표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

전기생리학은 배양된 인간 배아 신장 세포에서 재조합 전압 게이트 이온 채널의 활성을 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다. 성공적인 기록을 위해서는 세포가 검출을 위해 세포막에서 충분한 수준으로 채널을 발현하고 세포는 개별 세포를 분리할 수 있을 만큼 충분히 낮은 세포 밀도로 도금되어야 합니다. 세포 기록 수행은 이러한 발현에 필요한 섭씨 28도의 긴 배양 기간으로 인해 자주 방해를 받으며, 일반적으로 세포 접착력 및 멤브레인 안정성이 손실됩니다.

여기에서는 이러한 문제를 우회하는 세포 배양 및 transfection에 최적화된 방법을 보여줍니다. 세포는 중간 정도의 cofluency에서 transfection된 다음 적절한 이온 채널 발현이 이루어질 때까지 섭씨 28도에서 배양됩니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 저밀도로 유리 커버 슬립에 도금하고 섭씨 37도에서 몇 시간 동안 배양하여 세포 부착 및 막 안정화를 가능하게 합니다.

적절하게 도금된 세포는 동시 발현 EGFP와 전체 세포 패치 클램프에 의해 식별됩니다. 기록을 수행하거나 세포를 섭씨 28도에서 다시 한 번 배양할 수 있습니다. 채널 표면 발현을 더욱 증가시키기 위해, L CAV 1, L CAV 2 또는 L cav 3과 같은 전위의존성 칼슘 채널로 transfection된 세포에 대한 실험을 기록한 결과는 채널이 세포에 의해 성공적으로 transfection되고 발현되었음을 나타냅니다.

L CAV three에 대한 대표적인 결과만 나와 있지만, 본 연구실에서는 인간 세포주에서 패치 클램프 기록을 위해 발현이 불량한 이온 채널 유전자의 발현을 향상시키는 방법을 개발했습니다. 이제 기존의 접근 방식은 먼저 커버 슬립의 세포를 분할하고 이온 채널 유전자를 포함하는 혈장 CDNA로 transfection한 다음 전기생리학적 기록 전에 고효율 이온 채널 발현을 달성하기 위해 섭씨 28도에서 며칠 동안 배양하는 것입니다. 당사의 새로운 접근 방식은 기록 전에 섭씨 28도에서 필요한 배양 시간을 크게 줄여줍니다.

이제 28도의 배양 시간을 줄임으로써, 세포막이 훨씬 더 안정적이며 형질 주입된 세포가 커버 슬립에 훨씬 더 많이 부착된다는 것을 알게 되었습니다. 이를 통해 기록 가능한 세포의 수가 증가하고 실험의 효율성이 크게 향상됩니다. transfection을 하기 전에 HEK 2 9 3 T 세포의 완전 융합 플라스크를 1-4개의 새로운 25cm 제곱 플라스크로 분할하고 세포를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.

4시간 후 3-4시간 동안 세포가 부착되도록 하고 미분 간섭 대비로 세포를 검사하여 부착을 확인합니다. 세포가 더 이상 둥글게 보이지 않고 평평해지고 있습니다. 확장 또는 pseudopodia가 표시됩니다.

더 적은 합류 셀은 동일하게 보이지만 더 멀리 떨어져 있습니다. 세포가 부착되면 필요한 시약을 결합하여 표준 인산칼슘 형질주입을 수행합니다. 플라스크당 600마이크로리터의 형질주입 용액에 총 12마이크로그램의 DNA를 준비합니다.

여기서 다양한 이온 채널의 CDNA는 이 발현 벡터의 P-I-R-E-S 2개의 EGFP 플라스미드 형질주입으로 클로닝되어 포유류 세포주에 투입됩니다. 그 결과 이온 채널 코팅 시퀀스의 바로 다운스트림 및 EGFP 코팅 시퀀스의 업스트림에 있는 내부 리보솜 진입 부위에서 시작된 번역을 통해 복제된 인서트와 동일한 mRNA에서 향상된 녹색 형광 단백질이 생성됩니다. 이를 통해 EGFP 단백질을 관심 단백질에 직접 융합함으로써 발생할 수 있는 단백질 기능에 대한 간섭 없이 양성 형질 주입된 세포를 식별할 수 있습니다.

transfection 용액을 세포 위에 적포도 적혀 피펫팅한 다음 플라스크를 부드럽게 휘젓고 다음날 밤새 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 transfection 효율을 확인합니다. 양성으로 transfection된 세포는 전체 세포에서 녹색으로 나타나야 합니다.

transfection이 확인되면 4-5ml의 따뜻한 배지를 뒤집힌 플라스크에 조심스럽게 피펫팅합니다. 세포 표면이 아래로 향하도록 플라스크를 천천히 뒤집어 세포를 세척하고 세척 용액이 세포 위로 부드럽게 이동하도록 플라스크를 흔들어 세포를 세척합니다. 매체를 제거하고이 세척을 반복하십시오.

