여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

본 영상에서는 국소적 변화를 관찰하기 위해 반자동 프로그램을 사용하여 뉴라이트(neurites)라고 통칭되는 수지상돌기(dendrites)와 축삭(axons)의 형태를 분석하는 절차를 보여줍니다. 먼저, Neuron J 소프트웨어를 사용하여 뉴런의 8비트 TIFF 이미지를 추적하고 뉴라이트 분절의 위치를 식별합니다. 그런 다음, Neuron Studio 소프트웨어를 사용하여 뉴라이트 간의 연결성에 관한 구조적 정보를 정의합니다.

마지막으로 bonfire MATLAB 프로그램을 실행하여 shoaling 분석을 포함한 세포의 형태학적 데이터와 neurite 분지점 및 neurite 끝단의 수를 추출합니다. 분석 결과는 neurite arbor의 하위 영역에 대해 shoaling 분석을 수행함으로써 neurite 형태의 국소적 변화를 보여줍니다. 수동 shoaling 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프로그램이 반자동으로 작동한다는 점이며, 이는 분석 효율성을 크게 향상시키고 데이터 감사가 가능하게 하여 분석의 정확성을 검증할 수 있게 합니다.

시연은 여름 동안 Firestein 연구실에서 근무하는 Hirsch AWA 학부생이 진행합니다. Bonfire 프로그램을 사용하여 Neurite 8비트 tiff의 형태학적 특성을 분석하려면, 먼저 Bonfire 프로그램을 다운로드한 후 개별 뉴런의 이미지를 확보해야 합니다. 분석하고자 하는 이미지의 해상도에 따라 프로그램 설정을 조정해야 합니다. Bonfire 프로그램의 Bonfire parameters 부분에서 picks conversion 변수의 현재 값을 사용하려는 이미지의 해상도 값으로 변경하십시오.

bonfire가 데이터를 분석하기 위해서는 마스터 폴더, bonfire MATLAB M 파일이 포함된 bonfire 폴더, 각기 다른 조건을 포함하는 하위 폴더, 그리고 각 조건 폴더 내의 세포 이미지 파일이 포함된 특정 구조로 파일이 정리되어야 합니다. 우선 추적을 위한 이미지 준비부터 시작하십시오. 본 실험에서는 수지상 돌기 형태의 변화를 분석하기 위해 수지상 돌기만을 추적합니다. 추적을 위한 이미지 준비를 시작하십시오.

neuron J 툴바에서 open 버튼을 선택하여 이미지를 열고, 트레이싱하려는 이미지를 선택하십시오. 이제 maximize 버튼을 선택하여 이미지 크기를 조절하고, 모든 신경돌기(neurite)를 시각화할 수 있도록 이미지의 밝기와 대비를 조정하십시오. neuron J 툴바에서 image를 선택한 다음, adjust brightness contrast를 선택하십시오. 트레이싱을 시작하려면 neuron J 툴바에서 add traces 버튼을 선택하십시오. 세포체의 외곽선을 따라 트레이싱하십시오.

그 다음 neuron J 툴바에서 label tracings 버튼을 선택하고 tracing ID 드롭다운 메뉴에서 N one을 선택한 후, neuron J attributes 창에서 type zero six를 선택하고 Okay를 누릅니다. 뉴라이트 추적을 시작하려면 neuron J 툴바에서 add traces 버튼을 선택하고 관심 있는 각 뉴라이트 분지를 따라 트레이스를 추가합니다. 그리는 세그먼트가 각 분지점에서 멈추게 하고, 각 자식 분지점부터 새로운 트레이스로 시작하는 것이 가장 좋습니다.

Neuron J 툴바에서 save tracings 버튼을 선택하고, 방금 생성한 트레이싱을 원본 이미지 파일과 동일한 폴더에 저장하십시오. 다음으로, Neuron J에서 트레이스 파일과 트레이스 식별자 파일을 내보냅니다. Neuron J 툴바에서 export trace 버튼을 선택하십시오. 이제 Neuron J 내보내기 대화 상자에서 tab delimited text files separate file for each tracings 옵션을 선택하고 okay를 클릭하여 Neuron J가 파일 이름과 저장 위치를 지정하도록 하십시오.

