Name: Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 배우세요 백혈구의 화학주성 반응과 G-단백질 연결 수용체 상호작용을 실시간 세포 영상으로 관찰하는 방법을. 뼈수지 유래 수지상 세포 이동과 수용체 내재화 메커니즘을 분석하여 염증 질환 치료 전략 개발에 기여합니다.

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연구는 보건 보조금 국립 연구소 AI - 52381, CA138623 및 켄터키 폐암 연구위원회와 제임스 그레이엄 브라운 암 센터에서 제도적 지원에 의해 지원됩니다.

방법론 현미경에 대한 설명 라이브 셀 이미징 실험 이클립스 TE300 니콘 인버티드 현미경에 부착된 TE - FM 에피 형광 시스템을 사용하여 수행된. 현미경 난방 무대를 갖춘. 멋진 스냅 HQ 디지털 B / W CCD (로퍼 과학) 카메라와 LAMDA 10-2 광학 필터 체인저 (서터 악기 회사) 현미경에 첨부되어 있습니다. 여기 및 발광 파장은 필터 바퀴 제어 및 Lamba 10-2 필터 휠 컨트롤러에 의해 제어되며, 셔터 인 스트 루먼트 (주) 노출 시간이 500 MS 충분히 살 세포에 RFP 또는 GFP를 볼 수 있어야합니다. 하드웨어 제어와 이미지의 취득 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어됩니다. EGFP / DsRed 듀얼 이색성, 채도 기술, 현재 연구에 대한 필터의 선택은, 필터 S480/20x, S525/40m 및 S565/25x, GFP 및 RFP에 대한 S620/60m, 각각을 설정하고 있습니다. 이 필터 휠은 여섯 필터 세트 수용할 수 있습니다. 현미경는 조이 스틱과 함께 이전 Proscan 무대 컨트롤러와 연결되어 있습니다. 이러한 모든 하드웨어 첨부 파일 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어하실 수 있습니다. 현미경도 micropipettes를 잡아 Micromanipulators와 함께 첨부되어 있습니다. A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션 위에서 설명한 현미경 설정을 사용하여, 우리는 실시간으로 리간드 감독 돌기 세포 이주를 다음의 방법을 개발했습니다. 두 micromanipulators (Narishige)은 현미경에 연결된 있습니다. LTB 4 기울기 방향으로 돌기 세포 (BMDCs) 파생 마우스 골수의 chemotaxis이 기록되었다. 여기서 우리는 마이크로 피펫에 리간드를로드하고 세포의 방향성 마이 그 레이션을 모니터링하기 위해 현미경의 온수 무대에 chemotaxis 실험을 설정, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 pipettes를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 마이 그 레이션뿐만 아니라 라이브 세포의 chemotaxis의 억제제의 효과를 유도에서 독특한 chemoattractants의 효능을 테스트하기 위해 적용할 수 있습니다. 마우스 BMDCs 21 고립은 조브 22 등 여러 출판물에 설명되어 있습니다. 1. BMDCs의 준비 <ol><li> 커버 슬립 아래 플루오로 요리하고, 그들이 앞서 실험의 16 시간을위한 성장 수에있는 플레이트는 BMDCs (10 일간 culturing 후). </li><li> 1X PBS 3 ML 적어도 2 회 (접시에 1X PBS 3 ML를 추가하고 버퍼 출력을 aspirating하여)와 세포를 씻으십시오. </li><li> 접시에 1XPBS 2 ML을 추가합니다. 세포는 이제 실험을 위해 준비가되어 있습니다. ° C 인큐베이터 사전 실험 37 세포 보관하십시오. </li></ol> 리간드 로드된 마이크로 피펫의 준비 : <ol start="4"><li> 수직 micropipette 풀러 (Narishige 국제 미국, 부동산)에, 유리 모세관 튜브 (6 "고양이 # 625500, AM 시스템, INC 유리 표준, 0.75 mm X 0.4 mm) 이후의 수정 프로그램입니다. </li><li> 52 살에 온도를 유지 ° C와 유리가 날카로운 모서리 도움말을 형성 녹으 분열 시키려고 수 있습니다. </li><li> 마이크로 피펫 홀더에 피펫을 수정. </li><li> M - 900 (Narishige 국제 미국, Inc의) 현미경으로 관찰하여 마이크로 포지를 사용하여 마이크로 피펫의 거친 가장자리를 부드럽게. </li><li> 각 실험에 대한 최소한 10-20 pipettes 준비. 