Name: 웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 Pristionchus pacificus의 배양 및 EMS와 TMP/UV 돌연변이 유발 방법을 통해 유전자 기능을 규명하는 기법을 익히세요. 이 실험은 신경과학 및 발달생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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1 부 : 준비 선충류의 성장 미디어 (NGM) 페트리 접시 이러한 C. 엘레간스 및 P.으로 실험 nematodes pacificus은 일반적으로 선충류 성장 매체 (NGM) 1을 포함 6cm 페트리 접시에 연구실에 양식 있습니다. 웜 20 ° C에 보관하지만, 온도 범위 (° C 넷 사이 - 25 ° C)에서 incubated 수있는 선충류의 종류와 실험 설계에 따라. NGM와 접시를 준비하려면, 표준 살균 기술은 곰팡이와 세균 오염을 방지하는 데 사용해야합니다. 다음은 NGM 번호판을 준비하는 프로토콜입니다 : <ol><li> 15g의 한천, 2.4 g NaCl, 2g Tryptone, 그리고 2.72 g KH 2 PO 4 2 패 원뿔형 플라스크에 물, 압력솥 1 L에 볼륨을 만들어하고 60 물을 욕조에 몸을 ° C를 냉각 허용 무게. </li><li> 0.8 ML 1 M CaCl 2의 각 콜레스테롤 추가 (5 MG / 에탄올에 ML), 1 M MgSO 4. 곰팡이와 박테리아 오염 1 ML의 스트렙토 마이신 (100 MG / ML)과 1ml nystatin (10 MG / ML) 방지하기 위해 매체의 각 리터에 추가할 수 있습니다. </li><li> Unispense 기계를 사용하고 살균 조건을 유지, 원하는 접시에 미디어를 부어. 접시는 차 3분의 2에 대한 전체에 가득해야합니다. 표준 60mm 직경 판은 미디어의 약 10 ML이 필요합니다. 한천이 완전히 gelified 때까지 접시 움직이 지마, 그렇지 않으면 어려운 stereomicroscope에 벌레를 집중할 수 있도록, 한천의 고르지 않은 표면에있을 것입니다. </li><li> 일단 건조, 접시는 4 즉시 씨앗하거나 저장할 수 있습니다 ° C를 박테리아와 시딩까지. </li></ol> 2 부 : OP50 박테리아를 준비하고 시딩 NGM 페트리 접시 P. pacificus은 E.coli OP50 변형에 먹이로 실험실에서 배양해 있습니다. OP50되므로 벌레 1의 시각화를 용이 얇은 잔디를 형성, NGM의 접시에 제한된 성장을하고 있습니다. OP50의 문화를 성장, LB - 국물을 사용합니다 <ol><li> 500 ML 스크류 캡 병으로, 증류수 및 압력솥 500 ML에 볼륨을 만들어 5g bactotryptone, 2.5 g 효모 추출물 및 2.5 g NaCl을 추가합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 문화 판에서 OP50의 단일 식민지로 국물을 예방하고 37 밤새기를 ° C. </li><li> LB - OP50는 사용 준비가되고 불임이 유지하는 경우 4 ° C 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 접시가 씨앗을해야 때마다 작은 살균 비커에 국물의 작은 금액을 부어 이것은 주식 문화의 오염을 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 종자 접시하려면, 60mm 직경 NGM 페트리 접시 그것을 확산하기 위해 소용돌이에 OP50의 100-120 μl를 분배. </li><li> 성장 잔디에 대한 실온에서 하룻밤이 씨앗 번호판을 품어. 이러한 씨앗 플레이트는 이제 최대 3 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 거꾸로 위치에서 그들을 저장하면 빠른 건조를 방지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 3 부 : 선택 만들기 이 섹션에서 우리는 벌레에 대한 선택을하는 방법에 대해 설명합니다. 선택 한 위치에서 다른 위치로 웜을 전송하는 데 사용됩니다. 