Neuron J 툴바에서 measure tracings 버튼을 선택한 다음, Neuron J measurements 창에서 display tracings measurements 옵션을 선택하고 run을 누르십시오. Neuron J tracings 창에서 Select file을 선택한 후, save as를 선택하여 파일을 저장하십시오. 파일 이름은 원본 이미지 파일 이름과 정확히 일치해야 하며, 뒤에 _info를 붙여야 하고 3글자의 파일 확장자가 포함되어서는 안 됩니다. 컴퓨터가 자동으로 .XLS 파일 확장자를 추가하지 않는지 확인하십시오.

만약 그렇다면, 파일 확장자를 수동으로 삭제해야 합니다. 먼저, MATLAB을 실행하고 명령 창 우측 상단의 점 세 개 버튼을 클릭하여 bonfire load를 통해 폴더를 재구성하십시오. 폴더 찾아보기 창에서 마스터 폴더 내의 bonfire 폴더를 선택한 다음, 명령 창에 bonfire load를 입력하고 Enter 키를 누르십시오.

폴더 찾아보기 창에서 분석하려는 조건 폴더를 선택하고 확인을 누르십시오. 이렇게 하면 각 개별 세포의 모든 데이터를 포함하는 세포 하위 폴더가 생성되어 폴더 구조가 재구성됩니다. 이제 file name_premium.swc 파일을 생성하려면 명령 창에 bonfire_NDF2swc를 입력하고 엔터를 누르십시오.

폴더 찾아보기 창에서 bonfire load를 통해 방금 재구성한 것과 동일한 조건 폴더를 선택하고 확인을 누릅니다. 이렇게 하면 선택한 조건의 각 셀 폴더에 WC 파일이 생성됩니다. 각 셀 폴더에는 5개의 파일이 포함됩니다.

원본 TIF 이미지, NDF 파일, 언더스코어 정보, 트레이스 식별자 파일, TXT 파일 및 swc 파일입니다. Neuron Studio를 사용하기 전에 프로그램의 기능과 단축키를 익히는 것을 권장합니다. 훌륭한 온라인 사용자 매뉴얼이 제공되며, 키보드 단축키를 숙지하면 많은 시간을 절약할 수 있습니다.

먼저 Neuron Studio 프로그램을 실행하고 Neuron Studio 툴바에서 'File' > 'Open'을 선택하여 편집하려는 뉴런의 TIF 이미지를 찾아 엽니다. 'Run settings'를 선택하고 세 개의 입력란에 각각 1을 입력합니다.

복셀 크기(voxel size) 창에서 파일 가져오기 s wc를 선택하십시오. 작업하려는 파일과 일치하는 적절한 s WC 파일을 선택하십시오. 이제 이미지 파일 위에 트레이스 이미지가 겹쳐서 표시됩니다.

세포체(cell soma)에는 뉴라이트를 연결하기 위한 빨간색 원이 겹쳐져 있어야 합니다. 뉴라이트 도구를 사용하여 노드를 연결함으로써, 노란색 노드로 표시된 각 분기점에서 두 개의 분기만 생성되도록 하십시오. 모든 추적선은 세포체와 연속적으로 연결되어야 합니다.

이제 Neuron Studio에서 데이터를 내보내려면, 파일(file)을 선택하고 뉴라이트 저장(save neurites)을 클릭한 뒤 기본 이름으로 저장하여 swc 파일의 오류를 확인하십시오. bonfire trace 유형을 명령 창에 입력하고 엔터를 누릅니다. 폴더 찾아보기(browse for folder) 창에서 방금 처리한 데이터가 포함된 조건 폴더를 선택하고 확인을 누르면, 폴더 내 이미지에 오류가 있는지 확인합니다.

