Name: 진동 프로브와 함께 생체 전류의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 진동 프로브를 이용한 생체 전류 비침습 측정 기법으로 생물학적 시스템의 전기적 특성을 연구하는 방법을 익히세요. 이 기술은 높은 감도와 신호 대 잡음비로 상처 치유 및 세포 행동 연구에 활용됩니다.

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우리는 교수 리차드 Borgens, 진동 프로브 시스템을 조립에 대한 도움을 마비 연구, 퍼듀 대학을위한 센터에 감사하고 있습니다. 본 연구는 MZ와 BR에 네이 부여 NIH 1R01EY019101 지원하고, 재생 의료 RB1 - 01417의 캘리포니아 공과 대학, NSF MCB - 0951199에서 보조금으로하고 실명, UC 데이비스 안과를 방지하기 위해 연구에서 무제한 부여하여 일부 인치되었습니다

1. 프로브 제조 빈 프로브는 (아래에있는 '특정 시약 및 장비의 표'참조) (elgiloy / 스테인레스 parylene - 코팅 microelectrodes) 세계 정밀 계측기에서 구입한 있습니다. 프로브 팁 뒤에 25-30mm 잘라 컷 끝에 parylene 절연 약 5mm 좋은 연결을 보장하기 위해 메스 (# 11 블레이드)와 함께 거리에 스크랩한 것입니다. 프로브 전기 - 전도성 실버로드 에폭시 (예 : 라이트 - 록 SL65) [* 아래 참고 참조]를 사용하여 골드 R30 커넥터에 장착합니다. 프로브 강화에 에폭시 수 있도록 실온에서 하룻밤 저장됩니다. 다음, 프로브 팁는 나노 암페어 전원 공급 장치를 사용하여, 금 그리고 백금 도금입니다. 프로브 팁은 ​​아세톤으로 씻어서 나노 암페어 전원의 부정적인 출력에 연결되어 있습니다. 프로브 팁은 해부 현미경 (x40)에서 조회 및 골드 도금 용액 (칼륨 dicyanoaurate (0.2 % 증류수에 W / V 카우 (CN) 2 (DH 2 O).) 긍정에 연결된 참조 선에 처음으로 배치됩니다 출력 및 솔루션의 배치는 회로를 완료합니다. 5 전류가 없음이 끝이 약 절반 원하는 최종 크기 (10-15에 대한 μm의)까지 다음 20 나 증가 5 분에 대한 적용됩니다. 프로브 팁는 DH에 씻어서입니다 다음 2 O와 platinizing 솔루션 (chloroplatinic 산성 하이드 레이트, 1퍼센트 W / V H2PtCl6 * 6H 2 O)에 배치 플러스 리드 (II) 아세테이트 trihydrate (0.1 % DH 2 W / V PB (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O O). 250 전류가 나는 팁 원하는 최종 크기의 80 %까지 500 나 증가 후, 5 분 적용됩니다. 현재이 1 μA로 증가하고 최종 팁 직경 때까지 1 초 파열에 적용됩니다 (30-35 μm의 정도) 얻습니다. 마지막으로, 팁은 DH 2 O. 프로브에 씻어서 것은 무한정 상온에서 저장할 수 있습니다. 프로브가 손상된 경우, 금을 R30 커넥터를 다시 사용할 수 있습니다. [*주의 : 일부 프로브 시스템은 신호를 운반하기 위해 앰프에 직접 연결 장착 프로브 있습니다. 다른 시스템은 별도의 마운트 지점 및 신호 커넥터가 있습니다. 후자의 경우에는 한쪽 끝에 R30 커넥터와 짧은 (2-3 ㎝) 와이어는 (그림 2A 참조) 프로브를 장착하기 전에 첫 번째 R30 커넥터에 납땜합니다.] 2. 프로브 시스템 프로브가 3 차원 마이크로 포지셔너 (그림 1)에 장착된 압전 벤더에 첨부되어 있습니다. 