플렉스의 변경을 물려 전할 수있는 환경을 유도

이 절차의 전반적인 목표는 유전 가능한 게놈 변이를 초래하는 조건에서 유도성 아마 품종을 성장시키는 방법을 입증하는 것입니다. 또한, 게놈 변화를 모니터링하고 다양한 환경에서 후속 세대에서 유도 식물의 성장을 관찰합니다. 이를 달성하기 위해 아마는 다양한 유도 조건에서 재배됩니다.

그런 다음 잎과 마리스 줄기 조직은 다양한 환경에서 식물이 성장하는 동안 다양한 시간에 수집됩니다. 다음으로, DNA와 RNA는 조직 샘플에서 분리됩니다. 절차의 마지막 단계는 DNA 샘플을 사용하여 PCR을 수행하고 분리된 RNA를 사용하여 Q-R-T-P-C-R을 수행하여 다양한 환경 조건에서의 성장으로 인한 유전체 변화 및 유전자 발현 변화를 확인하는 것입니다.

궁극적으로, 게놈의 특정 지점에서 LIS one 삽입 요소의 출현과 함께 성장 조건에 대한 유전체 반응을 보여주기 위한 결과를 얻을 수 있으며, 처리된 식물의 조직에서 분리된 핵산으로 수행된 PCR 및 R-T-P-C-R에 의해 시각화된 해당 요소의 존재와 관련된 발현 차이를 나타낼 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 케이스 웨스턴 리저브 대학교 생물학과의 크리스 컬(Chris Cull)입니다. 저는 컬 랩(Cull Lab)의 코리 존슨(Cory Johnson)입니다.

저는 역시 컬 랩의 티파니 모스입니다. 저는 마샬 루카스입니다. Cull lab의 학부 연구를 위한 여름 프로그램의 학부생.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 성장 환경의 변화로 인한 게놈 및 유전자 발현의 변화를 연구합니다. 시작하겠습니다. 유도 조건에서 아마를 재배하려면 5인치 화분에 흙을 채우고 굳히는 것으로 시작합니다.

다음 식물, 냄비 당 3 개의 아마씨, 1/4 인치 깊이. 그런 다음 비 유도 제어 조건을 위해 씨앗 위의 토양에서. 100th 강도 miracle grow 용액 100ml로 식물에 물을 줍니다.

영양분이 높은 조건에서 식물을 100ml의 최대 강도로 처리하십시오. 기적이 자랍니다. 마지막으로 신청하십시오.

영양분이 적은 식물에만 수돗물을 공급하십시오. 식물이 자라는 여름 동안 자연광 아래에서 식물을 성장시킵니다. 하루에 두 번 5 분 동안 자동 스프레이 시스템으로 모든 식물에 물을줍니다.

일주일에 한 번 식물에 성장 조건을 적용하십시오. 매주 간격으로 잎을 마리 줄기에 모으십시오. DNA 추출을 위해 6개의 잎을 채취하고, 채취 후 RNA 추출을 위해 3개의 줄기가 필요하며, 식물 물질을 냉동 바이알에 넣고 액체 질소에 빠르게 동결한 다음 추출될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

세 가지 유전자형은 조건에 따라 다른 상대적 속도로 성장합니다. 통제 조건에서는 근친 아마 품종 폭풍 또는 PL 라인이 가장 잘 자랍니다. 이 부모로부터 여러 계통이 파생되었으며, 큰 품종 또는 L 품종이 작은 품종 또는 S 품종보다 더 활발합니다.

그러나 영양소가 부족한 경우 S는 L 또는 pl보다 잘 자랍니다. 그리고 높은 영양 조건에서 L은 PL보다 더 잘 자라며, 이는 S보다 약간 더 잘 자랍니다.세 가지 다른 처리에서 자란 각 라인을 비교하면 PL이 제어 조건에서 가장 잘 자란다는 것을 알 수 있습니다. L은 영양분이 높은 조건에서 가장 잘 자라고, S는 영양분이 높은 조건과 대조 조건 모두에서 비슷하게 자랍니다.

이러한 데이터는 세 가지 환경에서의 성장에 따라 세 가지 라인을 구별할 수 있음을 보여줍니다. PL과 L은 특정 환경에서 더 잘 자라지만 S는 세 가지 조건 모두에서 거의 동일하게 자랍니다. S는 개선된 영양 조건을 활용할 수 없지만 매우 낮은 영양 조건에서 더 잘 자랄 수 있습니다.

