Name: 더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: 배우세요 모기의 선천성 면역 체계가 말라리아 기생충과 뎅그열 바이러스를 사멸시키는 분자 메커니즘을 탐구하는 방법을. 마이크로어레이와 RNA 간섭 기법을 활용하여 질병 저항성 유전자를 식별하고 유전자 변형 모기 개발을 위한 새로운 방제 전략을 제시합니다.

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더 나은 모스키토 구축 : a. gambiae 및 a. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

이 인터뷰에서, 조지는 Plasmodium falciparum Dimo​​poulos 및 뎅그열 바이러스 감염을 방지하기 위해 모기에 의해 사용되는 생리적 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 설명이 방법은 주요 내화물 유전자에 대해 제공됩니다, 벡터 병원균에 대한 저항력을 부여하는 그 유전자는, 모기에 식별 방법과이 지식은 말라리아 기생충이나 뎅그열 바이러스를 가지고 수없는 유전자 변형 모기를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

본 인터뷰에서 George Dimopoulos는 모기가 *Plasmodium falciparum* 및 뎅기 바이러스에 대항하기 위해 사용하는 생리학적 기전에 초점을 맞춥니다...

저는 George Dimopoulos입니다. 저는 존스 홉킨스 보건대학원 분자미생물학 및 면역학과의 말라리아 연구소에서 조교수로 재직하고 있습니다. 제 연구팀은 말라리아를 전파하는 감비아 모기를 연구하고 있으며, 특히 말라리아 기생충을 제거하는 데 관여하는 모기의 선천 면역 체계에 중점을 두고 모기의 분자생물학을 연구하고 있습니다.우리는 이 면역 체계가 어떻게 작동하며, 기생충을 사멸시키는 데 어떤 유전자와 분자가 중요한지 이해하고자 합니다. 이 체계의 생물학적 원리를 파악함으로써, 향후 말라리아 제어 전략을 개발하는 데 그 지식을 활용할 수 있을 것이라고 믿습니다. 말라리아는 세계에서 가장 심각한 질병 중 하나입니다.말라리아는 사실 인류와 아주 오랫동안 함께해 왔으며, 여전히 이 질병이 남아 있다는 점은 매우 안타까운 일입니다. 말라리아는 매년 4억 명의 사람을 감염시키고 200만 명의 생명을 앗아가는데, 주로 사하라 이남 아프리카 지역에서 발생하지만 남미와 아시아의 다른 개발도상국에서도 발견됩니다. 말라리아는 Plasmodium 속의 원충 기생충에 의해 발생하며, 인간에게 말라리아를 일으키는 Plasmodium 종은 네 가지가 있습니다.그중 가장 중요한 것은 Plasmodium falciparum입니다. Plasmodium falciparum은 주로 Anopheles 속에 속하는 모기에 의해 전파되며, 사하라 이남 아프리카에서 말라리아 전파의 가장 중요한 매개 모기는 Anopheles gambiae 종 복합체에 속하며 주로 아프리카의 사하라 이남 지역에 분포합니다. 뎅기 바이러스는 플라비바이러스(Flavivirus)이며, 주로 Aedes aegypti 모기에 의해 전파됩니다.이 바이러스의 지리적 분포는 말라리아와 매우 유사합니다. 미주, 동남아시아 및 아프리카에서 발견됩니다. 뎅기 바이러스는 출혈열을 유발합니다.약 25억 명의 사람들이 뎅기 바이러스의 위험에 처해 있으며, 이 바이러스는 매년 수백만 명에게 출혈열을 일으킵니다. 뎅기 출혈열은 지난 10년 동안 가장 심각한 매개체 전파 질환 중 하나로 부상했습니다. 또한 말라리아 기생충은 인간 숙주 사이를 전달하는 모기 매개체와 인간 숙주 모두에서 복잡한 생애주기를 가지고 있습니다.저희 연구 그룹은 모기 내 말라리아 전파의 생물학적 기전을 연구하고 있습니다. 모기가 감염된 혈액을 섭취하면, 그 안에 있는 Plasmodium falciparum 기생충도 함께 섭취하게 됩니다. 기생충의 생식모세포는 중장 내에서 수정되어, 혈액 섭취 후 약 18~35시간 사이에 오오키네트(ookinete)를 생성합니다.이 오키네(Ookinete)들은 여기 모기의 중장 상피세포로 침입해야 합니다. 