Leukotriene B의 실시간 영상 ₄ 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

Leukotriene B4는 다양한 염증 세포에 존재하는 G 단백질 결합 수용체인 BLT1 및 BLT2를 통해 작용을 매개하는 염증 유발 분자입니다. LTB4-BLT1 경로는 천식, 관절염 및 동맥경화증을 포함한 여러 염증성 질환에서 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 화학성, 세포 내 칼슘 방출 및 유전자 조절과 같은 세포 내 반응을 일으키는 세포 외 신호의 전달을 매개합니다.

세포 외 리간드 결합은 이질삼량체 G 단백질의 활성화를 유도하는 일련의 구조적 변화를 일으킵니다. 그 후 G 단백질은 cyclic adenosine monophosphate, acetol tri phosphate 및 DYL glycerol과 같은 이차 전령의 수치를 조절합니다. 골수 유래 수지상 세포(B MDCs)에서 leukotriene B4 매개 세포 이동을 실시간으로 관찰하기 위해, 마이크로 피펫을 통해 리간드를 제어된 흐름으로 전달하며 이미징을 수행합니다. 이동성을 평가하기 위해 타임랩스 이미징을 실시합니다.

이러한 살아있는 세포 실시간 이미징 기술을 사용하여, 본 연구실은 leukotriene B4 수용체 BT1이 수지상 세포에서 기능적으로 발현된다는 것을 발견했습니다. 또한 BT1의 내재화 과정에서 인산화 및 beta-arrestin 의존적 기전이 관여함을 확인했습니다. 본 연구실에서 이러한 기술들 중 상당수를 개발한 Jla 조교수가 세포 이동과 수용체 내재화를 모두 시연할 예정입니다. 세포 이동 분석을 위해 골수 유래 수지상 세포(BMDCs)를 준비하려면, FBS, 재조합 GM-CSF 및 재조합 FLT3가 포함된 RPMI 1640 배양액에 0.5 million 개의 세포를 35 millimeter 유리 바닥 디시에 분주하십시오.

플레이팅 후, 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 16시간 동안 배양합니다. 16시간 후, 3 mL의 PBS를 첨가한 다음 흡입하여 제거합니다. 마지막 흡입 후 이 세척 과정을 최소 2회 더 반복하고, 플레이트에 2 mL의 PBS를 첨가합니다.

이제 세포들이 실험 준비가 되었으며, 37 °C로 유지해야 합니다. 한편, 이 비디오의 실험에 사용된 이미징 시스템은 가열 스테이지와 cool SNAP hq 디지털 흑백 CCD 카메라가 장착된 Nikon eclipse TE 300 도립 현미경에 A-T-E-F-M 에피 형광 시스템이 부착된 형태입니다.

들뜸 및 방출 파장은 필터 휠과 Lambda 10-2 필터 휠 컨트롤러를 통해 제어합니다. 하드웨어 제어 및 이미지 획득은 metamorph 소프트웨어로 제어합니다. 피펫을 고정하기 위해 두 개의 마이크로 매니퓰레이터가 현미경 스테이지에 부착되어 있으며, 피펫은 동봉된 텍스트의 지침에 따라 제작하거나 구매할 수 있습니다.

100 nM 농도의 염증 유발 리간드 leukotriene B₄(LTB₄) 스톡 용액 1.5 mL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다. 마이크로피펫 팁을 용액에 넣고 용액이 자연스럽게 들어가게 하여 마이크로피펫을 다시 채웁니다. 이러한 로딩 방식은 마이크로피펫 끝에 공기 방울이 생기는 것을 방지합니다. 다음으로, 마이크로필 바늘이 장착된 1 cm³ 투베르쿨린 주사기에 LTB₄ 1 mL를 채웁니다.

그런 다음 이를 사용하여 위쪽에 연결된 튜브를 통해 LTB 4로 채워진 마이크로 피펫을 천천히 채웁니다. 그 후, 리간드로 채워진 1mL 시린지에 연결된 21게이지 1.5인치 바늘에 마이크로 피펫과 튜브를 연결합니다. 이제 골수 유래 수지상 세포의 살아있는 세포 이미징을 수행하기 위해, 리간드가 채워진 마이크로 피펫을 현미경 스테이지 위의 마이크로 매니퓰레이터 중 하나에 조심스럽게 고정합니다.

LTB4 리간드를 처리한 후, 플레이트에 배양된 미성숙 b MDC를 인큐베이터에서 꺼내 현미경의 가열 스테이지 위에 놓습니다. 60 x 오일 침수 렌즈를 사용하여 세포를 관찰 범위에 둡니다. 세포의 이동을 적절히 모니터링할 수 있도록 세포가 너무 밀집되지 않은 영역을 찾습니다.

