 위해, 12열의 음성 대조군 웰에서 얻은 평균 배경값을 다른 모든 값에서 뺍니다. 다음으로, 11행의 양성 대조군을 사용하여 저해율(%)을 계산합니다.컬러리메트릭 측정값이 50% 또는 80% 감소하는 지점의 최대 항진균 농도는 Cecil 최소 억제 농도로 알려져 있습니다. 이 값들은 일반적으로 화합물의 효능을 나타내는 기준 척도로 사용됩니다. 이 간단한 고처리량 방법을 이용하면 24시간 이내에 체외에서 진균 바이오필름을 형성할 수 있으며, 초기 개발 이후 선택된 화합물들의 항진균 활성을 스크리닝할 수 있습니다.이 기술은 의학 진균학 분야의 연구자들이 바이오필름 형성을 탐구하고 항진균제의 활성을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. 다시 말해, 바이오필름 내의 세포들은.

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

이 비디오는 국물 미량 희석 분석을 사용하여 항진균 화합물을 스크리닝하는 체외 분석을 보여줍니다. 테스트 화합물은 마이크로타이터 플레이트에서 연속적으로 희석되고 진균 접종물로 배양됩니다. 배양 후, 테스트 화합물의 항진균 가능성과 최소 억제 농도(MIC)를 평가하기 위해 플레이트에 눈에 띄는 곰팡이 성장이 없는 웰이 있는지 검사합니다.

항진균 화합물 스크리닝을 위한 In vitro Broth Microdilution Assay

이 비디오는 곰팡이 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. 병원성 진균 Candida tropicalis는 aspartyl proteinase 2 (Sap2)를 분비하는 독성 인자를 분비하여 생물막 형성을 촉진합니다. 생물막 성숙을 억제하는 Sap2 특이적 항체를 함유한 열 불활성화 혈청을 도입하면 발색 분석을 사용하여 곰팡이 세포의 생존력을 평가합니다.

Candida tropicalis Biofilm에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 체외 분석

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

이 프로토콜은 칸 디다 알비칸스에 대한 펩타이드 및 소분자 항진균제와 같은 기타 화합물의 항진균 활성에 대한 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 성장 억제를 정량화하기 위해 집락 형성 단위를 세는 대신 광학 밀도를 사용하면 시간과 자원을 절약할 수 있습니다.

칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 펩타이드의 항진균 활성 정량화

C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

배우세요 Candida albicans 바이오필름 형성 및 항진균제 감수성 테스트 방법을 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여. 이 기술은 대사 활성 측정을 통해 최소 억제 농도를 평가하며 진균 감염 치료 연구에 활용됩니다.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

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