참고 : micropipettes도 세계 정밀 계측기 (μ 팁, T1801TW1F)에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 1 ML effendorf 튜브에 리간드의 원하는 농도 (현재 실험에서 100 nm의 LTB 4 500 μL)을 가지고 솔루션에 마이크로 피펫 팁을 유지하고 솔루션은 마이크로 피펫 (다시 작성)로 입력할 수 있습니다. </li><li> 리간드와 주사기 (1 CC 투베르쿨린 주사기)에 1 ML을 가지고 천천히 처음부터 마이크로 피펫으로 마이크로 작성 바늘 (28G MF - 5, 세계 정밀 계측기)를 사용하여 리간드를 입력합니다. </li><li> 리간드으로 가득 한 ML의 주사기에 연결된 (21 G 2분의 11) 바늘로 피펫 및 튜브에 피펫으로 단단히 맞는 튜브를 연결합니다. </li><li> 이제 조심스럽게 마이크로 manipulators에 현미경 스테이지 및 수정하는 마이크로 피펫을 가득 리간드를 이동합니다. </li><li> 확인 리간드 천천히 끝에서 공개하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 현미경을 도금 미숙 BMDCs을 지참하고 온수 플레이트 (37 ° C) 무대에서 그들을 유지. </li><li> 플루오로 요리의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 기름 침지 60X 목적 렌즈를 사용하여 세포를 집중. </li><li> 신중하게, 세포의 근접에 '거친 수동 조작하는 사람 MN - 188NE'를 사용하여 피펫을로드 리간드를 가지고. </li><li> '유압 파인 Micromanipulator MN - 188 NE'를 사용하여 피펫을 집중. </li><li> 리간드가 그릇에 공개되어 있는지 확인하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 의 취득 이미지 수집 매개 변수를 설정 밝고 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 2 시간을 위해 매 15 초에 (1​​0 MS 노출) 제기했다. </li><li> PR에 대한 매 30 분 모니터링 유지리간드 대한 마이 그 레이션 ogression. </li><li> 세포 피펫 끝에 혼잡한 경우, 실험의 마이 그 레이션을 계속 접시에 끝의 위치를​​ 변경합니다. </li></ol> B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation 1. 플라스미드 DNA 구조의 준비 DNA 플라스미드 구조의 세부 사항은 Jala 외. (2005) 18에 설명되어 있었다. 2. RBL - 2H3 세포로 인간 BLT1 - RFP 및 β - Arrestin - GFP의 Transfection <ol><li> 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 37 셀 (60-70% 합류) · 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2를 유지 성장 미디어 monolayer 문화 (DMEM가 15% FBS, 2 보충으로 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린과 T75 flasks 100 μg / ML의 스트렙토 마이신). </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML (0.05 %의 트립신, 0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 사용하여 37에서 5 분 잠복기에 의해 접시 / flasks에서 세포를 분리 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2. 부드럽게 세포의 분리의 정도를 모니터링하는 flasks를 흔들. </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML을 포함하는 플라스크로 성장 미디어 6 ML을 추가하고 여러 번 아래 pipetting과로 그들을 혼합하여 세포를 수집합니다. 15 ML 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 세포를 카운트하고 transfection 미디어 200 μL 3 분 및 resuspend에 대한 480g RPM (DMEM, 20 % FBS, 50 MM HEPES) 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 X 10 6 세포를 가져가라. 당신이 3 transfections을 수행하려는 경우, 증가하는 휴대폰 번호와 transfection 매체의 볼륨에 의해 따라 셀 및 tranfection 미디어를 준비합니다. </li><li> 최소 1.5 μg / μL의 농도에 transfected 수 plasmids를 준비합니다. 우리는 QIAGEN의 맥시 DNA 플라스미드 키트에게 사용하여 플라스미드 DNA를 준비합니다. 0.4 cm 전극 간격을 살균 전기의 cuvettes (바이오 - 래드 # 16552088)에 대한 개인이나 인간 BLT1 - RFP (25 μg)과 β - arrestin1 - GFP (15 μg)을 모두 플라스미드 DNAs 인코딩을 추가합니다. </li><li> 위의 resuspended 세포 200 μL를 가지고 hBLT1 - RFP 또는 β - arrestin1 - GFP 또는 둘 모두가 함께 중 하나를 포함 cuvettes에 배치하고 1 ML 멸균 피펫 조심스럽게 그들을 섞는다. </li><li> 10 분 상온에서 위의 cuvettes를 남겨주세요. </li><li> 전압 250 V 및 용량 500 μF와 진 Pulser II의 세포를 Electroporate. </li><li> electroporation 후 세포를 10 분 실온에서 머물게. </li><li> 정기적인 성장 매체 1 ML를 타고 cuvettes에 electroporated 세포와 함께 섞는다. </li><li> , 5 % CO를 정기적으로 성장 미디어 2 ML을 포함 35mm 조직 유리 바닥 문화 요리 (플루오 요리, 세계 정밀 계측기)에이 혼합 300 μL를 배포하고 37 1 시간에 대한 품어 ° C를 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 2. 