플루오로 디쉬(fluoro dish)의 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 조동 매뉴얼 조작기를 사용하여 리간드가 충전된 피펫을 조심스럽게 내린 후 안으로 이동시킵니다. 유압 정밀 마이크로 조작기를 사용하여 세포에 최대한 가깝게 접근시킵니다.

피펫의 초점을 맞춥니다. 시린지에 약간의 압력을 가하여 팁에서 LTB four ligand가 천천히 방출되도록 합니다. ligand는 확산에 의해 배지로 천천히 퍼져 나가야 합니다. 다음으로, metamorph 소프트웨어를 사용하여 2시간 동안 15초마다 명시야 영상을 획득하도록 영상 획득 파라미터를 설정합니다.

리간드를 향한 이동의 진행 상황을 5분마다 계속 모니터링하십시오. 본 프로토콜에 설명된 방법은 류코트리엔 B4를 향한 수지상 세포의 이동을 결정하는 데 사용되었습니다. 여기서는 100을 향한 마우스 골수 유래 수지상 세포의 이동을 다룹니다.

타임랩스 이미징 영상에서 LTB4를 향해 이동하는 살아있는 B MDCs의 세포 이동을 관찰할 수 있습니다. 이와 유사한 방법을 적용하여 다양한 화학 유인 물질에 대한 여러 세포 유형의 화학주성 반응을 결정할 수 있습니다. 이러한 이미징 기술을 형광 단백질 태그 분자와 결합하여 사용하면 살아있는 세포 내 분자들의 움직임과 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있습니다.

본 영상에서는 형광 표지된 leukotriene B4 수용체 1과 beta arrestin의 상호작용을 실시간으로 보여드립니다. RBL 2H3은 ATCC에서 구할 수 있는 Wistar 쥐에서 유래한 쥐 호염기성 백혈병 세포주입니다. 이 세포들은 많은 케모카인 수용체를 발현하지는 않지만, 케모카인 의존적 신호 전달 경로를 매개할 수 있는 세포 구성 성분을 갖추고 있습니다.

리간드에 의해 유도되는 BT1의 내면화를 실시간으로 평가하기 위해, RBL 2H3 세포에 BT1 RFP와 beta-arrestin GFP를 형질전환합니다. 타임랩스 이미징 중에 플레이트에 리간드를 첨가합니다. 이러한 단백질들의 위치 변화는 이미지 분석을 통해 평가할 수 있습니다.

G PCR R 내부화를 실시간으로 연구하기 위해, 동봉된 텍스트의 지침에 따라 B LT one RFP 및 beta arrest와 GFP를 RBL two H three 세포에 트랜스펙션합니다. 그 다음, 전기천공된 세포와 일반 성장 배지 혼합물 300 µL를 일반 성장 배지 2 mL가 포함된 35 mm 형광 디쉬로 옮깁니다. 세포를 37 °C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소의 가습 환경에 두어 디쉬 바닥에 부착되도록 합니다.

1시간 후, transfection 배지를 일반 성장 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 18~24시간 동안 추가로 배양합니다. 배양 후, 10 mM HEPES가 포함된 따뜻한 phenyl red free RPMI 2 mL를 플레이트에 직접 가하고 배지를 흡입하여 제거하는 방식으로 세포를 2~3회 세척합니다. 그런 다음 1.8 mL를 추가로 가합니다.

다음으로, 배양 접시를 가열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 60 x 오일 침강 렌즈를 사용하여 600 x 배율로 이미지를 수집합니다. 그 후 적절한 형광 필터로 전환합니다.

세포 표면에 HBL BT one RFP를 발현하는 건강한 세포를 선택하고 이미지를 캡처합니다. RFP 필터를 사용하여 GFP 필터로 전환한 다음, 세포질에 beta arrest 및 GFP가 발현되었는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그 후, 병합된 가색(pseudo colored) 이미지를 검토하여 오정렬의 결과로 발생할 수 있는 형광 번짐(bleed through) 현상이 있는지 확인합니다.

RFP와 GFP 사이에서는 수용체의 타겟팅이 일어나지 않습니다. 다음으로, 타임랩스 이미징을 위한 파라미터를 여기에 입력하십시오. 16비트 이미지는 카메라 빈딩을 하나씩(one by one)으로 설정하여 획득합니다.

RFP 및 GFP 형광 필터와 R-F-P-G-F-P 빔 스플리터를 사용하여 적색 및 녹색 형광 이미지를 순차적으로 캡처합니다. 소프트웨어를 설정하여 1시간 동안 32초 간격으로 이미지를 캡처하십시오. 유사한 다이내믹 레인지가 얻어지도록 카메라 노출 시간을 설정합니다.

RFP 및 GFP의 형광 강도를 측정합니다. 1분 동안 이미지를 수집한 후, t=0 시점에 200 µL의 리간드를 플레이트를 흔들지 않고 직접 첨가합니다.