프로브 진동도 진동 진폭과 주파수의 조정을 허용하는 진동 프로브 전원 공급 장치에 의해 제어됩니다. 프로브 전원 공급 장치에 대한 참조 신호를 보내는 잠금 기능 또한 진동 주파수와 위상 각도를 표시 증폭기. 그것은 또한 하나 프로브 진동의 빠른 시각적 참조를 가지고 있으므로 오실로 스코프를 연결하는 데 유용합니다. 프로브의 신호는 잠금 기능을 앰프로 이동합니다. 측정하는 프로브와 샘플 광섬유 조명과 해부 현미경 (x40로 확대 X6)을 함께 볼 수 있습니다. 교정과 샘플 측정하는 동안, 참조 및 접지 (지구) 와이어 (그림 2B 참조) 솔루션에 있어야합니다. 증폭기는 아날로그 - 디지털 (I / O) 인터페이스를 통해 컴퓨터에 연결되어 있습니다. 데이터는 스트래스 클라이드 전기 생리학 소프트웨어의 전체 셀 프로그램 (WinWCP)를 사용하여 기록됩니다. 록 인 앰프 설정 : 감도 [200 μV], 동적 해상도 [정상], 오프셋 [켜기], 확장 [X1], 시정수 : 사전 [10 S], 포스트 [0.1 S]. 빠른 응답이 필요한 경우 일정한 사전에 시간은 3 s의 줄일 수 있습니다 오프셋 컨트롤은 화면의 중심을 가까이 탐사 추적을 가지고하는 데 사용됩니다. 큰 반응이 예상되는 경우, 추적은 최대 이동 또는 아래로 수 있습니다. WCP 소프트웨어 설정 : 녹화 기간 [204.8 S], 채널당 샘플 [1024], 샘플링 간격 [0.2 S], 전압 범위 [+ / - 0.2 V]. 큰 전류가 예상하는 경우 전압 범위는 1 V 또는 5로 증가 수 있습니다 V. 3. 프로브 설정 새로운 프로브는 테스트를해야하고 독특한 주파수 및 위상 각도가 결정됩니다. 새로운 프로브는 생리 식염수 (그림 2B)이있는 보정 챔버에 배치됩니다. 전원 공급 장치가 켜져 있고 최대 진동이 관찰 때까지 주파수가 켜집니다. 이것은 프로브의 공진 주파수이다. 이 주파수에서 프로브를 사용하면 불안정의 원인과 녹음의 소음을 생산할 수, 프로브는 프로브의 작동 주파수 (일반적으로 150-200 Hz에서)을 제공하는 10 Hz에서을 빼서하여 '드 조정'하는 것입니다. 진동 진폭은 프로브 진동 거리 (그림 2B 참조) 프로브는 프로브 팁의 '이중 이미지'를 진동 때 볼 수있다 있도록 팁 직경과 동일하도록 조정됩니다. 위상 각도를 확인하려면 프로브 보정 챔버의 호수에 위치하고 μA / cm 2 반복 적용 1.5 현재입니다. 응답이 없을 때까지 단계 각도는 앰프 -에 자물쇠가 조정됩니다. 이것을 90 °를 추가하거나 빼는각도가 최대 응답을 제공,이 각도는 프로브의 작업 단계 각도입니다. 각 프로브에 대한 주파수 및 위상 각도는 나중에 사용하기 위해 설명되어 있습니다. 이 프로브의 응답을 변경하므로 실험을 진행하는 동안, 주파수, 진폭 및 위상 각도의 설정이 변경되지 않은 것이 중요합니다. 편의를 위해, 현재는 '사우스 - 투 - 노스'흐르는 경우,이 기록 추적에 상향 편향을 ( '최대'여기 칭했다) 생산해야하며, 현재 흐르는 '노스 - 투 - 사우스'는 (아래 편향을 표시해야 ) 그림 3a를 참조하십시오. 이것은 잘못된 방법이다면, 위상 각도 180 °를 추가하면 응답 내내 틀지하여 문제를 해결합니다. probe 함수 뒤에 이론, 교정 등에 대한 자세한 내용은 리드 외. 1을 참조 보정 : 정확히 1.5 교정 실의 프로브에 적용 μA / cm 2의 '표준'현재에 대한 프로브의 반응은, (그림 2B, 3A 참조) 시료의 전류를 계산하는 데 사용됩니다. 이전 샘플 측정하는 프로브가 적절한 솔루션, 예를 들어 BSS + 각막에 대한 인공 테어 솔루션에 교정됩니다. 