세포는 접시의 바닥을 준수하도록 허용합니다. </li><li> 정기적인 성장 매체와 부화 1 H 후에 미디어를 교체하고, 37에서 성장 허용 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 18-24 시간 5 % CO 2 배양기를. </li></ol> 3. 라이브 셀 이미징 이미지의 취득 <ol><li> 18-24시 이후, 10 MM의 HEPES, 산도 7.55을 (플레이트 및 대기음 미디어에 직접 따뜻한 미디어 2 ML을 추가합니다. 반복 2 또는 3 회)가 들어있는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI 2 ML있는 셀에 2 또는 3 번 씻는다. 10 MM의 HEPES를 포함하는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI의 1.8 ML를 추가합니다. </li><li> hBLT1 - RFP 및 온수 현미경 무대에서 β - arrestin1 - GFP (37 ° C)와 transfected RBL - 2H3 세포를 포함한 플레이스 30mm 유리 coverslip 바닥 문화 요리. </li><li> 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈 (우리의 현미경 시스템에서 사용할 수있는)를 사용하여 600x 배율에서 셀 이미지를 수집합니다. </li><li> 60 X의 객관 렌즈 하나 기름 방울을 넣고 일반 명시야와 세포 초점을 맞추고 접시의 바닥을 만져 빛을 전송. </li><li> transfected 단백질의 형광, 형광 필터 (RFP 필터, 당신이 β - arrestin1을보고 싶으면, 수용체 또는 GFP를보고 싶은 경우) 명시야 (전송 빛)에서 스위치를 모니터링합니다. </li><li> RFP 필터 및 이미지를 캡처를 사용하여 세포 표면에 hBLT1 - RFP을 표현하는 밝고 건강한 세포를 선택합니다. </li><li> 그런 GFP 필터 전환 및 β - arrestin - GFP의 세포질로 표현되었는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 의사 컬러 모두 이미지 캡처 시간이 형광을 통해 출혈이 RFP와 GFP 사이에 발생을 복용하지 않도록 라이브 셀 이미지를 타락한 전에. </li><li> 휴대폰의 선택이 만들어되면, 소프트웨어를 사용하여 목적 (이 인스턴스에서 Metamorph 소프트웨어)에 따라 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 현재 시연에서는, 16 비트 이미지는 온과 함께 찾았습니다라스의 비닝의 1로 설정 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈와 결합된 X 1. </li><li> Metamorph 소프트웨어에 의해 제어되는이 사용하는 필터 바퀴 30 초 시간 간격 (translocation / 상호 작용을 너무 빨리하는 경우, 그 중 하나가 시간 간격을 줄일 수)에 동시에 RFP 및 GFP의 fluorochromes에 대한 형광 이미지를 수집합니다. </li><li> 카메라 노출 시간은 RFP 및 GFP 1000 밀리초로 설정하십시오. (RFP 및 GFP의 형광 강도에 따라 특정 노출 시간을 설정합니다.) </li><li> 첫 공 시점 역할을 추가 리간드없이 1 분에 대한 이미지를 수집합니다. </li><li> 1 분 후 접시 / 또는 셀 위치를 방해하지 않고 리간드의 200 μL를 (10 μm의 재고에서 1 μm의의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 형광 이미지는 파일 이름의 증가 순서로 리간드를 삽입한 후 60 분에 대한 수집 및 TIFF 이미지로 저장됩니다. </li><li> 이러한 모든 파일은 소프트웨어를 사용하여 타임 스탬프 개별 / 결합 형광 이미지로 스택 파일로 만들 수 있습니다. </li></ol> 이미지의 프로세스와 단백질 및 현지화의 형광 부량 <ol><li> RFP 및 GFP 형광 필터를 일반 미디어 (NO 세포)로 이미지를 수집하고 배경 이미지로 저장합니다. 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 빼기 이러한 이미지를 사용합니다. </li><li> RFP 및 GFP 이미지를 개별적으로 이미지의 스택을 준비합니다. </li><li> RFP 및 GFP의 형광 강도를 (BLT1 및 β - arrestin의 translocation) 측정하는 다양한 영역을 (표면 VS cytosolic)를 선택 / 정의 </li><li> 시간의 함수로 금액 형광 강도를 플롯. 