대부분의 오키네는 이 단계에서 모기의 면역 체계에 의해 사멸하며, 바로 이 지점이 저희 연구의 핵심 초점입니다. 또한 이것은 오키네의 공초점 현미경 이미지입니다. 중장을 통과한 오키네는 여기 기저측에 낭종(cyst)을 형성하며, 이 낭종 내에서 수천 개의 포자소체(sporozoite) 단계 기생충이 발달합니다. 이 포자소체 단계는 모기가 흡혈한 후 약 15일쯤 지나면 타액선으로 이동하며, 타액선으로부터 포자소체가 새로운 숙주로 전파될 수 있습니다. 모기의 면역 체계는 포자소체가 모기의 혈림프(hemocoel)로 방출되는 이 단계에서도 이들을 사멸시키는 데 관여합니다.모기 게놈은 최근 2002년에 서열 분석이 완료되었으며, 이를 통해 소위 마이크로어레이라 불리는 기법으로 다양한 감염 조건에서 모기의 모든 유전자, 즉 약 14,000개 유전자의 발현을 연구하기 위한 새로운 분자 생물학 및 게놈학 도구를 개발할 수 있었습니다. 수년 전에 개발한 이 마이크로어레이에는 당시 알려진 모든 모기 유전자를 포함한 모기의 전체 전사체와 플라스모디움(plasmodium) 기생충 유전자가 포함되어 있습니다. 따라서 감염 과정 동안 모기와 기생충 모두의 유전자 활성을 동시에 분석할 수 있습니다.모기가 말라리아 기생충(plasmodium parasites)에 감염되었을 때 활성화되는 유전자를 확인하면, 해당 유전자들이 기생충을 제거하는 데 관여하는지 테스트해야 하며, 이를 위해 RNA 간섭 유전자 억제(RNA interference gene silencing)라는 방법을 사용합니다. 기본적으로 타겟으로 하는 유전자의 RNA를 주입하며, 이 이중 가닥 RNA는 모기 내 타겟 유전자의 mRNA를 분해하여 해당 유전자가 단백질을 생성하지 못하게 합니다. 그 후, 모기를 기생충에 감염시킵니다.이제 모기에서 특정 유전자를 침묵시키거나 비활성화했을 때, 이러한 침묵으로 인해 기생충이 처리되지 않은 모기보다 더 높은 감염률을 보인다고 가정해 보겠습니다. 이는 해당 유전자가 어떤 방식으로든 말라리아 기생충을 제거하는 데 사용된다는 것을 시사합니다. 그리고 이것이 바로 모기 내에서 유전자가 기생충 제거에 관여하는지 테스트하기 위해 우리가 사용하는 주요 방법입니다.대부분의 plasmodium 기생충은 모기 체내에서 사멸하며, 모기의 선천성 면역 체계가 이러한 사멸의 주요 원인이라는 강력한 증거가 있습니다. 본 연구실과 협력 연구실들은 이 과정에 관여하는 다양한 유전자들을 확인하였습니다. 이러한 기생충 사멸 기전으로 인해, 선천성 면역 방어 메커니즘을 통해 중장 내의 모든 기생충을 사멸시켜 말라리아를 전파하지 않는 유전적 선택 모기 계통 또한 존재합니다.모기는 기생충을 표적으로 하는 다양하고 서로 다른 성분과 기작을 가지고 있는 것으로 보이며, 현재 가장 큰 과제는 이러한 기능들이 어떻게 작동하는지 이해하고 이를 조작하여 저항성 모기를 개발하는 것입니다. GTI 모기는 앙골라 감비아 모기가 오디움 감염을 조절하는 것과는 다른 기작을 사용하여 뎅기 바이러스 감염을 조절합니다. 모든 진핵생물과 마찬가지로 이집트숲모기도 RNA 간섭이라고 불리는 RNA 의존성 방어 기작을 가지고 있습니다.이는 기본적으로 바이러스의 RNA를 표적으로 삼아 분해할 수 있는 방어 기제이며, 이러한 방식으로 바이러스 감염으로부터 스스로를 보호합니다. 우리는 이 방어 기제를 이해하고, 이를 어떻게 조절하여 바이러스에 저항성을 가진 모기를 생성할 수 있을지 연구하고 있습니다. 지난 10년 동안 분자생물학은 매우 극적인 발전을 이루었으며, 특히 방법론적 진보를 통해 연구 속도가 엄청나게 빨라졌습니다.주요한 진전 중 하나는 전체 게놈의 고처리량 시퀀싱을 가능하게 한 시퀀싱 기술입니다. 이러한 기술 덕분에 현재 ous Gambia와 A, this gyp 모기 게놈의 시퀀싱이 완전히 완료되었습니다. 이를 통해 감염 제어에 관여하는 유전자를 이전보다 훨씬 더 쉽게 식별할 수 있게 되었습니다.기능 유전체학 분야의 또 다른 매우 중요한 발전은 마이크로어레이를 이용한 고처리량 유전자 발현 분석입니다. 