남북 및 남북, 상향과 하향 편향을 제작, 각각 바깥쪽과 안쪽 전류에 상응, 샘플의 방향에 따라 : 현재는 두 방향으로 적용됩니다. 프로브 추적은 안정적인 기준과 낮은 소음을 (무화과를 비교할 수 있습니다. 3A 및 3B)이 있어야합니다. 프로브가 증발로 인해 osmolality 변경을 보정하는 데 사용되는 솔루션의 실험 끝에 보정합니다. 데이터를 분석하는 경우, 실험의 전반에서 측정이 최종 교정을 사용하여 계산 후반부터 시작 보정 값, 및 측정을 사용하여 계산하실 수 있습니다. 샘플 측정 : 챔버는 샘플을 잡고 고정하도록 설계해야 할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 3C는 각막 측정 눈을 잡아 와이어 루프와 페트리 접시를 보여줍니다. 생리 식염수가 들어있는 음식은 해부 현미경과 전망 분야의 초점 위치 샘플에 대한 관심의 영역에서 배치됩니다. 그것이 측정되는 샘플에있는 지점으로 동일한 수준에 있도록 프로브 솔루션과 집중도 샘플 표면 및 지향 병렬로 배치됩니다. 떨어진 샘플에서 (예 : 1-2cm) 편리한로 탐사가 가능한 멀리 이동, 진동이 안정 (가로) 기준을합니다 (그림 4A 참조) 설립 (및 레코드로 설정된 컴퓨터 소프트웨어)을 설정. 프로브는 다음의 표면에서 약 50 μm의 정도 측정 위치로 이동합니다. 새로운 ( '최대') 값이 안정되면, 프로브는 참조 위치로 다시 이동하고 추적 기준으로 반환합니다. 이것은 timelapse 데이터를 생성하는 일반적인 시간 지점에서 반복하거나 예제 (그림 4B를 참조 5B) 이동 / 약간 회전 및 공간적 현재 매핑 데이터를 얻을 다른 위치에서 반복 수 있습니다. 데이터 분석 : 데이터가 WinWCP를 (그림 5A 참조)를 사용하여 분석하고 있습니다. 그 전에 측정 정상에 추적 기준에 평행하므로 수평 빨간색 '제로'라인은 최대 이동 또는 아래로이다. 수직 측정 녹색 라인은 추적 기준으로 전체 이동합니다. 녹색 라인의 하단에 녹색으로 읽기 출력은 가까운 제로 (예 : 0.00012)로해야합니다. 이 숫자는 빨간색과 초록색 라인이 교차 지점, 그리고 블루 트레이스 사이 differnce를 보여줍니다. 그것은 최고의 상단과 평행 때까지 빨간색 선은 그 다음까지 이동합니다. 녹색 출력 신호 뮤직 비디오에서 피크의 크기입니다. 모든 측정 봉우리, 그리고 교정 데이터에 대한 데이터는 Microsoft Excel 스프레드 시트 템플릿 (표 1 참조)에 넣어 수 있습니다. 같은 날짜, 프로브 번호, 전압 범위 (VR) 솔루션은 사용 위치를 측정, 시간 포인트 등의 관련 정보는 스프레드 시트에 넣어 수 있습니다. 현재 방향 (샘플의 내부 또는 외부로 : 'I / O가') 지적이며, 내면 해류도 '정상'항목에서 부정적인 가치를 부여하고 있습니다. 1.5 교정에서 μA / cm 2 적용의 현재입니다 현재 = 피크 * (1.5/calibration) : 오른쪽 열에 현재는 공식을 사용하여 계산됩니다. 따라서 'unw1'= 12.45 * (1.5/56.12) = 0.33276907 μA / cm 2. 4. 성공의 비밀 모든 전기 생리학에서와 마찬가지로, 핵심 장비의 적절한 접지 (접지)는 노이즈를 제거하는 데 도움이됩니다. 따라서, 적어도 마이크로 포지셔너 및 현미경의 섀시는 earthed해야하고, 어쩌면 또한 광원 (그림 1 참조). 사용자는 정전기의 원천이 될 수 있도록 손목 밴드를 통해 접지 어떤 경우에 프로브의 불안정을 예방할 수 있지만, 항상 필요는 없습니다. 잠금 기능을 분리 주파수에서 주파수 (예 : 60HZ 전원 그리드에서) 밖으로 증폭기 필터 탐사선이에 진동이므로 패러데이 케이지는 필요하지 않습니다. 