이 그래프는 주어진 분자의 translocation의 동력학에 대한 정보를 제공합니다. </li></ol> 대표 결과 A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션 이 프로토콜에서 설명한 방법은 leukotriene B 4 (그림 1과 연결된 비디오 1) 21쪽으로 돌기 세포 이주를 결정하는 데 사용되었다. 우리는 살아 세포에서 특정 리간드로 세포의 chemotactic 용량을 결정하기 위해 유사한 방법론을 적용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마우스 골수는 100 nm의 LTB 4 방향으로 돌기 세포 이주를 파생. 비디오 1. LTB 4 방향 BMDCs의 셀 마이 그 레이션 라이브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Boddulrui_Video1.AVI">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation 이 절차의 완료되면, 하나는 GPCR 신호 이벤트에 다음과 같은 정보를 얻을 수 있습니다. <ol class="lroman"><li> GPCR과 cytosolic 단백질과 핵의 현지화 (그림 2). </li><li> 리간드 유도 cytosolic 단백질 (이 경우에는 β - arrestin) (그림 3)과 표면 GPCR (이 경우에는 BLT1)의 상호 작용. </li><li> 막에 수용체 국제화 및 β - arrestin translocation의 속도론은 수용체 (그림 4) (Jala 외. 2005) 18과 함께 국제화 다음. </li><li> 하나는 라이브 세포의 리간드에 의존 수용체 활성화 상태를 (비디오 2 첨부) 확인하고 수용체 활성화 (Jala 외. 2005) 18 개입 중요한 주제이나 프로세스를 확인할 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. RBL - 2H3 세포에 BLT1 - RFP (A), β - arrestin - GFP (B), pNuc - CFP (C)의 표현. 패널 D.에 표시된 색상 결합된 이미지 <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 수용체와 β - arrestin의 리간드 유도 translocation. 세포의 형광 강도의 라인 스캔이 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 1 μm의 LTB 4시 또한 수용체의 내면화 및 β - arrestin translocation의 속도론. 형광 강도는 막과 세포의 cytosolic 위치에서 시간의 함수로 측정되었다. 1 μm의 LTB 4 이외에 BLT1 - RFP 및 β - arrestin - GFP를 표현하는 세포의 비디오 2 라이브 영상이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Bodduluri_Video2.AVI">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

라이브 셀 이미징들은 실시간으로 발생과 같은 특정 단백질의 기능과 상호 작용을 설명하는 강력한 도구입니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 명확하게 LTB 4 돌기 세포의 빠른 마이 그 레이션을 일으킬 수 보여줍니다. 이러한 방법은 다양한 세포 유형 LTB 4 기능의 측면뿐만 아니라 확장, 그들은 유사한 방법을 다른 chemokines의 다양한 적용 및 다른 백혈구 하위 집단에 대한 chemotactic 대리인으로서의 효능을 테스트 할 수 있습니다. 이 시스템의 형광 이미징 실시간으로 신호 이벤트를 모니터링하실 수 있습니다. 또한, 이러한 방법은 또한 적절한 flurochromes 태그 분자를 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (걱정)에 따라 생체내에서 분자의 꽉 연결을 검사하기 위해 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>쥐 염기성 백혈병 세포주(RBL-2H3) 또는 HEK293 세포.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>델베코&amp;rsquo;수정된 Eagle 배지&amp;rsquo;배지 (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 프리 RPMI 또는 DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, 액체</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 멸균 유리 커버슬립 바닥 Fluoro 디쉬 (두께 0.17 mm) (WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>멸균 Gene Pulser 큐벳 (0.4 cm 전극 간격) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II 전기천공기 </td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 도립 현미경에 장착된 TE-FM 형광 시스템</td><td>Nikon 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 소프트웨어</td><td>범용 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직형 마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유압식 마이크로매니퓰레이터 MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>거친 수동 조작기, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;강력한&gt;cDNA 구축물:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-말단에 적색 형광 단백질이 태깅된 G-단백질 결합 수용체의 cDNA (hBLT1-RFP)</td><td>Jala 등 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td> GFP가 태그된 세포질 단백질의 cDNA (&amp;#946;-arrestin1-GFP(본 연구에서 사용됨).</td><td>Jala 등(2005)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

leukotriene b의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 blt1 상호 작용

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G - 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 일곱 transmembrane 단백질 제품군에 속하는 및 세포내 반응하는 세포 신호 전달을 중재. GPCRs 제어 등 chemotaxis와 같은 다양한 생물 학적 기능, 세포내 칼슘 릴리스 heterotrimeric G - 단백질 1-2 통해 리간드에 의존적인 방식으로 유전자 규정. 리간드 바인딩은 순환 아데노신 monophosphate (CAMP), 이노시톨의 삼인산 (IP3)와 diacyl 글리세롤 (DG)로 두번째 사자의 수준을 조절 heterotrimeric G - 단백질의 활성화로 이어지는 conformational 변화 일련의 유도. 수용체 리간드 바인딩의 활성화와 함께 수반하는 또 desensitization, 격리 및 / 또는 국제화를 통해 신호 수용체를 자제하는 이벤트의 시리즈를 시작합니다. GPCRs의 desensitization 과정은 G - 단백질 수용체 kinases (GRKs)과 β - arrestins 3 이후 결합하여 수용체의 인산화 통해 발생합니다. β - arrestins은 cytosolic 단백질이며 수용체 내면화 4-6을 촉진하여가 (대부분의 경우) phosphorylated 수용체에 결합, GPCR 활성화에 막으로 이동시키다. 와 LTB 4 수용체 2 (BLT2, 낮은 친화 수용체, Leukotriene B 4 (LTB 4) GPCRs, LTB 4 수용체 1 (고친 화성 수용체 BLT1)을 통해 arachidonic의 산성 경로 및 mediates의 행동에서 파생된 프로 염증성 지질 분자이다 ) 7-9. LTB 4 BLT1 경로는 천식, 관절염 및 죽상 경화증 10-17, 등 여러 가지 염증 질환에 중요한 것으로 표시되었습니다. 현재 신문은 LTB 4 유도된 백혈구 마이 그 레이션 및 BLT1의 상호 작용 β - arrestin과, 현미경 이미징 기술을 사용하여 18-19 살 세포 수용체의 translocation을 모니터하기 위해 개발된 방법을 설명합니다. C57BL / 6 마우스에서 돌기 세포를 파생 골수는 격리 및 이전에 20-21을 설명한 교양되었습니다. 이러한 전지는 LTB 4 유도된 세포 마이 그 레이션을 보여주는 라이브 셀 이미징 방법으로 테스트되었습니다. 인간 BLT1는 녹색 형광 단백질 (β - 도착지 - GFP)로 태그가 C - 말단과 β - arrestin1에서 적색 형광 단백질 (BLT1 - RFP)를 지정하여 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 세포 라인에 plasmids 모두 transfected했습니다 18-19. 이러한 단백질 및 현지화 사이의 상호 작용 속도론는 라이브 세포 영상 현미경을 사용하여 모니터링할되었습니다. 현재 논문의 방법론은 라이브 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 기능 반응을 조사하기 위해 미세 기술의 사용을 설명합니다. 현재 종이는 또한 수용체의 반응 속도론과 cytosolic 단백질 상호 작용을 결정하는 형광 강도를 정할 Metamorph 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다.

본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 7회 막관통 단백질 가족에 속하며, 세포 외 신호를 ...로 전달하는 매개체 역할을 합니다.