프로그램은 dot S WC 파일에서 형태학적 데이터를 추출할 때 오류가 발생한 위치를 표시하는 이미지를 출력합니다. 명령 창에 bonfire를 입력하고 엔터를 누르십시오. 폴더 찾아보기 창에서 분석하려는 조건 폴더를 선택하고, 관심 있는 각 뉴런에 대해 확인을 선택하십시오.

bonfire 분석을 수행하면 뉴런 형태의 그래프와 분석에 사용된 숄더 링(shoulder rings)이 생성됩니다. 또한, bonfire 명령어를 통해 분석에서 추출된 모든 형태학적 정보가 포함된 MAT 파일이 생성됩니다. 데이터 유형의 예비 그래프를 확인하려면 MATLAB 명령 창에 bonfire 결과를 입력한 후, '폴더 찾아보기' 창에서 확인하려는 조건의 조건 폴더를 선택하고 확인을 누르십시오.

폴더 찾아보기 창이 일시적으로 닫혔다가 다시 열리며 추가 조건을 선택할 수 있게 됩니다. 조건 선택이 완료되면 취소를 선택하여 선택 과정을 종료하십시오. Bonfire 결과에 선택한 조건 폴더의 데이터가 포함된 요약 차트가 표시되며, 형태학적 데이터를 Excel 형식으로 내보내려면 bonfire Export를 MATLAB 명령 창에 입력하십시오.

폴더 찾아보기 창에서 내보내려는 데이터가 포함된 조건 폴더를 선택하고 확인을 누르십시오. Bonfire export가 형태학적 데이터의 Excel 파일을 생성하여 선택한 조건 폴더에 저장합니다. 이제 두 가지 조건이 포함된 데이터 세트를 통해 Bonfire 프로그램에서 생성된 데이터의 예시를 보여드리겠습니다.

두 조건에 대한 반전 이미지 예시입니다. 이 이미지들을 통해 조건 1이 조건 2보다 더 많은 수지상돌기를 포함하고 있음을 알 수 있습니다. 이러한 현상은 bonfire 프로그램으로 생성된 다양한 그래프에서도 관찰할 수 있습니다.

bonfire 프로그램은 수상돌기의 하위 영역에 대해 분석을 수행하므로, 조건 1에서 증가한 수상돌기를 쉽게 식별할 수 있습니다. 전체 수상돌기 수형의 shoal 곡선을 플로팅하면, 조건 1 뉴런의 경우 세포체에서 먼 쪽에 더 많은 수상돌기가 있음을 알 수 있습니다. 세포당 평균 분지점(branch point) 및 말단점(terminal point)의 수를 플로팅하면, 조건 1이 조건 2보다 분지점과 말단점 모두 더 많음을 보여줍니다. 1차, 2차, 3차 또는 그 이상의 고차 수상돌기에 대한 세포당 평균 돌기 수가 표시되어 있습니다. 조건 1에서 3차 및 고차 수상돌기가 더 많이 나타납니다. 근위(root), 중간(intermediate) 및 말단(terminal) 수상돌기에 대한 세포당 평균 돌기 수를 플로팅하면, 조건 1이 조건 2보다 중간 또는 말단 돌기가 더 많음을 알 수 있습니다.

여기에 세그먼트를 1차, 2차, 또는 3차 이상으로 그룹화한 세그먼트 정체성 특이적 shoal 분석 곡선이 제시되어 있습니다. 조건 1 뉴런의 경우, 3차 수지상돌기의 증가는 세포체에서 먼 쪽에서 발생합니다. 세그먼트를 루트 세그먼트, 중간 세그먼트 또는 말단 세그먼트로 그룹화한 세그먼트 정체성 특이적 shoal 분석 곡선이 제시되어 있습니다.

조건 1에서 중간 및 말단 수상돌기의 증가는 세포체에서 먼 쪽에서 발생합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 신경 형태학의 국소적 변화를 관찰하기 위해 bonfire 프로그램을 사용하여 shoal 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.