진동 절연 테이블은 유용하지만 필수되지 않습니다. 고체, 안정 벤치 또는 테이블처럼 잘 작동합니다. 이외 기본에서Excel 스프레드 시트의 정보 (위 참조) 사진은 현미경을 촬영하는 경우에는 하나 실험실 - 책 같은 온도의 변화, 마약 추가 등 추가적인 유용한 정보를 기록하는 데 유용 그것은, 배율을 기록해 둡니다. 관련있다면, 그것은 (그림 6 참조) 위치 및 / 또는 프로브 측정의 방향을 보여주는 샘플 (S)의 몽타주를 그리는 것도 유용합니다. 도전 단계 <ol class="lalpha"><li> 프로브는 만들기 : 프로브와 R30 커넥터 사이 좋은 전기 연결이 있어야합니다. 아무것도 전기 도금 단계에서 발생하지 않으면, 다음이 아마도 원인입니다. </li><li> 보정 : 당신이 측정됩니다 시료에 적절한 살린이나 배지를 사용합니다. 이상 또는이 응답을 변경할 수 있으므로 교정 챔버를 아래 - 기입하지 마십시오. 액체의 표면은 챔버의 상단에 평평해야합니다. </li><li> 샘플 측정 : 계획 사전은, 예를 들어 당신은 (그림 3C 참조) 샘플 / 보유 마운트 특별한 챔버를해야하는 이유는 무엇입니까? 샘플에서 측정하면 탐침은 진동 탐침의 방향 (때문에 전류가 측정되는 방향)이 샘플 표면 (예를 들어 수직되도록, 샘플 표면에 긴 축 병렬로 지향되어야, 그림 4B를 참조하십시오 ). 샘플 및 / 또는 다른 위치에서 측정 회전 이동할 수 있습니다. 측정 때 프로브와 샘플 표면 사이의 일관성있는 거리를 유지하는 것이 중요합니다. 측정 전류는 샘플 표면의 거리에 비례하며 탐사선은 샘플 표면의 반전 광장 법률에 의해 현재 방울 떨어져 움직이면서. 샘플 표면에 생성되는 전류를 측정하면 그것은, 감지 전류는 표면에서 거리의 제곱에 반비례합니다. 접안 렌즈의 경위 선망는 프로브와 시료 표면 사이의 거리를 판단하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 문제 해결 <ul><li> 문제 : 교정에서 반응이 없어요. 해결 방법 : 체크 살린 두 전극을 접촉합니다. 정전류 캘리 브 레이터의 배터리를 확인하십시오. </li><li> 문제 : 작은 응답. 해결 방법 : DH 2 O 및 / 또는 아세톤에 깨끗한 프로브. 위상 각도를 확인합니다. </li><li> 문제 : 소음 또는 불안 정한 기준선 (그림 3B 참조). 솔루션 : 확인 접지 와이어. </li><li> 문제 : 추적 화면에서 뛰어내리는. 솔루션 : 프로브 팁이 샘플을 터치하는 것을 허용하지 않습니다. </li></ul> 5. 대표 결과 그림 3A는 교정 추적의 좋은 예를 보여줍니다. 안정 (가로) 기준, 낮은 소음과 큰 응답을합니다. 비교로서, 그림 3B는 불안 정한 기준과 시끄러운 흔적을 보여줍니다. 마우스 각막 상처에 다른 위치에서 전류 측정은 그림 4B에 표시됩니다. 상단 패널의 프로브 위치를 보여주는 가운데 패널은 컴퓨터에 기록된 프로브 흔적을 보여줍니다과 하단 패널은 현재 상처의 프로필을 보여주는 서로 다른 위치에있는 전류의 그래프입니다. 그림 5B 상처 현재 시간 코스에 대한 데이터를 생성하기 위해 정기적인 시간 간격으로 만든 마우스 피부 상처에 측정을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 프로브 시스템을 진동. 자세한 설명은 텍스트를 참조하십시오. 블루 텍스트는 연결 전선의 기능을 설명합니다. 그린 기호는 접지 지점을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. A. 