Leukotriene B4는 다양한 염증 세포에 존재하는 G 단백질 결합 수용체인 BLT1 및 BLT2를 통해 작용을 매개하는 염증 유발 분자입니다. LTB4-BLT1 경로는 천식, 관절염 및 동맥경화증을 포함한 여러 염증성 질환에서 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 화학성, 세포 내 칼슘 방출 및 유전자 조절과 같은 세포 내 반응을 일으키는 세포 외 신호의 전달을 매개합니다.세포 외 리간드 결합은 이질삼량체 G 단백질의 활성화를 유도하는 일련의 구조적 변화를 일으킵니다. 그 후 G 단백질은 cyclic adenosine monophosphate, acetol tri phosphate 및 DYL glycerol과 같은 이차 전령의 수치를 조절합니다. 골수 유래 수지상 세포(B MDCs)에서 leukotriene B4 매개 세포 이동을 실시간으로 관찰하기 위해, 마이크로 피펫을 통해 리간드를 제어된 흐름으로 전달하며 이미징을 수행합니다. 이동성을 평가하기 위해 타임랩스 이미징을 실시합니다.이러한 살아있는 세포 실시간 이미징 기술을 사용하여, 본 연구실은 leukotriene B4 수용체 BT1이 수지상 세포에서 기능적으로 발현된다는 것을 발견했습니다. 또한 BT1의 내재화 과정에서 인산화 및 beta-arrestin 의존적 기전이 관여함을 확인했습니다. 본 연구실에서 이러한 기술들 중 상당수를 개발한 Jla 조교수가 세포 이동과 수용체 내재화를 모두 시연할 예정입니다. 세포 이동 분석을 위해 골수 유래 수지상 세포(BMDCs)를 준비하려면, FBS, 재조합 GM-CSF 및 재조합 FLT3가 포함된 RPMI 1640 배양액에 0.5 million 개의 세포를 35 millimeter 유리 바닥 디시에 분주하십시오.플레이팅 후, 세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 16시간 동안 배양합니다. 16시간 후, 3 mL의 PBS를 첨가한 다음 흡입하여 제거합니다. 마지막 흡입 후 이 세척 과정을 최소 2회 더 반복하고, 플레이트에 2 mL의 PBS를 첨가합니다.이제 세포들이 실험 준비가 되었으며, 37 °C로 유지해야 합니다. 한편, 이 비디오의 실험에 사용된 이미징 시스템은 가열 스테이지와 cool SNAP hq 디지털 흑백 CCD 카메라가 장착된 Nikon eclipse TE 300 도립 현미경에 A-T-E-F-M 에피 형광 시스템이 부착된 형태입니다.들뜸 및 방출 파장은 필터 휠과 Lambda 10-2 필터 휠 컨트롤러를 통해 제어합니다. 하드웨어 제어 및 이미지 획득은 metamorph 소프트웨어로 제어합니다. 피펫을 고정하기 위해 두 개의 마이크로 매니퓰레이터가 현미경 스테이지에 부착되어 있으며, 피펫은 동봉된 텍스트의 지침에 따라 제작하거나 구매할 수 있습니다.100 nM 농도의 염증 유발 리간드 leukotriene B₄(LTB₄) 스톡 용액 1.5 mL를 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다. 마이크로피펫 팁을 용액에 넣고 용액이 자연스럽게 들어가게 하여 마이크로피펫을 다시 채웁니다. 이러한 로딩 방식은 마이크로피펫 끝에 공기 방울이 생기는 것을 방지합니다. 다음으로, 마이크로필 바늘이 장착된 1 cm³ 투베르쿨린 주사기에 LTB₄ 1 mL를 채웁니다.그런 다음 이를 사용하여 위쪽에 연결된 튜브를 통해 LTB 4로 채워진 마이크로 피펫을 천천히 채웁니다. 그 후, 리간드로 채워진 1mL 시린지에 연결된 21게이지 1.5인치 바늘에 마이크로 피펫과 튜브를 연결합니다. 이제 골수 유래 수지상 세포의 살아있는 세포 이미징을 수행하기 위해, 리간드가 채워진 마이크로 피펫을 현미경 스테이지 위의 마이크로 매니퓰레이터 중 하나에 조심스럽게 고정합니다.LTB4 리간드를 처리한 후, 플레이트에 배양된 미성숙 b MDC를 인큐베이터에서 꺼내 현미경의 가열 스테이지 위에 놓습니다. 60 x 오일 침수 렌즈를 사용하여 세포를 관찰 범위에 둡니다. 세포의 이동을 적절히 모니터링할 수 있도록 세포가 너무 밀집되지 않은 영역을 찾습니다.플루오로 디쉬(fluoro dish)의 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 조동 매뉴얼 조작기를 사용하여 리간드가 충전된 피펫을 조심스럽게 내린 후 안으로 이동시킵니다. 유압 정밀 마이크로 조작기를 사용하여 세포에 최대한 가깝게 접근시킵니다.피펫의 초점을 맞춥니다. 시린지에 약간의 압력을 가하여 팁에서 LTB four ligand가 천천히 방출되도록 합니다. ligand는 확산에 의해 배지로 천천히 퍼져 나가야 합니다. 