일부 연구자들은 약간 다른 금속 성분을 선호하는 수도 있지만 선택은 30 게이지 90 % 백금 10 % 이리듐 와이어로 만들어진 것입니다 : <ol><li> 와이어 3~4센티미터에 대한 잘라내기, 장소는 다음 파스퇴르 피펫 (그의 팁 작은 길이로 고장 난 것)의 팁, 그리고 안에 0.5 cm은 알콜 램프를 통해 유리에 그것을 봉인. 유리에서 튀어나온 철사의 길이는 약 3-3.5 cm이지만, 개인의 선호에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 망치 또는 펜치를 사용하여 튀어나와 철사의 끝을 평평하게. 그렇다면 특종을 형성하기 위해 평평 부분 위쪽 구부 러. </li><li> 웜 또는 한천 손상을 방지하기 위해 모래 종이 선택의 날카로운 가장자리를 Smoothen. </li></ol> 부 4 : 피킹 웜 <ol><li> , 웜을 선택 불꽃에 백금 와이어를 소독하고 주사 또는 손상 한천 표면에 치료하지 복용, 코팅 두께 스티커 박테리아와 팁을에 세균성 잔디밭을 따라 선택의 평평 팁을 드래그하십시오. </li><li> stereomicroscope를 사용하여 매우 가볍게 웜이 선택에있는 박테리아에 스틱까지 뽑힐 수있는 웜 / 웜으로부터 쓰는 팁을 브러시. </li><li> 벌레가 선택의 끝에되면, 만지거나 새 접시의 세균성 잔디에 대한 선택의 팁을 슬라이딩하여 새 접시에 즉시 전송하고, 웜은에서 크롤 링해야합니다. 케어는 다른 벌레가 어려운 이들을 검색할 수 있도록 구멍으로 기어 접시에 한천의 표면을 손상하지 않도록해야합니다. 벌레가 너무 오래를위한 선택 좋다면, 그것은 마르다 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : EMS 돌연변이 유발 에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)는 게놈 2에 돌연변이의 광범위한 스펙트럼을 유도. 돌연변이 달걀 부설, 근육의 결함과 같은 결함에 의해 확인할 수 있습니다S, 섹스 결정, dauer 형성, 행동, 및 생식선 형성. EMS 돌연변이 유발에 대한 프로토콜은 C.에 대한 묘사와 비슷합니다 엘레간스 1. <ol><li> 1N NaOH 500 ML (또는 이상) 준비합니다. </li><li> , 웜 가득 6cm 직경 페트리 접시를 4-5을 가지고 세 번째 애벌레 청소년 (J3) 단계에서 몇 백 벌레가 포함된 플레이트마다 멸균 M9로부터 2-3 ML을 사용하여 해제 벌레를 씻으십시오. </li><li> 멸균, 일회용 15 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 벌레를 수집합니다. 벌레가 펠렛을 형성 때까지 5~7분 또는 1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 액체를 대기음 다시 중단 웜을 M9 2 ML을 사용합니다. M9의 2ml를 포함하는 튜브 20 μl EMS를 추가하고 그것을 해산하는 흔들. 그런 다음 부드럽게 웜 서스펜션과 소용돌이의 2ml이 EMS 솔루션을 추가합니다. EMS의 최종 농도 47 MM 것입니다. 주의 : EMS는 아주 강한 mutagen이며 퓸 후드에서 처리되어야합니다. 이 mutagen 접촉 모든 자료 (장갑, pipettes, 도움말) 비활성 EMS에 1N NaOH로 치료해야합니다. 전체 EMS의 돌연변이 유발 절차 중에 이중 장갑을 착용한다. 귀하의 기관의 지침에 따라 유해 폐기물을 배출. </li><li> 원심 분리기 튜브를 삽입하고 parafilm으로 뚜껑을 커버하며 퓸 후드의 수평을 장소 및 3.5 시간 동안 품어 벌레를 보자. 튜브 또한 저속 락커에 둘 수 있습니다. </li><li> 튜브를 켜고 parafilm으로 뚜껑 커버, 벌레 싱크까지 수직 위치 및 부화에서 개최합니다. </li><li> 뜨는을 대기음하고 1N NaOH를 포함하는 비커 / 플라스크에 폐기하십시오. 이것은 EMS를 inactivate 것입니다. </li><li> 웜 5 ML M9를 추가 웜은 펠렛을 형성 때까지 5-7 분 또는 1500 XG에서 웜, 원심을 씻어 관에게 25-30 번 반전. 뜨는을 대기음하고 1N NaOH의 비커에 폐기합니다. </li><li> 세척 단계 적어도 3 회 반복합니다. </li><li> 최종 세척 후, M9의 최소한의 금액 (~ 500 μl)에 벌레 펠렛을 다시 정지 및 OP50 박테리아의 잔디를 포함 NGM 접시에 그들을 피펫. 