두 번 더 단계를 밟습니다. 그런 다음 플라스크에 6ml의 배지를 넣고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 무척추동물 이온 채널의 발현은 몇 가지 문제를 야기합니다.

첫째, 크기가 큰 경우가 많기 때문에 소포체에서 번역하는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다. 또한, 이들은 포유류 세포주에서 세포막을 효율적으로 표적화하지 못할 수 있습니다. 마지막으로, 서로 다른 종은 서로 다른 코돈 사용 빈도를 나타내기 때문에 이종 CDNA는 이러한 어려움 중 일부를 극복하기 위해 HEK 2 9 3 T와 같은 포유류 세포에서 흔하지 않은 높은 빈도의 코돈을 보유할 수 있습니다.

transfect를 세척한 후 섭씨 37도에서 2시간 배양 후 플라스크를 섭씨 28도의 인큐베이터로 2-6일 동안 옮겨 발현 기간을 연장합니다. 배양 시간은 발현되는 각 유형의 이온 채널에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 섭씨 28도에서 장기간 배양하면 세포가 분리되고 막 안정성이 저하되기 때문입니다.

전기생리학적 연구를 수행하기 전에 추가적인 세포 준비가 필요합니다. 먼저, 섭씨 37도의 트립신 용액 1ml를 거꾸로 된 플라스크에 흡인 피펫으로 형질주입된 세포에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 플라스크를 세포 표면 아래쪽 위치로 부드럽게 되돌려 트립신이 세포 위를 부드럽게 흐르도록 합니다.

플라스크를 다시 뒤집어 트립신을 제거합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 따뜻한 트립신을 세포 바로 위에 추가하고 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 그 동안, 3-8 개의 폴리 L 라이신 코팅 커버 슬립을 60mm 배양 접시에 넣고 5 밀리리터의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다.

세포가 소생술을 분리하면 마이크로 피펫 끝을 사용하여 위아래로 약 6회 피펫팅하여 4ml의 따뜻한 배지에 매달아 덮개 슬립을 아래로 눌러 접시 바닥에 있는지 확인합니다. 그런 다음 250-500 마이크로리터의 재현탁 세포를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하여 커버 슬립에 부착되도록 합니다.

세포를 37도에서 너무 오래 방치하면 형질주입된 플라스미드가 세포 분열과 희석을 초래할 수 있습니다. 형질주입된 세포는 여기에 표시된 것처럼 서로 분리될 수 있도록 충분히 낮은 밀도로 도말해야 합니다. 이것은 전기 생리학적 기록을 용이하게 할 것입니다.

부속 소단위가 필요한 세포의 경우, 세포를 섭씨 28도까지 옮기고 전기생리학적으로 투여하기 전에 추가로 3-4일 동안 배양해야 하는 경우가 많습니다. 액세서리 서브 유닛이 필요하지 않은 셀에 대해 기록이 수행됩니다. 이 배양 직후에 녹음을 수행할 수 있습니다.

여기에 사용된 전기생리학 장비에는 증폭기, 전동식, 이중 피펫 매니퓰레이터, 에피 형광 현미경 및 관류 시스템이 포함됩니다. 장비는 진동 차단 테이블과 표류물에 장착되었습니다. 전기 잡음은 숫자 데이터 1440, P 클램프 10.1 소프트웨어와 함께 아날로그-디지털 변환기 인터페이스가 장착된 PC를 포함한 40인치 높이의 유형 2개 페렛 케이지 전자 제어 시스템에 의해 제한됩니다.

컴퓨터 모니터 증폭기, 전동 매니퓰레이터 및 밸브 링크 풍요 제어 시스템은 모두 패러데이 케이지 외부에 장착됩니다. 독립형 19인치 금속 전기 랙에서 모든 전기 장비는 구리 분배기에 접지되고 라인 절연, 일관된 접지 및 서지 억제를 제공하는 의료 등급 절연 변압기에 연결됩니다. 헤드 스테이지의 마이크로 피펫 홀더에 2-5메가옴의 저항을 가진 방화 연마 마이크로 피펫을 장착하여 실험을 준비합니다.