마이크로어레이는 수천 개의 DNA 단편이 고정된 작은 유리 슬라이드로, 이러한 소위 DNA 칩을 사용하여 매우 많은 수의 유전자에 대한 유전자 발현을 모니터링할 수 있습니다. 이 분야의 또 다른 매우 중요한 발전은 RNA 간섭 유전자 억제 방법론으로, 이를 통해 모기 내의 특정 유전자를 표적하여 불활성화할 수 있으며, 결과적으로 소위 역유전학적 접근 방식을 사용하여 유전자 기능과 우리가 관심 있는 유전자가 기생충을 사멸시키는 데 어떻게 중요한 역할을 하는지 연구할 수 있습니다.저희와 공동 연구진이 대부분의 연구에 사용한 모기는 최대 30년 동안 실험실 조건에서 유지되어 온 모기 군집에서 유래되었습니다. 이러한 모기들은 자연 상태에서 발견되는 모기들과는 분명히 상당한 차이가 있습니다. 자연 상태의 모기들은 실험실의 매우 안정적인 조건과 달리, 현장에서 매우 다양하게 변하는 여러 미생물 및 기타 매개변수들로부터 지속적인 선택 압력을 받기 때문입니다.따라서 야외 모기에서 직접 연구를 수행한다면 아마 훨씬 더 많은 정보를 얻을 수 있을 것이라고 주장할 수 있을 것입니다. 하지만 불행히도 그것은 그리 쉽지 않습니다. 앞서 언급했듯이 야외에는 관련 인프라가 없으며, 야외에서 모기를 채집하여 이를 통해 군집을 형성하는 것 또한 매우 복잡한 일입니다.따라서 현재 우리가 가진 최선의 생물학적 모델은 실험실 모델이지만, 당연히 어느 시점에는 현장에 나가 실험실 모기를 통해 발견한 주요 결과들을 검증하고 확인해야 할 것입니다. 우리는 모기의 방어 체계가 이 곤충들이 매개하는 인간 병원균을 사멸시키는 데 관여한다는 것을 알고 있습니다. 이제 이러한 사멸이 어떻게 일어나는지, 어떤 유전자가 관여하며 어떤 메커니즘이 작용하는지 이해할 수 있다면, 이를 잠재적으로 조작하여 병원균을 매개할 수 없는 유전자 변형 모기를 개발하는 데 활용할 수 있을 것입니다.이렇게 유전적으로 변형된 모기를 개발하고 나면, 실제로 이들을 야생에 방사하여 감수성 모기에 대비해 우점종으로 만드는 방법을 고민할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해 널리 논의된 전략 중 하나는 기본적으로 자연 집단 내에 저항성 유전자를 퍼뜨리는 것인데, 이는 모기를 병원체에 대해 저항성 있게 만드는 유전자로, 소위 유전자 드라이브(genetic drive) 메커니즘을 통해 구현되어야 합니다. 현재 많은 연구가 이러한 유전자 드라이브 메커니즘의 개발에 집중되고 있습니다.물론, 어떤 종류의 유전자 변형 생물이라도 자연에 방출할 때는 고려해야 할 많은 윤리적 사항이 있습니다. 현장에서는 유전자 변형이 항상 자연적으로 발생한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 세 가지 돌연변이로 인해 모기가 병원체를 더 잘 전파하게 되거나 다른 바람직하지 않은 특성을 갖게 될 것이라고 믿을 만한 근거는 거의 없습니다.가장 좋지 않은 시나리오는 병원체가 어느 시점에서 이 형질전환 모기에 대해 내성을 갖게 되는 것입니다. 물론, 유전자 변형 모기를 현장에 방사하는 것을 고려하기 전에 수많은 현장 테스트와 실험실 테스트를 거쳐야 할 것입니다. 또한, 이러한 통제 전략에 대해 사람들을 교육하고 모든 이가 안심하며 이러한 유형의 전략에 동의하도록 해야 합니다. 모기 매개체 내에서 병원체를 차단하는 방식의 질병 통제 전략을 달성하기에는 여전히 많은 장애물이 남아 있습니다.이러한 장애물 중 일부는 우리가 해결해야 할 기술적 문제 및 실험적 문제와 관련이 있습니다. 한 가지 예로, 저항성 유전자가 집단 내에 효율적으로 퍼질 수 있도록 하는 유전자 드라이브 메커니즘의 개발이 장애물이 됩니다. 질병 매개체 생물학 분야는 지난 10년에서 15년 동안 비약적인 발전을 이루었으며, 이는 주로 곤충과 병원체 상호작용의 생물학적 이해가 실제로 제어 전략 개발에 도움이 될 수 있다는 인식 덕분이었습니다.그리고 이러한 인식은 이 분야의 연구에 대한 지원 확대 공로로 이어졌습니다. 우리가 달성한 추진력을 유지하고, 매개체-병원체 상호작용의 생물학적 기전을 이해하며, 이러한 생물학적 지식을 질병 제어 전략 개발에 활용함으로써 우리의 임무를 완수하기 위해서는 이러한 자금 지원과 헌신이 지속되는 것이 매우 중요합니다.