프로브가 장착. 프로브 전에 electroporating로 실버로드 에폭시와 황금 R30 커넥터에 붙어있다. 일부 시스템에서 신호를 운반하는 짧은 철사로 두 번째 커넥터에 납땜합니다. 스케일 바 3mm. 플래티넘 공을 확장할 수 없습니다. B. 프로브 교정. 정전류 캘리 브 레이터가 (왼쪽) 1.5 보정 챔버의 프로브에 μA / cm 2 (오른쪽)의 전류를 적용합니다. 왼쪽 하단 : 프로브의 클로즈업. 팁의 이중 이미지를 볼 수 있습니다 그래서 프로브가 진동하면 (오른쪽 아래), 진폭이 조정됩니다. 스케일 바 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. A. 프로브 교정 추적. 안정 기준, 낮은 소음과 대형 응답 좋은 프로브 교정 추적의 예. 현재 흐르는 사우스 - 투 - 노스 상향 편향을 제공하고, 노스 - 투 - 사우스을 흐르는 전류는 아래로 편향을 생산하고 있습니다. 불안정, 시끄러운 프로브 추적 B.. C. 챔버 장착 마우스 (왼쪽) 또는 쥐 (오른쪽) 각막 측정 눈을했다. 5mm 스케일 바. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 측정 사례를 증명. A. 안정 기준은 예제 1-2 참조 위치에 프로브로 설정됩니다. 탐사선은 샘플 근처 측정 위치로 이동되면, 그것은을 감지현재 및 추적 (바깥쪽 현재) 이상 굴절. 마우스 각막에 걸쳐 서로 다른 위치에 B. 측정합니다. 프로브가 표면에 평행 지향이며, 진동이 직각되도록. 업워드 봉우리는 외부 전류를 보여줍니다. 최대 전류는 상처 가장자리에서 볼 (위치 ​​B &amp; F).입니다 프로브의 개략도는 위치 F (오른쪽 상처 가장자리)를 측정에 표시됩니다. 스케일 바 300 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. A. 프로브 흔적을 분석. 어퍼 패널 : 녹색으로 출력 읽기가 영 (0.00012)에 가까운 따라서는 추적 기준과 병행되도록 붉은 제로 라인 위로 이동 또는 아래는 다음 녹색 측정 라인이 기준을 통해 이동합니다. 하단 패널 : 빨간색 선은 그 다음은 추적 피크의 상단과 평행하게 될 때까지 최대 이동 및 출력 읽기가 뮤직 비디오에서 피크 (12.45)의 크기를 사용하실 수 있습니다. 현재는이 (표 1 참조) 보정 데이터를 사용하여 계산됩니다. B. 마우스 피부가 timelapse 데이터를 상처. 입힐 수있는 총알 이전에 현재 시간이 제로 (적색 기호)에 표시됩니다. 성능은 입힐 수있는 총알 후 정기적으로 timepoints에서 마우스 피부 상처에서 같은 위치에 있었다. 초기 과도 내향 전류 (아래 제로), 현재는 반대하고 바깥쪽으로 조류는 (긍정적인) 천천히 장미와 plateaued 후. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 위치를 측정 프로브를 보여주는 실험실 - 도서 스케치. A. 랫 두뇌, 붉은 점들은 위치와 프로브 기호를 측정 표시는 프로브 방향을 표시합니다. B. 랫 각막 상처, 붉은 점들은 측정 위치를 표시하고 화살표는 전류 측정 방향을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 프로브 데이터를 저장하고 quantifying을위한 Excel 스프레드 시트의 예. pN2_cal1 = 시작 교정, 칼 +와 칼 - = 뮤직 비디오의 교정 값, VR = 전압 범위, 최대 뮤직 비디오에서 = 샘플 측정, 현재의 I / O = 흐름 (샘플의 내부 또는 외부로).