다음으로, metamorph 소프트웨어를 사용하여 2시간 동안 15초마다 명시야 영상을 획득하도록 영상 획득 파라미터를 설정합니다.리간드를 향한 이동의 진행 상황을 5분마다 계속 모니터링하십시오. 본 프로토콜에 설명된 방법은 류코트리엔 B4를 향한 수지상 세포의 이동을 결정하는 데 사용되었습니다. 여기서는 100을 향한 마우스 골수 유래 수지상 세포의 이동을 다룹니다.타임랩스 이미징 영상에서 LTB4를 향해 이동하는 살아있는 B MDCs의 세포 이동을 관찰할 수 있습니다. 이와 유사한 방법을 적용하여 다양한 화학 유인 물질에 대한 여러 세포 유형의 화학주성 반응을 결정할 수 있습니다. 이러한 이미징 기술을 형광 단백질 태그 분자와 결합하여 사용하면 살아있는 세포 내 분자들의 움직임과 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있습니다.본 영상에서는 형광 표지된 leukotriene B4 수용체 1과 beta arrestin의 상호작용을 실시간으로 보여드립니다. RBL 2H3은 ATCC에서 구할 수 있는 Wistar 쥐에서 유래한 쥐 호염기성 백혈병 세포주입니다. 이 세포들은 많은 케모카인 수용체를 발현하지는 않지만, 케모카인 의존적 신호 전달 경로를 매개할 수 있는 세포 구성 성분을 갖추고 있습니다.리간드에 의해 유도되는 BT1의 내면화를 실시간으로 평가하기 위해, RBL 2H3 세포에 BT1 RFP와 beta-arrestin GFP를 형질전환합니다. 타임랩스 이미징 중에 플레이트에 리간드를 첨가합니다. 이러한 단백질들의 위치 변화는 이미지 분석을 통해 평가할 수 있습니다.G PCR R 내부화를 실시간으로 연구하기 위해, 동봉된 텍스트의 지침에 따라 B LT one RFP 및 beta arrest와 GFP를 RBL two H three 세포에 트랜스펙션합니다. 그 다음, 전기천공된 세포와 일반 성장 배지 혼합물 300 µL를 일반 성장 배지 2 mL가 포함된 35 mm 형광 디쉬로 옮깁니다. 세포를 37 °C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소의 가습 환경에 두어 디쉬 바닥에 부착되도록 합니다.1시간 후, transfection 배지를 일반 성장 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 18~24시간 동안 추가로 배양합니다. 배양 후, 10 mM HEPES가 포함된 따뜻한 phenyl red free RPMI 2 mL를 플레이트에 직접 가하고 배지를 흡입하여 제거하는 방식으로 세포를 2~3회 세척합니다. 그런 다음 1.8 mL를 추가로 가합니다.다음으로, 배양 접시를 가열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 60 x 오일 침강 렌즈를 사용하여 600 x 배율로 이미지를 수집합니다. 그 후 적절한 형광 필터로 전환합니다.세포 표면에 HBL BT one RFP를 발현하는 건강한 세포를 선택하고 이미지를 캡처합니다. RFP 필터를 사용하여 GFP 필터로 전환한 다음, 세포질에 beta arrest 및 GFP가 발현되었는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그 후, 병합된 가색(pseudo colored) 이미지를 검토하여 오정렬의 결과로 발생할 수 있는 형광 번짐(bleed through) 현상이 있는지 확인합니다.RFP와 GFP 사이에서는 수용체의 타겟팅이 일어나지 않습니다. 다음으로, 타임랩스 이미징을 위한 파라미터를 여기에 입력하십시오. 16비트 이미지는 카메라 빈딩을 하나씩(one by one)으로 설정하여 획득합니다.RFP 및 GFP 형광 필터와 R-F-P-G-F-P 빔 스플리터를 사용하여 적색 및 녹색 형광 이미지를 순차적으로 캡처합니다. 소프트웨어를 설정하여 1시간 동안 32초 간격으로 이미지를 캡처하십시오. 유사한 다이내믹 레인지가 얻어지도록 카메라 노출 시간을 설정합니다.RFP 및 GFP의 형광 강도를 측정합니다. 1분 동안 이미지를 수집한 후, t=0 시점에 200 µL의 리간드를 플레이트를 흔들지 않고 직접 첨가합니다.60분 동안 형광 이미지 수집을 계속합니다. 리간드를 첨가한 후 이미지가 획득되면, 순차적인 파일 이름의 TIFF 이미지로 자동 저장됩니다. 이후 소프트웨어를 사용하여 해당 파일들을 개별 이미지 또는 통합 이미지로 확인할 수 있습니다.마지막으로, 모든 세포 이미지 획득이 완료되면 동일한 설정으로 세포가 없는 일반 배지만을 사용하여 이미지를 획득합니다. 