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연구

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유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

이 솔직한 인터뷰에서, 안토니 A. 제임스 모기 유전이 말라리아와 뎅그열 전송을 제어하기 위해 악용될 수있는 방법을 설명합니다. 인구 교체 전략, 형질 전환 모기가 질병 전송을 제어하기 위해 야생으로 출시 될 수있다는 생각은, 유전 드라이브 및 효과적인 유전자 드라이브 시스템에 대한 설계 기준의 개념뿐만 아니라 도입입니다. 야생으로 유전자 - 수정된 생물을 발표의 윤리적 고려 사항도 설명합니다.

유전자 변형 모기를 사용하여 말라리아와 뎅그열 피버의 확산을 방지

Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수...

옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

여기에서 보고된 프로토콜은 실험실에 포함된 작은 케이지 예심에서 벡터 통제를 위한 유전으로 조작된 모기의 성능을 평가하는 세 가지 대안을 보여줍니다. 각 프로토콜은 모기 균주 곰 (유전자 드라이브 또는 비 유전자 드라이브)과 측정 된 매개 변수의 유형을 특정 수정에 맞게 조정됩니다.

유전자 조작 된 아노펠리인 모기의 작은 케이지 실험실 시험

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

성인 모기 침샘 (SG)은 바이러스와 기생충을 포함하여 모든 모기 매개 병원균을 인간 숙주에게 전염시키는 데 필요합니다. 이 비디오는 애벌레 (L4) 단계 Anopheles 감비아모기에서 SGs의 효율적인 격리와 추가 분석을 위한 L4 SGs의 준비를 보여줍니다.

아노펠스 감비아모기의 라발 살리보리 땀샘의 해부 및 면역스테인팅

간단한 해부학적 구조를 감안할 때 Anopheles 고환은 정자 형성을 연구하기 위한 좋은 세포학적 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 이 생물학적 과정을 조사하는 데 사용되는 기술인 전체 마운트 형광 in situ 교잡과 정자 생산에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 형질전환 균주의 표현형을 설명합니다.

Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

배우세요 모기의 선천성 면역 체계가 말라리아 기생충과 뎅그열 바이러스를 사멸시키는 분자 메커니즘을 탐구하는 방법을. 마이크로어레이와 RNA 간섭 기법을 활용하여 질병 저항성 유전자를 식별하고 유전자 변형 모기 개발을 위한 새로운 방제 전략을 제시합니다.

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