Name: 표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 배우세요 HEK-293T 세포에서 재조합 전압-게이티드 이온 채널의 최적화된 전기생리학적 기록 방법을. 세포 부착력과 막 안정성을 개선하여 신뢰할 수 있는 데이터 획득이 가능합니다.

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이 작품은 자연 과학에서 JDS에 디스커버리 운영 부여에 의해 지원되었다 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC), NSERC 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다의 대학원 장학금 (박사) (A. Senatore)을하고 심장과 뇌졸중 재단, 그랜트 # 6284 NA - 인 - 에이드.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

설명 프로토콜 및 솔루션을 사용하여 전체 셀 전류를 기록할 수있다는 것은 transfection가 성공하고 원하는 전압 - 게이 티드 이온 채널이나 이온 채널 단지는 세포막에서 상당한 수량에 참석하는 것을 나타냅니다. 세포가 적극적으로 transfected (즉, 형광 녹색)하지만 기록 전류, 28에서 추가 시간 ° C가 제대로 포장하고 세포막에 삽입되는 채널 단백질을 허용해야 할 수 있습니다이 없습니다되어야합니다. 28에서 해당 장시간 배양 참고 ° 패치 클램프 녹음 더 도전하고, C는 세포가 coverslips에서 분리로 인해, 그리고 세포막은 죽은 세포의 잔해를 불안정하게하고 축적. 이 프로토콜의 제안 시대의 모든 우리의 특정 채널에 대한 최적화되었습니다. 다른 채널과 subunits가 길거나 짧은 배양 시간을 요구할 수 있으며 필요에 따라 우리의 프로토콜이 추가​​로 조정할 수 있습니다. 특정 채널에 대한 가난한 transfection 효율 (즉, 적은 형광 셀 및 셀 당 낮은 형광 강도) 효율적으로 transfecte...

<table border="1"><tr><td> 자료 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> pIRES2 - EGFP 플라스미드 </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> 서클 유리 coverslips </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 12-545-80 </td><td> 동아리 번호 1-0.13에 0.17mm 두께, 크기 : 12mm </td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Axopatch 200B 또는 Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 시스템 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> 전기 생리학 소프트웨어 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 manipulators </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> MPC - 385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescence 거꾸로 현미경 </td><td> 자이스 혈구 캐나다 </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> CV - 7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage 전극 홀더 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td> 접지 전극에 대한 Microelectrode 홀더 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> 전기 생리학 모세관 튜브 </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> BF - 150 - 86-15 </td><td> 필라멘트, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 길이 15cm로 Borosilicate 유리 </td></tr><tr><td> / 브라운 Micropipette 풀러 플라밍 </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 화재 폴리셔 </td><td> Narishige </td><td> 마이크로 포지 MF - 830 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 약물 재관류 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> 약물 재관류 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> 테프론 밸브와 Valvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

표현과 hek - 293t 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 electrophysiological 녹음에 최적화된 transfection 전략

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

체외의 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 electrophysiological 기록에 (HEK - 293T) 유비 쿼터스 연구 전략이다. 그들은 인접 세포와 접촉으로 인한 혼란함을 주죠 효과없이 electrophysiological 레코딩을위한 수 있도록 서로 접촉되지 않도록 HEK - 293T 세포가 낮은만큼 밀도에 유리 coverslips에 도금해야합니다. Transfected 채널은 또한 소음 수준 이상의 감지 전류를 전체 세포 패치 클램프 레코딩을위한 플라즈마 막 높은 효율로 표현합니다. Heterologous 이온 채널은 종종 ° C transfection 후 적절한 막 표현을 달성하기 위해 28에서 긴 배양 기간을 필요로하지만,이 온도에서 셀 coverslip 부착 및 막 안정성의 손실을가 증가하고 있습니다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 transfect 및 플레이트 HEK - 293T 세포에 최적화된 전략을 개발했습니다. 이 방법은 세포가 28에서 비교적 높은 confluency에서 transfected하고, incubated 있어야 ° 적절한 이온 채널 단백질 표현을 할 수 있도록 배양 기간 후 transfection 변화를위한 C. Transfected 세포는 다음 유리 coverslips에 도금 및 37 ° C coverslips 및 멤브레인 restabilization에 엄격한 세포 부착을 허용 몇 시간에 대한 incubated 수 있습니다. 전지는 곧 도금 후 녹음하거나 ° C 더 배양을 위해 28 전송할 수 있습니다. 우리는 28의 초기 부화 ° C, transfection 후 있지만 도금하기 전에는 일반적으로 플라즈마 막에서 잘 표현하지 heterologous 이온 채널의 효율적인 표현을위한 열쇠입니다 것을 발견했습니다. 긍정적으로 transfected, 교양 세포는 단지 상류 내부 ribosome 항목 사이트 및 eGFP 코딩 시퀀스의 cDNA 재조합 이온 채널을 포함하는 bicistronic 벡터 (예 : pIRES2 - EGFP)에서 표현 공동 표현 eGFP 또는 eGFP에 의해 식별됩니다. 전체 세포 패치 클램프 녹음 전문 장비를 필요 플러스 borosilicate 유리 광택 기록 전극과 L 자형 접지 전극의 crafting. 이온 채널의 약리학 연구를 마약 배달 직접 녹음 요리로 마약을 micropipetting에 의해, 또는 microperfusion 또는 기록된 세포 이상 약물 솔루션의 중단 흐름을 생산 비중 흐름 시스템을 사용하여 얻을 수 있습니다.