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 저렴한 비용으로, 기초하지만, 생물 학적 시스템의 다양한 비 invasively 전류를 측정하는 매우 민감한 진동 프로브 시스템을 설명합니다. 가능한 수정 <ol><li> 백금 / 이리듐 전극 (세계 정밀 계측기, 고양이 # PTM23B20)이 경우에는 대신 스테인리스 스틸을 사용 후, 골드 도금 무대 제거하실 수 있습니다. </li></ol> 애플 리케이션 우리의 전류를 측정하는 진동 프로브를 사용했습니다 : 쥐의 각막 2, 쥐 렌즈 3,4, 마우스 피부에 5; Xenopus 올챙이 6, 인간의 피부 7, 인간의 각막 8, Zebrafish 배아 1; Dictyostelium 1; 쥐의 뇌 1.</...

<table><tbody><tr><td>Eligoy-스테인리스 전극</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SSM33A70</td><td>76 mm, 7 M&amp;#937;, 1-2&amp;#x03BC;m 팁</td></tr><tr><td>Gold R30 커넥터</td><td>www.vectorelect.com</td><td>R30</td><td>재사용 가능</td></tr><tr><td>은 함유 에폭시</td><td>3M</td><td>SL65</td><td>수지 1부와 경화제 1부를 혼합</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ40</td><td>배율 x6 ~ x40</td></tr><tr><td>디시아노금산 칼륨 (KAu(CN)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379867</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>염화백금산 수화물 (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PtCl&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; x 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520896</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>초산납 삼수화물 (Pb(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185191</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>나노암페어 전원 공급 장치</td><td>자체 제작</td><td>-</td><td>1.5 V (AAA) 배터리 6개로 구동</td></tr><tr><td>3차원 마이크로 포지셔너</td><td>Line Tool Co.</td><td>Model H</td><td></td></tr><tr><td>락인 증폭기</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>디지털 I/O 인터페이스</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6220</td><td></td></tr><tr><td>BNC 연결 포함 차폐 커넥터 블록</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Strathclyde 전기생리학 소프트웨어</td><td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td><td>WinWCP V4.1.5</td><td>다음에서 무료 다운로드: &lt;a href=&quot;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>교정 챔버</td><td>자체 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정전류 교정기</td><td>Vibrating Probe Company</td><td></td><td>9 V (PP3) 배터리 1개로 구동</td></tr></tbody></table>

진동 프로브와 함께 생체 전류의 측정

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

이온의 적극적인 교통 수단에 의해 생성된 전기 분야는, 많은 생물 학적 시스템에 존재하고 종종 조직과 장기에 중요한 기능을 제공하고 있습니다. 예를 들면, 그들은 상처 치료하는 동안 셀 마이 그 레이션을 감독하는 데 중요한 역할을한다. 여기 세포외 전기 전류를 측정 ultrasensitive 진동 프로브의 제조 및 사용에 대해 설명합니다. 탐사선은 생리 식염수에 μA / cm 2 범위에서 이온 전류를 감지할 수있는 작은 플래티넘 - 블랙 팁 (30-35 μm의)와 절연, 날카롭게 금속 와이어입니다. 프로브는 압전 벤더에 의해 약 200 Hz에서에서 진동이다. 이온 전류의 존재에서, 프로브는 운동의 극단 사이의 전압 차이를 감지합니다. 잠금 기능을 진동의 프로브의 주파수에 잠금하여 외부 노이즈 앰프 아웃 필터. 데이터는 컴퓨터에 기록됩니다. 프로브가 정확히 1.5 μA / cm 2의 전류를 적용 챔버를 사용하여 적절한 생리 실험의 시작과 끝에 보정합니다. 우리는 프로브를 만들어 시스템을 설정하고 조정하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 각막 측정의 기술을 설명하고, 다른 표본 (각막, 피부, 뇌)에서 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다.