분석 시 배경 이미지로 사용하기 위해 이 파일들을 저장하십시오. Metamorph의 이미지 감산(image subtract) 기능을 사용하여 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 배경을 제거하십시오.이를 통해 배지에서 발생하는 배경 신호나 자가형광을 보정할 수 있습니다. 다음으로, 파일 메뉴에서 생성된 최종 스택 파일 옵션을 열어 개별 이미지 스택들을 엽니다. 이어서, 영역 측정(region measurements)에서 타원형 영역 추적(ellipse region trace region)을 선택하고 관심 영역을 지정합니다. BLT1 및 beta arrestin 전위(translocation)에 해당하는 RFP와 GFP의 형광 강도를 측정하기 위해 표면 및 세포질 영역을 선택합니다.Excel과 자동으로 연동되는 로그 데이터 옵션을 사용하여 시간 함수에 따른 형광 강도 값을 기입하십시오. 이 그래프를 통해 특정 분자의 전위(translocation) 역학에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 이미지 분석을 통해 GPCR, 세포질 단백질 및 핵의 국소화를 확인할 수 있습니다.여기 RBL 2 H 3 세포 표면에서 BT1 RFP의 발현이 관찰됩니다. 이 이미지는 동일한 세포의 세포질 내 beta rest와 GFP의 국소화를 보여주며, 핵 내에서는 pNuke CFP가 관찰됩니다. 여기에 표시된 합성 색상 이미지는 각 형광 크롬의 뚜렷한 세포 내 국소화를 나타냅니다. 또한, 리간드로 유도된 표면 GPCR와 세포질 단백질 간의 상호작용 역시 여기서 평가할 수 있습니다.리간드 유도 BLT1 수용체 및 베타-어레스틴의 전위. 이 비디오는 BLT1 RFP와 베타-어레스틴 GFP를 발현하는 세포의 실시간 이미징을 보여줍니다. 1 µM LTB4를 첨가하면, Metamorph 소프트웨어를 사용하여 전위 패턴의 정량화를 모니터링할 수 있습니다.대표 세포에서 T=0일 때의 형광 강도 라인 스캔 결과가 나타나 있습니다. BT1 RFP는 세포막에서 관찰되며, beta arrestin GFP는 세포질에서 관찰됩니다. 리간드를 첨가하자 RFP와 GFP 라인이 겹치는 것이 관찰되며, 이는 수용체와 beta arrestin의 공동 국소화를 시사합니다.또한, 여기에서 단백질 이동의 역학을 결정할 수 있습니다. 1 µM LTB4를 첨가한 후 수용체 내입 및 beta arrestin 전위의 역학을 조사하였습니다.세포의 막과 세포질 위치에서 시간에 따른 형광 강도를 측정하였습니다. LTB4 리간드를 $\text{B}\text{L}\text{T}1\text{-RFP}$와 $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$가 형질전환된 RRB2 H3 세포에 첨가하면, $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$가 세포질에서 막으로 이동하며, 이는 1분 이내에 노란색 링이 형성되는 것으로 관찰됩니다. $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$와 상호작용함에 따라, $\text{B}\text{L}\text{T}1\text{-RFP}$는 수용체 $\beta\text{-arrestin}1\text{-GFP}$ 복합체를 형성하고, 5분 이내에 노란색 점(puncta)이 나타나는 것에서 알 수 있듯이 엔도솜 형태로 세포질을 통해 이동합니다. 이러한 방법을 통해 리간드 의존적 수용체 활성 상태와 수용체 활성화에 관여하는 핵심 모티프 또는 과정을 결정할 수 있습니다.실험에서 가장 중요한 점은 플레이트가 작동하는 동안 버퍼의 상태를 세심히 관찰하는 것입니다. 실험은 전개 후 1시간 이상 진행됩니다. 이 기술은 케모카인 및 수용체 분야의 연구자들이 다양한 포유류 세포 유형에서 세포 이동과 수용체-리간드 상호작용을 탐구하기 위해 고안하였습니다.이 영상을 시청한 후, 케모카인과 그 수용체, 그리고 beta-arrestin과 같은 세포질 단백질 간의 상호작용을 포함하는 실시간 이미징 실험을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

배우세요 백혈구의 화학주성 반응과 G-단백질 연결 수용체 상호작용을 실시간 세포 영상으로 관찰하는 방법을. 뼈수지 유래 수지상 세포 이동과 수용체 내재화 메커니즘을 분석하여 염증 질환 치료 전략 개발에 기여합니다.

Leukotriene B의 실시간 영상₄ 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

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