이 시점에서 당신은 더 이상 화학 후드에서 일할 필요가 없습니다. </li><li> 몇 분 동안 액체가 건조 해하고 선택하고 신선한 씨앗 판으로 건강 찾고 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 폐기물의 지침에 따라 원래의 번호판을 폐기하십시오. </li><li> mutagenized 벌레 자체가 비옥하자. stereomicroscope를 사용하여 관심있는 열성 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면. </li></ol> 6 부 : Psoralen 돌연변이 유발 이 섹션에서 우리는 긴 파장의 자외선 (UV)과 함께 TMP를 사용하여 돌연변이 유발에 대한 절차를 설명합니다. 돌연변이 유발의 TMP / UV 방법은 널리 게놈 세 이내에 삭제 변이를 유도하는 데 사용됩니다. <ol><li> 로 이전 절차에서 설명한 15 ML의 원심 관에 4-5, 6cm 직경 페트리 접시에서 벌레를 수집합니다. </li><li> 5 분 1,500 XG에서 웜 및 원심 분리기를 씻어 20 회 반전, 10 ML M9을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 3 회 총 세탁을 반복합니다. 액체를 기음과 M9 자신의 부피가 30 μg / TMP의 ML을 포함하는 약 10 배에서 벌레를 다시 일시 중지합니다. M9 2 ML로 TMP의 피펫 20 μl (3 MG / ML). EMS와 마찬가지로, TMP는 강력한 발암 물질이고 적절한 안전 대책을 복용 처리되어야합니다. 자외선 적절한 눈 착용의 잠재적인 위험으로부터 방지하기 위해 사용해야합니다. disposables은 적절한 생물 학적 가방에 폐기해야합니다. </li><li> 저속 로커 (40 UPM)에 실온에서 15 분 어둠 속에서 튜브를 품어. 모든 벌레 싱크를 수 있도록 10 분 동안 수직으로 적용 튜브를 설정합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 튜브의 바닥에서 벌레를 제거하고 unseeded NGM 판에 그들을 전송합니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 초과 TMP가 접시에 흡수 될 때까지 어두운 접시 보관하십시오. </li><li> 자외선 강도 측정기를 사용하여 접시에 강도가 500 μW / cm 2 4되는 긴 웨이브 UV 소스와 같은 접시 사이의 거리를 설정합니다. 알루미늄 커버와 덮개를 제거 50 초 동안 긴 웨이브 UV 방사선에 TMP 처리 벌레가 들어있는 접시를 커버하고 노출. </li><li> 커버 및 실온에서 5 시간 동안 어둠 속에서 벌레를 두십시오. </li><li> 선택 신선한 씨앗 접시에 건강 찾는 J4 애벌레를 전송할 수 있습니다. 귀하의 기관의 유해 화학 물질 지침에 따라 원래 번호판을 폐기하십시오. </li><li> stereomicroscope를 사용하여 관심의 돌연변이에 대한 F2 세대 phenotypes를 화면. </li></ol> 7 부 : 대표 결과 P. 일부 돌연변이 유발 (중 EMS 또는 TMP / UV에 의해)으로 인한 pacificus 돌연변이 phenotypes는 그림 1에 표시됩니다. 각 돌연변이가 야생 동물 종류에서 쉽게 구별되는 특성 표현형 있습니다. 벌레에서mutagen, 부모 세대 (P0)에서 30 J3/J4 애벌레 별도의 접시에 배치하고 F1 생성 아르 달걀을 낳기 위해 허용되었다 취급다고. 건강 F1 자손을 보여주 접시에서 1000 F1s의 총 개인 접시에 양도되었고 F2 자손은 phenotypes에 대한 검사를했습니다. 덤피 5,6, Uncoordinated 6 변압기 7 phenotypes과 동물이 발견되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Pristionchus pacificus 야생 유형 및 돌연변이 동물. A. WT 남녀 추니 B. WT 남성 C. dpy 돌연변이 디 UNC 돌연변 E. 트라 돌연변이. 나머지 패널에있는 여러 돌연변이와 비교 야생 유형 남녀 추니 (왼쪽)와 수컷 (오른쪽) 동물을 보여주는 상위 2 패널.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

