플렉스의 변경을 물려 전할 수있는 환경을 유도

이 절차의 전반적인 목적은 유전 가능한 게놈 변이를 유발하는 조건에서 유도성 아마(flax) 품종을 재배하는 방법을 입증하는 것입니다. 또한, 게놈 변화를 모니터링하고 이후 세대에서 유도된 식물의 성장을 다양한 환경 하에서 관찰합니다. 이를 달성하기 위해, 아마를 다양한 유도 조건에서 재배합니다.

그 다음, 다양한 환경에서 식물이 성장하는 동안 여러 시점에서 잎과 Maris 줄기 조직을 수집합니다. 이어서, 조직 샘플로부터 DNA와 RNA를 분리합니다. 절차의 마지막 단계는 DNA 샘플을 이용한 PCR과 분리된 RNA를 이용한 Q-R-T-P-C-R을 수행하여, 서로 다른 환경 조건에서의 성장에 따른 게놈 변화와 유전자 발현 변화를 확인하는 것입니다.

궁극적으로, 처리된 식물의 조직에서 분리한 핵산을 사용하여 수행한 PCR 및 R-T-P-C-R 시각화를 통해, 게놈의 특정 지점에 LIS one 삽입 요소가 나타남으로써 확인되는 성장 조건에 대한 게놈 반응과 해당 요소의 존재와 관련된 발현 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Case Western Reserve University 생물학과  의 Chris Cull입니다. 저는 Cull Lab의 Cory Johnson입니다.

저는 Cull 연구소의 Tiffany Moss입니다. 그리고 저는 Cull 연구소의 학부생 여름 연구 프로그램에 참여하고 있는 학부생 Marshall Lucas입니다.

저희 실험실에서는 성장 환경의 변화로 인한 게놈 및 유전자 발현의 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 유도 조건에서 아마를 재배하려면, 먼저 5인치 화분에 흙을 채우고 단단하게 다지는 것부터 시작하십시오.

다음으로 화분당 아마씨 3알을 0.25인치 깊이로 심습니다. 그 다음 비유도 대조군 조건의 경우 씨앗 위에 흙을 덮습니다. 1/10 농도의 Miracle-Gro 용액 100 mL로 식물에 물을 줍니다.

고영양 조건의 식물에 100 milliliters의 원액 Miracle grow를 처리합니다. 마지막으로 도포하십시오.

저영양 식물에는 수돗물만 공급합니다. 여름철 식물이 성장하는 동안 자연광 아래에서 재배하십시오. 모든 식물에 자동 스프레이 시스템을 이용하여 하루 두 번, 5분 동안 물을 줍니다.

식물에 일주일에 한 번씩 성장 조건을 적용합니다. 매주 간격으로 잎과 마디 줄기를 수집합니다. DNA 추출을 위해 6장의 잎을 수집하고, RNA 추출을 위해 3개의 마디 줄기를 수집합니다. 수집 후, 식물 시료를 크라이오 바이알에 넣고 액체 질소로 빠르게 급속 냉동시킨 뒤, 추출 전까지 -80 °C에서 보관합니다.

세 가지 유전자형은 조건에 따라 서로 다른 상대적 성장 속도를 보입니다. 대조군 조건에서는 근친 교배된 아마 품종인 storm 또는 PL 라인이 가장 잘 성장합니다. 이 모본으로부터 여러 라인이 파생되었으며, 대형(L) 품종이 소형(S) 품종보다 더 왕성하게 성장합니다.

하지만 낮은 영양 상태에서는 S가 L이나 pl보다 더 잘 성장합니다. 그리고 높은 영양 상태에서는 L이 pl보다 더 잘 성장하며, pl은 S보다 아주 약간 더 잘 성장합니다. 세 가지 서로 다른 처리 조건에서 성장시킨 각 라인을 비교해 보면, PL은 대조군 조건에서 가장 잘 성장합니다. L은 높은 영양 상태에서 가장 잘 성장하며, S는 높은 영양 상태와 대조군 조건 모두에서 비슷하게 성장합니다.

이 데이터는 세 가지 계통이 세 가지 환경에서의 성장을 바탕으로 구별될 수 있음을 보여줍니다. PL과 L은 특정 환경에서 더 잘 성장하는 반면, S는 세 가지 조건 모두에서 거의 동일하게 성장합니다. S는 개선된 영양 조건의 이점을 활용하지 못하지만, 영양분이 매우 적은 조건에서 더 잘 성장할 수 있습니다.