다양한 생물 학적 시스템에 생체 전류를 측정하는 비침습 진동 프로브의 제조, 교정 및 사용 설명합니다.

이온의 능동 수송으로 인해 생성되는 전기장은 많은 생물학적 시스템에 존재하며, 조직과 기관에서 종종 중요한 기능을 수행합니다. ...

본 영상에서는 생물학적 시료에서 생체 전기 전류를 측정하는 데 사용되는 진동 프로브를 제작하고 사용하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 스테인리스강 블랭크 프로브를 준비하여 팁 부분을 금으로 전기 도금하여 프로브를 제작합니다. 그 다음, 주파수 및 위상각과 같은 백금 프로브 설정을 결정하고 프로브를 교정합니다.이후 관심 샘플로부터 측정을 수행하여 생물학적 샘플에 의해 생성되고 그 주변으로 흐르는 생체 전기 전류의 특성을 나타내는 데이터를 얻을 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 비침습적이고 민감도가 높으며 신호 대 잡음비가 높다는 점입니다. 이 방법은 상처 전기장이 어떻게 세포를 자극하여 상처 치유를 촉진하는지와 같은 의료 분야의 핵심 질문에 대한 답을 제공할 수 있습니다.생체 전기 전류를 측정하기 위한 진동 프로브 제작 과정을 시작하려면, 먼저 World Precision Instruments에서 공프로브를 구매합니다. 우선, 팁에서 25~30mm 뒤 지점에서 프로브를 절단하고, 11번 메스를 사용하여 절단된 끝부분의 파라린(paraline) 절연체를 약 5mm 정도 긁어내어 연결 상태를 확보합니다. 이제 전기 전도성 은 충전 에폭시를 사용하여 프로브를 gold R 30 커넥터에 고정합니다.에폭시가 다음 날까지 경화될 수 있도록 프로브를 상온에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 프로브 팁을 금으로 도금한 후 백금으로 도금합니다. 이를 위해 먼저 프로브 팁을 아세톤으로 헹구고 나노 암페어 전원의 음극 출력단에 연결하십시오.이제 프로브를 해부 현미경 아래에 두고 금 도금 용액에 담급니다. 양극 출력에 연결되어 용액에 담긴 참조 와이어가 회로를 완성합니다. 5 nA의 전류를 5분 동안 가한 다음, 팁이 원하는 최종 크기의 약 절반이 될 때까지 전류를 20 nA로 높입니다.이제 프로브 팁을 증류수로 헹군 후 이온화 용액(izing solution)에 넣습니다. 250 nA의 전류를 5분 동안 가한 다음, 팁이 원하는 최종 크기의 약 80%가 될 때까지 전류를 500 nA로 높입니다. 전류를 1 µA로 높이고, 최종 팁 직경이 30~35 µm가 될 때까지 1초 간격으로 짧게 전류를 가합니다.마지막으로 팁을 헹굽니다. 증류수 프로브는 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다. 이제 제작이 완료된 프로브 시스템을 살펴보겠습니다. 프로브를 피에조 전기 벤더에 부착하십시오. 프로브는 3차원 마이크로 포지셔너에 장착됩니다.진동은 진동 프로브 전원 공급 장치로 제어하며, 이를 통해 진동, 진폭 및 주파수를 조절할 수 있습니다. 