DNA 추출을 위해 Qiagen, DNEZ 공장, DNA 준비 키트의 완충액을 마이크로 fuge 튜브에 멸균 모래가 있는 6개의 잎에 추가하고 덩어리가 보이지 않을 때까지 마이크로 유봉으로 조직을 분쇄합니다. RNA 추출 전달을 시작하도록 지시된 키트 지침에 따라 추출을 계속하고, 3개의 마리스 줄기와 일부 주변 잎을 저장 극저온 바이알에서 마이크로 fuge 튜브로 이동합니다. 튜브에 멸균 모래를 넣고 미세하게 갈릴 때까지 마이크로 유봉을 사용하여 조직을 갈아줍니다.

용해를 원조하기 위하여 15 초 동안 표본을 와류로 치고십시오, 그 후에 13, 000 분당 회전수에 1 분 동안 모래와 어떤 파편든지 모으기 위하여 회전시키십시오. 스핀 컬럼에 SNAT를 추가하고 제조업체의 지침에 따라 RNA 준비를 계속합니다. 조직에서 RNA가 추출되면 RNA 샘플 부피의 1/10에 있는 10개의 XDNA 버퍼를 반응으로 전달합니다.

그리고 30 단위의 Dns에서 30 분 동안 섭씨 37 도에서 반응을 배양 한 다음 5 분 동안 섭씨 70 도에서 반응을 배양합니다. 적용된 biosystems RNA to CD NA 키트를 사용하여 역전사를 수행합니다. 제조업체 및 S 지침에 따라 섭씨 37도에서 1시간 동안 반응을 배양한 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다.

마지막으로, 1.5%AROS 겔에 5마이크로리터의 CDNA를 실행하여 수율을 측정합니다. 아마 CD NA가 준비되면 QPCR에 사용됩니다. BI Step one 시스템을 사용하여 QPCR을 수행합니다.

각 실행에 대해 모든 분석을 3회씩 수행하고, 하우스키핑 Gene Acton을 복제 수 대조군으로 사용하여 QPCR에 대한 반응을 준비합니다. 각 튜브에 적절한 프라이머 쌍 1마이크로리터를 추가합니다. CD NA를 적절한 농도로 희석하고 각 튜브에 9마이크로리터를 첨가합니다.

마지막으로, 각 튜브에 2개의 x cyberg green PCR 마스터 믹스 10마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 증폭 후 증폭 프로그램을 설정합니다. 임계값에 대한 사이클 수에서 상대적 발현 수준을 계산하며, 이는 1단계 소프트웨어의 기본 매개변수에 의해 결정되고 증폭 곡선 검사에 의해 확인됩니다.

줄기를 따라 다양한 위치에 있는 잎에서 분리된 DNA로부터의 PCR 증폭은 식물이 유도 조건에서 자랄 때 단일 사본 5.7 킬로베이스, 라인 삽입 서열이라고 하는 DNA 단편 또는 LIS 1의 출현을 보여줍니다. LIS 1은 PL이 영양분이 적은 조건에서 성장할 때 나타나며 결국 동형접합적이 됩니다. 여기. 잎 샘플 1에서 6은 매주 간격으로 분리되었으며, 샘플 1은 꿰매기 후 가장 빠른 샘플에서 DNA를 추출했습니다.

PCR 증폭은 첫 번째 샘플을 제외한 모든 샘플에서 LAS 1의 두 말단의 존재를 나타냅니다. 이것은 unins 삽입 부위가 사라지고 다섯 번째 잎 QPCR에 의해 그 증거가 없는 것과 일치합니다. 결과는 유도와 관련된 LAS 하나 또는 다른 게놈 변화의 존재가 S 하나 바로 근처에 있는 유전자의 발현에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.

여기에 표시된 6개의 유전자는 모두 PL과 S에서 차등적으로 발현되며, 그 중 4개의 유전자는 LIS가 없는 pl에서 더 높은 발현을 가지고 있습니다. 반대로, 2는 LIS 1을 가진 S에서 더 높은 발현을 가지며, 우리는 방금 유도성 아마 라인을 성장시키는 방법을 보여주었습니다. 따라서 게놈은 성장 환경과 다음 세대의 성장 특성에 반응하여 변화합니다.

이 절차를 수행할 때 재현 가능한 변화 유도를 위해 성장 조건을 복제해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 여러분 중 많은 분들이 이 현상에 대해 회의적이라는 것을 알고 있습니다만, 이제 여러분 스스로 관찰 결과를 재현할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.