DNA 추출을 위해 Qiagen DNEZ plant DNA prep kit의 buffer AP1을 멸균 모래가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브 내의 잎 6장에 첨가하고, 덩어리가 보이지 않을 때까지 마이크로 페스틀로 조직을 갈아줍니다. 키트의 지침에 따라 추출 과정을 계속 진행합니다. RNA 추출을 시작하려면, 보관용 크라이오 바이알에서 maris 줄기 3개와 주변 잎 일부를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브에 멸균 모래를 넣고 마이크로 페스틀을 사용하여 조직이 곱게 갈릴 때까지 갈아줍니다.

용해를 돕기 위해 샘플을 15초 동안 볼텍싱한 후, 13,000 RPM에서 1분간 원심분리하여 모래와 잔해물을 침전시킵니다. 스핀 컬럼에 SNAT를 첨가하고 제조사의 지침에 따라 RNA 준비 과정을 계속 진행합니다. 조직에서 RNA가 추출되면, RNA 샘플 부피의 1/10에 해당하는 10 XDNA buffer를 반응액에 옮깁니다.

DNase 30 units를 첨가하고, 반응물을 37 °C에서 30분간, 이어서 70 °C에서 5분간 배양합니다. Applied Biosystems RNA to cDNA 키트를 사용하여 역전사를 수행합니다. 제조사의 지침에 따라 반응물을 37 °C에서 1시간 동안, 그 후 95 °C에서 5분간 배양합니다.

마지막으로, 수율을 결정하기 위해 1.5% agarose 겔에서 cDNA 5 µL를 전기영동합니다. 아마(flax) cDNA가 준비되면, 이를 qPCR에 사용합니다. ABI StepOne 시스템을 사용하여 qPCR을 수행합니다.

각 회차당 모든 분석을 3회 반복하여 수행하고, housekeeping Gene Acton을 카피 수 대조군으로 사용하여 QPCR 반응액을 준비합니다. 각 튜브에 적절한 프라이머 쌍 1 µL를 추가합니다. CD NA를 적절한 농도로 희석하여 각 튜브에 9 µL를 추가합니다.

마지막으로, 각 튜브에 2x cyberg green PCR master mix 10 µL를 추가합니다. 다음으로, 증폭 조건에 따라 증폭 프로그램을 설정합니다. step one 소프트웨어의 기본 파라미터로 결정되고 증폭 곡선 확인을 통해 검증된 임계값(threshold)의 사이클 수로부터 상대적 발현 수준을 계산합니다.

줄기의 다양한 위치에서 채취한 잎으로부터 분리한 DNA의 PCR 증폭 결과, 유도 조건에서 식물을 재배했을 때 line insertion sequence 또는 LIS one이라 불리는 단일 사본의 5.7 kilobase DNA 단편이 나타남을 알 수 있습니다. LIS one은 PL을 저영양 유도 조건에서 재배할 때 나타나며, 결과적으로 동형접합체가 됩니다. 여기에서 잎 샘플 1번부터 6번까지는 파종 후 1번 샘플을 가장 빠르게 채취하여 매주 간격으로 분리하였으며, 이후 해당 샘플들로부터 DNA를 추출하였습니다.

PCR 증폭 결과, 첫 번째 샘플을 제외한 모든 샘플에서 LAS one의 양단말 모두가 존재하는 것으로 나타났습니다. 이는 unins 삽입 부위의 소실 및 다섯 번째 잎의 QPCR에서 해당 부위의 증거가 발견되지 않은 것과 일치합니다. 결과적으로 LAS one의 존재 또는 유도와 관련된 기타 게놈 변화가 LAS one 인근 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.

여기에 제시된 6개의 유전자는 모두 PL과 S에서 차등 발현되며, 그 중 4개의 유전자는 LIS 1이 없는 pl에서 더 높게 발현됩니다. 반대로, LIS 1이 있는 S에서는 2개의 유전자가 더 높게 발현됩니다. 지금까지 유도성 아마 라인을 배양하는 방법을 살펴보았습니다. 따라서 게놈은 성장 환경과 후속 세대의 성장 특성에 반응하여 변화합니다.

이 절차를 수행할 때, 변화를 재현성 있게 유도하기 위해서는 배양 조건이 동일하게 복제되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마쳤습니다. 여러분 중 많은 분이 이 현상에 대해 회의적이시겠지만, 이제 직접 관찰 결과를 재현해 보실 수 있을 것입니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.