고효율을위한 신뢰할 수있는 방법<em&gt; 체외에서</em&gt; 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 (HEK - 293T)의 후속 electrophysiological 기록.

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

배양된 인간 배아 신장 세포(HEK-293T) 내 재조합 전압 개폐 이온 채널의 인비트로(in vitro) 발현 및 전기생리학적 기록...

전기생리학은 배양된 인간 배아 신장 세포에서 재조합 전압 개폐 이온 통로의 활성을 연구하는 데 흔히 사용됩니다. 성공적인 기록을 위해서는 세포가 검출 가능한 충분한 수준으로 세포막에 통로를 발현해야 하며, 개별 세포를 분리할 수 있도록 세포 밀도를 충분히 낮게 도말해야 합니다. 세포 기록을 수행할 때, 이러한 발현에 필요한 28 °C에서의 장시간 배양 기간으로 인해 세포 부착력과 막 안정성이 일반적으로 저하되어 작업에 어려움을 겪는 경우가 많습니다.본 과정에서는 이러한 문제들을 해결하기 위해 최적화된 세포 배양 및 형질전환 방법을 시연합니다. 세포를 적절한 효율로 형질전환한 후, 이온 채널이 충분히 발현될 때까지 28 °C에서 배양합니다. 그 후 형질전환된 세포를 유리 커버스립 위에 낮은 밀도로 분주하고 37 °C에서 수 시간 동안 배양하여 세포 부착과 막 안정화를 유도합니다.적절하게 플레이팅된 세포를 EGFP 공발현과 전세포 패치 클램프(whole cell patch clamp)를 통해 확인합니다. 기록을 수행하거나 세포를 다시 28 °C에서 배양할 수 있습니다. 채널의 표면 발현을 더욱 증가시키기 위해 L CAV 1, L CAV 2 또는 L cav 3와 같은 전압 의존성 칼슘 채널을 형질전환시킨 세포에서 기록 실험을 수행한 결과, 채널이 세포에 성공적으로 형질전환 및 발현되었음을 나타냅니다.본 실험실에서는 L CAV 3에 대한 대표적인 결과만을 제시하였으나, 인간 세포주에서의 패치 클램프 기록을 위해 발현 효율이 낮은 이온 채널 유전자의 발현을 강화하는 방법을 개발하였습니다. 기존의 방식은 먼저 커버슬립에 세포를 분할 배양하고 이온 채널 유전자를 포함하는 플라스미드 cDNA를 형질전환한 후, 전기생리학적 기록 전에 높은 효율의 이온 채널 발현을 달성하기 위해 28 °C에서 며칠 동안 배양하는 것이었습니다. 우리의 새로운 접근 방식은 기록 전 28 °C에서 필요한 배양 시간을 크게 단축시킵니다.이제 28°C 배양 시간을 단축함으로써 세포막이 훨씬 더 안정해지고 형질전환된 세포가 커버슬립에 훨씬 더 잘 부착된다는 것을 알 수 있습니다. 이는 기록 가능한 세포 수를 증가시켜 실험 효율성을 상당히 높여줍니다. 형질전환 전, 완전히 합류(confluent)된 HEK 2 9 3 T 세포 플라스크를 1:4 비율로 새로운 25 cm² 플라스크에 분할하여 접종하고, 세포를 37°C 5% CO2 배양기에 넣습니다.세포를 3~

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Biology

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우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

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소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

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유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

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표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

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