돌연변이 유발 다양한 실험 모델 생물의 유전자 연구 널리 고용 기법입니다. 돌연변이 유발 실험은 종종 유전자 2의 기능을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 돌연변이 유발 절차 P.을 위해뿐만 아니라 사용할 수 있습니다 pacificus뿐만 아니라, C.위한 엘레간스 및 기타 관련 선충류 종. 여기서 우리는 두 가지 방법, EMS 및 TMP / UV 돌연변이 유발을 설명합니다. EMS는 게놈에 걸쳐 3,8 점 돌연변이 또는 작은 삭제를 유도 화학입니다. Psoralen 돌연변이 유발 (TMP / UV)은 주로 자외선에 의해 유도 가능한 파손에 의한 DNA의 삭제 변이를 유도. 삭제 조각의 길이는 3 0.10-15 kb 범위에서 일반적으로있다. 우리는 찾을 수 일반화되어 phenotypes에 대한 검사. F2 동물 각...

웜 실험실 소개 : culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

자외선 (TMP / UV)와 함께 에틸 메탄 설 폰 산염 (EMS)와 4, 5 &#39;, 8 trimethylpsoralen :이 프로토콜은 실험실과 방법이 다른 방법을 사용하여 mutagenize에 nematodes을 유지하기 위해 절차를 설명합니다. Nematodes 때문에 자기 비옥하게하는 나온것과 동물마다 자손의 수백을 생성할 수 있습니다 남성 구성되어 있습니다들의 간단한 신체 계획 및 짝짓기 시스템의 유전학 연구에 대한 강력한 생물 학적 시스템입니다. Nematodes는 박테리아의 잔디를 포함하는 한천 플레이트에 유지되며 쉽게 한 접시에서 선택을 사용하여 다른 전송할 수 있습니다. TMP / UV 주로 삭제를 유도하면서 EMS는 일반적으로 포인트 돌연변이와 작은 삭제를 유도하는 데 사용 alkylating 요원입니다. 사용중인 선충류의 종류에 따라, EMS 및 TMP의 농도 최적화해야합니다. 선충류 Pristionchus의 pacificus의 열성 변이를 분리하려면 F2 세대의 동물은 시각 phenotypes에 대한 상영되었다. 이러한 방법을 설명하기 위해, 우리는 벌레를 mutagenized 및 Uncoordinated (UNC), 덤피 (Dpy)와 변압기 (트라) 돌연변이에 대한 보았다.

phenotypic 결함과 돌연변이에 대한 심사는 특정 생물 학적 과정에서 기능 유전자를 확인하는 간단한 방법입니다. 이 문서에서 우리는 어떻게 문화 무료 생활 웜 (예에 대한 설명<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) 실험실에서 두 개의 다른 돌연변이 유발 방법, EMS 및 TMP / UV을 보여줍니다.

웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

본 프로토콜은 실험실에서 선충을 유지 관리하는 절차와 두 가지 대안적 방법인 에틸 메탄...을 사용하여 선충을 돌연변이화하는 방법을 설명합니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 *C. elegans*, *C. brisaui*, *P. pacificus*와 같은 선충의 돌연변이체를 생성하기 위해 흔히 사용되는 두 가지 서로 다른 돌연변이 유발 프로토콜을 수행하는 것입니다. 돌연변이 유발은 유전자의 기능을 밝혀내는 강력한 도구입니다. 이는 먼저 성충이 되기 전 마지막 유충 단계의 선충을 대량으로 배양하여 준비함으로써 수행됩니다.다음 단계는 에틸 메탄 설포네이트(ethyl methane sulfonate) 처리 또는 자외선 조사와 병행한 mutagenesis의 두 가지 대체 절차를 사용하여 벌레를 돌연변이시키는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 건강해 보이는 벌레를 먹이원인 박테리아가 새로 도말된 agri plates로 옮기는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 1세대, 2세대 또는 3세대에서 관심 있는 돌연변이 표현형을 스크리닝하는 것입니다.안녕하세요, 텍사스 대학교 알링턴 캠퍼스 생물학과 Andre Perez 및 Silva 박사 연구실의 Jore입니다. T-M-P-U-V 및 EMS 돌연변이 유발 절차는 발달 과정에서 중요한 역할을 하는 생물학적 과정에 어떤 유전자가 관여하는지와 같은 유전학 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 안녕하세요, 제 이름은 Manish Phar입니다. 시연될 돌연변이 유발 방법은 Pristi Onca S Pacificus를 대상으로 하지만, 선충인 sea elegance나 제브라피시와 같은 척추동물 등 다른 실험 모델에도 매우 흔하게 적용될 수 있습니다.그럼 시작해 보겠습니다. 벌레를 한 위치에서 다른 위치로 옮기기 위해 사용하는 픽은 30게이지의 90% 백금 및 10% 이리듐 와이어로 제작되었습니다. 일부 연구자들은 픽을 제작할 때 약간 다른 금속 조성을 선호할 수 있으며, 픽을 고정하기 위해 파스퇴르 피펫도 함께 사용합니다.먼저 파스퇴르 피펫의 연장된 팁을 필요한 길이로 부러뜨려 조절하는 것으로 시작하십시오. 와이어를 약 3~4cm 자른 후 그중 0.5cm를 파스퇴르 피펫 팁 내부에 넣습니다. 분젠 버너를 사용하여 유리 내부에 와이어를 밀봉하십시오.유리 밖으로 돌출된 와이어의 길이는 약 3~3.5cm이며, 개인의 선호도에 따라 조절할 수 있습니다. 펜치를 사용하여 돌출된 와이어의 끝부분을 납작하게 폅니다. 그런 다음 납작해진 부분을 위쪽으로 구부려 스쿱 형태로 만듭니다.마지막으로, 벌레나 한천(agar)이 손상되는 것을 방지하기 위해 사포로 픽(pick)의 날카로운 모서리를 매끄럽게 다듬습니다. 벌레를 픽킹하려면, 화염으로 픽의 와이어를 멸균한 다음, NGMP 트리 플레이트의 박테리아 론(bacterial lawn)을 따라 납작해진 팁을 끌어 팁에 끈적한 박테리아가 두껍게 코팅되도록 합니다. 실체 현미경을 사용하여 agro 표면을 찌르거나 손상시키지 않도록 매우 가볍게 조작하십시오.웜이 픽에 묻어 있는 박테리아에 달라붙을 때까지 끈적한 팁 부분을 웜에 가볍게 문지릅니다. 웜이 픽 끝에 붙으면, 새로운 플레이트의 박테리아 론(lawn)에 팁을 접촉시키거나 미끄러뜨려 즉시 옮깁니다. 이때 웜이 구멍 속으로 들어가 회수가 어려워질 수 있으므로, 플레이트의 agar 표면이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.