60분 동안 형광 이미지 수집을 계속합니다. 리간드를 첨가한 후 이미지가 획득되면, 순차적인 파일 이름의 TIFF 이미지로 자동 저장됩니다. 이후 소프트웨어를 사용하여 해당 파일들을 개별 이미지 또는 통합 이미지로 확인할 수 있습니다.

마지막으로, 모든 세포 이미지 획득이 완료되면 동일한 설정으로 세포가 없는 일반 배지만을 사용하여 이미지를 획득합니다. 분석 시 배경 이미지로 사용하기 위해 이 파일들을 저장하십시오. Metamorph의 이미지 감산(image subtract) 기능을 사용하여 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 배경을 제거하십시오.

이를 통해 배지에서 발생하는 배경 신호나 자가형광을 보정할 수 있습니다. 다음으로, 파일 메뉴에서 생성된 최종 스택 파일 옵션을 열어 개별 이미지 스택들을 엽니다. 이어서, 영역 측정(region measurements)에서 타원형 영역 추적(ellipse region trace region)을 선택하고 관심 영역을 지정합니다. BLT1 및 beta arrestin 전위(translocation)에 해당하는 RFP와 GFP의 형광 강도를 측정하기 위해 표면 및 세포질 영역을 선택합니다.

Excel과 자동으로 연동되는 로그 데이터 옵션을 사용하여 시간 함수에 따른 형광 강도 값을 기입하십시오. 이 그래프를 통해 특정 분자의 전위(translocation) 역학에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 이미지 분석을 통해 GPCR, 세포질 단백질 및 핵의 국소화를 확인할 수 있습니다.

여기 RBL 2 H 3 세포 표면에서 BT1 RFP의 발현이 관찰됩니다. 이 이미지는 동일한 세포의 세포질 내 beta rest와 GFP의 국소화를 보여주며, 핵 내에서는 pNuke CFP가 관찰됩니다. 여기에 표시된 합성 색상 이미지는 각 형광 크롬의 뚜렷한 세포 내 국소화를 나타냅니다. 또한, 리간드로 유도된 표면 GPCR와 세포질 단백질 간의 상호작용 역시 여기서 평가할 수 있습니다.

리간드 유도 BLT1 수용체 및 베타-어레스틴의 전위. 이 비디오는 BLT1 RFP와 베타-어레스틴 GFP를 발현하는 세포의 실시간 이미징을 보여줍니다. 1 µM LTB4를 첨가하면, Metamorph 소프트웨어를 사용하여 전위 패턴의 정량화를 모니터링할 수 있습니다.

대표 세포에서 T=0일 때의 형광 강도 라인 스캔 결과가 나타나 있습니다. BT1 RFP는 세포막에서 관찰되며, beta arrestin GFP는 세포질에서 관찰됩니다. 리간드를 첨가하자 RFP와 GFP 라인이 겹치는 것이 관찰되며, 이는 수용체와 beta arrestin의 공동 국소화를 시사합니다.

또한, 여기에서 단백질 이동의 역학을 결정할 수 있습니다. 1 µM LTB4를 첨가한 후 수용체 내입 및 beta arrestin 전위의 역학을 조사하였습니다.

세포의 막과 세포질 위치에서 시간에 따른 형광 강도를 측정하였습니다. LTB4 리간드를 $\text{B}\text{L}\text{T}1\text{-RFP}$와 $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$가 형질전환된 RRB2 H3 세포에 첨가하면, $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$가 세포질에서 막으로 이동하며, 이는 1분 이내에 노란색 링이 형성되는 것으로 관찰됩니다. $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$와 상호작용함에 따라, $\text{B}\text{L}\text{T}1\text{-RFP}$는 수용체 $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$ 복합체를 형성하고, 5분 이내에 노란색 점(puncta)이 나타나는 것에서 알 수 있듯이 엔도솜 형태로 세포질을 통해 이동합니다. 이러한 방법을 통해 리간드 의존적 수용체 활성 상태와 수용체 활성화에 관여하는 핵심 모티프 또는 과정을 결정할 수 있습니다.

실험에서 가장 중요한 점은 플레이트가 작동하는 동안 버퍼의 상태를 세심히 관찰하는 것입니다. 실험은 전개 후 1시간 이상 진행됩니다. 이 기술은 케모카인 및 수용체 분야의 연구자들이 다양한 포유류 세포 유형에서 세포 이동과 수용체-리간드 상호작용을 탐구하기 위해 고안하였습니다.

이 영상을 시청한 후, 케모카인과 그 수용체, 그리고 beta-arrestin과 같은 세포질 단백질 간의 상호작용을 포함하는 실시간 이미징 실험을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.