패치 피펫은 기포를 제거하기 위해 내부 용액 플릭으로 채워지고 최종적으로 헤드 스테이지에 장착됩니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 도금된 셀이 있는 커버 슬립 하나를 실온에서 3밀리리터의 외부 기록 용액이 들어 있는 35mm 플라스틱 페트리 접시로 옮깁니다. 마이크로 피펫으로 알려진 양의 약물을 접시에 추가하는 약물 실험을 수행할 때 기록 용액의 부피를 정확하게 측정해야 합니다.tage

그런 다음 마이크로 전극 홀더 반쪽 셀에 3개의 몰 세슘 염화물을 채웁니다. 그런 다음 기준 전극을 하프 셀에 삽입하고 미크론 매니퓰레이터를 사용하여 접지 전극을 수조에 놓고 패치 피펫을 수조 용액에 내립니다. 형광 모드에서 세포를 시각화하고 고립된 양성 형질 주입된 부착 녹색 세포를 시야 중앙의 중앙에 배치합니다.

목욕 모드에 있는 동안 패치 피펫을 세포에 가까이 가져갑니다. 컴퓨터 화면에서 관찰된 구형파 추적을 0으로 설정합니다. 패치 피펫의 위치를 조정하여 셀에 닿기만 하면 화면의 사각형 전류 트레이스가 변동하기 시작합니다.

기가 옴 씰이 형성될 때까지 부착된 주사기로 부드럽게 흡입합니다. 기가 옴 씰이 달성되면 프로그램을 패치 모드로 전환하십시오. 세포막을 뚫기 위해 주사기로 빠르게 흡입합니다.

그런 다음 셀 모드로 전환하고 전체 셀 매개변수를 사용합니다. 용량성 과도 현상을 보상하려면 세포 내 기록 용액이 패치된 세포로 투석되도록 패치를 평형화해야 합니다. 이 실험을 위해 작성된 전압 클램프 프로토콜을 여기에 입력합니다.

실험자는 세포막을 가로지르는 전압이 변조될 때 발생하는 전압 게이트 이온 채널을 통해 이온 전류를 측정하는 프로토콜을 설계했습니다. 이 경우 소프트웨어가 셀을 마이너스 110밀리볼트로 유지한 다음 SEP를 250밀리초 동안 마이너스 70밀리볼트로 유지하도록 지정하는 IV 프로토콜을 보고 있습니다. 그런 다음 단계가 10 밀리 볼트씩 증가 할 때마다 마이너스 110 밀리 볼트로 다시 내려 마지막 단계가 플러스 20 밀리 볼트가 될 때까지 단계가 마이너스 70 밀리 볼트, 마이너스 60 밀리 볼트 등이됩니다.

증폭기의 저역 통과 베셀 필터를 사용하여 10kHz에서 기록된 전류를 필터링하고 클램프 X 10.1 소프트웨어를 사용하여 2킬로헤르츠의 샘플링 주파수에서 디지털화하고 10% 미만의 최소 누출 기록만 사용합니다.분석을 위해 HEK 2 93 T 세포를 배양하고 L Cav로 형질 주입했습니다. 여기에 표시된 바와 같이 3개의 칼슘 채널. 이종 이온 채널 CDNA의 성공적인 transfection은 P-I-R-E-S 2개의 eeg FP 벡터에서 생성된 형광에 의해 표시되었습니다.

여기서 우리는 무척추 동물 cav 3 전압 칼슘 채널의 성공적인 발현을 보여줍니다. 세포가 transfection되지 않으면 칼슘 전류가 유도되지 않습니다. 반면, 형질 주입된 셀은 전체 셀 전압 클램프 프로토콜이 셀에 적용될 때 큰 전류를 생성합니다.

실험자는 요구 사항에 따라 다양한 전기 생리학적 조건과 데이터 분석 요법을 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험 시기에 대해 자신의 판단을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 서로 다른 채널은 세포막에서 서로 다른 효율로 발현되기 때문에 세포의 생존율을 높이고 관심 있는 채널의 표면 발현을 최대화하는 데 사용할 최적의 전략을 결정하는 것은 사용자의 몫입니다.

이 동영상을 시청한 후 인간 세포주를 배양하고 유지하는 방법과 이종 이온 채널 CDNA 및 서브유닛 CDNA를 이러한 세포에 transfection하는 방법에 대해 잘 이해하셨기를 바랍니다. 전기 생리학적 기록용.