픽의 끝부분을 세균 층에 대거나 미끄러뜨리면 벌레가 픽에서 기어 나와야 합니다. 벌레가 픽 위에 너무 오래 머무르면 건조해질 수 있으므로 주의하십시오. 3단계 유충(L3) 단계의 *Prisca pacificus* 벌레가 담긴 직경 6cm 페트리 접시 4~5개를 사용하여 EMS 돌연변이 유발 과정을 시연하겠습니다.플레이트당 2~3 mL의 멸균 M9을 사용하여 각 플레이트에서 벌레를 씻어내십시오. 수백 마리의 벌레가 수집되어야 합니다. 수집된 벌레를 멸균 일회용 15 mL 원심분리 튜브에 모으십시오.원충들이 펠릿을 형성할 때까지 또는 5~7분 동안 1500 Gs에서 원심분리합니다. 액체를 흡입하여 제거하고, 이중 장갑을 착용한 상태로 흄 후드 내에서 2 mL의 M9을 사용하여 원충들을 재부유시킵니다. 2 mL의 M9이 담긴 튜브에 20 µL의 EMS를 넣고 흔들어 녹입니다. 그다음 이를 2 mL의 원충 현탁액에 추가하고 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다.EMS의 최종 농도는 47 millimolar가 됩니다. 파라필름으로 밀봉한 원심분리 튜브를 흄 후드 내의 저속 로커에 두고 벌레를 3시간 30분 동안 배양합니다. 3시간 30분의 배양이 끝난 후, 튜브를 수직으로 세워 벌레가 가라앉을 때까지 배양합니다. 그다음, 상층액을 흡입하여 상층액 내의 EMS를 불활성화하기 위해 1N 수산화나트륨이 담긴 비커에 버립니다.흄 후드에서 손을 뺄 때마다 반드시 1N 수산화나트륨으로 손을 헹구십시오. EMS를 불활성화하려면 웜(worms)에 M9 버퍼 5 mL를 추가합니다. 튜브를 25~30회 반전시켜 웜을 세척하고, 1500 Gs에서 5~7분 동안 또는 원심분리 후 웜이 펠렛(pellet)을 형성할 때까지 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 1N 수산화나트륨 비커에 버립니다.M9 완충액을 가하고 원심분리 후 상층액을 제거하는 세척 단계를 최소 3회 반복합니다. 마지막 세척 후, 웜 펠릿을 최소량의 M9 완충액에 다시 현탁하고, 웜 현탁액을 OP50 박테리아가 도말된 NGM 플레이트에 파이펫으로 옮깁니다. 액체가 수 분 동안 마르도록 둔 후, 건강해 보이는 J4 유충을 골라 새로 도말된 플레이트로 옮깁니다.돌연변이 유도체 웜을 약 8~10일 동안 자가 수정시킨 후, 실체 현미경을 사용하여 F2 세대의 표현형에서 관심 있는 과잉 돌연변이체를 스크리닝합니다. 이 돌연변이 유발 절차는 4~5개의 지름 6 cm 페트리 접시에서 수집하여 15 mL 원심분리 튜브에 담은 ppac pacificus 웜을 대상으로 시연될 것입니다. 웜 펠릿에 M9 10 mL를 추가합니다.20회 정도 뒤집어 섞어 벌레를 세척한 후 1500 Gs에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거합니다. M nine을 사용하여 벌레 세척 과정을 총 3회 반복하고, 마지막 세척 후 액체를 흡입하여 제거한 다음 벌레 부피의 약 10배에 해당하는 M nine에 다시 현탁합니다.그 다음, 3 mg/mL 스톡 용액에서 4,5,8-trimethyl SOREIN 또는 TMP를 첨가하여 최종 농도가 30 µg/mL가 되도록 합니다. TMP가 포함된 튜브를 실온의 어두운 곳에서 저속 로커를 이용하여 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 모든 웜이 가라앉을 수 있도록 튜브를 10분 동안 수직으로 세워 둡니다. 본 영상에서는 튜브의 뚜껑이 열린 상태로 보여지지만, 실제 TMP 용액은 빛에 노출되지 않아야 합니다.이 화학 물질은 빛에 민감하므로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 벌레를 제거한 후 파종되지 않은 NGM 플레이트로 옮기십시오. 과잉 TMP가 플레이트에 흡수될 때까지 플레이트를 암소에 보관하십시오. TMP가 플레이트에 흡수되면, 벌레에 자외선을 조사할 수 있습니다.TMP UV 신경발생 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나는 장파 UV 광원과 플레이트 사이의 적절한 거리를 유지하는 것입니다. 따라서 플레이트에 조사되는 UV 광원의 강도를 적절하게 맞추기 위해 거리를 몇 차례 조정해야 합니다. 광강도는 강도 측정기로 기록해야 하며, 500 µW/cm²가 되어야 합니다.UV 광선의 잠재적 위험이 있으므로 이 단계에서는 적절한 보호 안경을 착용해야 합니다. UV 강도계를 사용하여, 강도가 500 µW/cm²가 되는 장파장 UV 광원으로부터의 거리를 결정하십시오.다음으로, 알루미늄 호일과 덮개를 제거하고 TMP 처리된 벌레가 담긴 플레이트를 램프에서 일정 거리만큼 떨어뜨려 플레이트에 도달하는 강도가 500 µW/cm²가 되도록 배치합니다. 플레이트를 장파장 UV 방사선에 50초 동안 노출시킨 후, 덮개를 덮고 실온의 암소에서 5시간 동안 둡니다. 5시간 후, 건강해 보이는 J4 유충을 골라 새로 배지 식립된 플레이트로 옮깁니다.마지막으로, 실체 현미경을 사용하여 F1, F2 또는 F3 세대에서 관심 표현형을 스크리닝합니다. 여기에는 EMS 또는 T-M-P-U-V 돌연변이 유발 후 F2 세대에서 확인된 ppac pacificus 돌연변이 표현형의 일부가 나와 있습니다. 이 이미지들의 상단 두 패널은 야생형 자웅동체와 야생형 수컷의 예시입니다.각 돌연변이는 야생형 동물과 쉽게 구별되는 특징적인 표현형을 가집니다. 패널 C는 dumpy 돌연변이의 예시입니다. 패널 D는 uncoordinated 돌연변이를 보여주며, 패널 E는 transformer 돌연변이의 모습입니다. 숙련된 경우, EMS 돌연변이 유발은 4시간 30분 내에 완료할 수 있으며, TMP uuv 돌연변이 유발은 적절히 수행될 시 5시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.이 시간대에는 배양 시간이 포함되어 있습니다. EMS와 TMP는 매우 위험하므로, 이를 다룰 때는 실험복 착용, 이중 장갑 사용, 흄 후드 및 보안경 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

이 비디오는 PCR 스크리닝을 통해 단일 선충에서 유전자 마커를 빠르게 스크리닝하는 기술을 설명합니다. 예시 프로토콜에서는 CRISPR 기반 게놈 편집을 스크리닝합니다.

Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.

배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

웜 정렬/Worm_CP Caenorhabditis elegans 샘플을 곧게 하고 정렬하고 사전 학습 단계 없이 전체 웜 이미지 기반 assays를 득점하는 데 사용할 수 있는 간단한 FIJI/CellProfiler 워크플로우입니다. 우리는 고정 된 샘플에서 살아있는 동물 이나 지질 물방울에서 열 충격 유도 발현의 정량화에 웜 정렬 /Worm_CP 적용했습니다.

벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

배우세요 Pristionchus pacificus의 배양 및 EMS와 TMP/UV 돌연변이 유발 방법을 통해 유전자 기능을 규명하는 기법을 익히세요. 이 실험은 신경과학 및 발달생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

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