프로브 전원 공급 장치는 록인 앰플리파이어(lock-in amplifier)로 기준 신호를 보내며, 록인 앰플리파이어는 진동 주파수와 위상각을 표시합니다. 앰플리파이어는 아날로그-디지털 인터페이스를 통해 컴퓨터에 연결됩니다.데이터는 Strat Clyde Electrophysiology 소프트웨어의 whole cell 프로그램 설정을 사용하여 기록하며, 락인 증폭기(lock-in amplifier) 및 전기생리학 소프트웨어에 관한 내용은 본 프로토콜의 서술 부분에서 확인할 수 있습니다. 이제 새로운 프로브를 설정하는 방법을 살펴보겠습니다. 이를 위해서는 새로운 프로브를 테스트하여 각각의 고유한 주파수와 위상각을 결정해야 합니다.새 프로브와 기준 전선 및 접지선을 생리식염수가 들어 있는 교정 챔버에 넣습니다. 전원 공급 장치를 켜고 최대 진동이 관찰될 때까지 주파수를 높입니다. 이것이 프로브의 공진 주파수입니다.이 공진 주파수에서 프로브를 사용하면 기록 시 불안정성과 노이즈가 발생할 수 있습니다. 따라서 프로브의 작동 주파수를 설정하기 위해 10 hertz를 빼서 튜닝을 해제합니다. 프로브의 진동 거리가 팁 직경과 동일하도록 진동 진폭을 조절하십시오.이렇게 하면 프로브가 진동할 때 프로브 팁의 이중 이미지가 관찰됩니다. 위상각을 결정하려면 캘리브레이션 챔버 내의 식염수에 프로브를 넣고 cm²당 1.5 µA의 전류를 가합니다. 응답이 없을 때까지 락인 앰플리파이어(lock-in amplifier)의 위상각을 반복적으로 조정하십시오.90도를 더하거나 빼면 최대 응답이 나타나며, 이 각도가 프로브의 작동 위상각입니다. 실험 중에 주파수, 위상, 각도 및 진폭 설정을 변경하지 않는 것이 중요한데, 이는 프로브의 응답에 영향을 주기 때문입니다. 편의상 남쪽에서 북쪽으로 흐르는 전류는 상향 편향을 생성합니다.북쪽에서 남쪽으로 흐르는 전류는 아래쪽으로 굴절되어야 합니다. 보정 챔버 내의 프로브에 정확히 1.5 µA/cm²의 표준 전류를 가했을 때의 프로브 응답을 사용하여, 시료 측정 전 시료 내의 전류를 계산하고 적절한 용액에서 프로브를 보정합니다. 그 후, 증발로 인한 삼투압 변화를 보정하기 위해 실험 종료 시 사용된 용액에서 프로브 보정을 다시 수행합니다. 데이터를 분석할 때, 실험 전반부의 측정값은 초기 보정 값을 사용하여 계산하고, 후반부의 측정값은 최종 보정 값을 사용하여 계산할 수 있습니다.시료를 측정할 때는 시료를 고정하고 가동할 수 있도록 설계된 챔버를 사용합니다. 예를 들어, 각막 측정 시에는 안구를 고정하기 위한 와이어 루프가 있는 페트리 접시를 사용합니다. 시료를 측정하려면 생리식염수가 담긴 접시를 해부 현미경 아래에 놓고, 시료에서 관심 있는 영역이 시야에 들어오도록 배치합니다.그런 다음 프로브를 시료 표면과 평행하게 맞추어 용액 속에 놓고, 측정하려는 시료의 지점과 동일한 높이가 되도록 초점을 맞춥니다. 프로브를 시료에서 약 1cm 떨어뜨린 후, 컴퓨터 소프트웨어로 기록하면서 진동을 켜서 안정적인 기선(baseline)을 설정합니다. 그 후 프로브를 표면에서 약 50 µm 떨어진 측정 위치로 이동시킵니다.새로운 피크 값이 안정되면 프로브를 기준 위치로 다시 이동시키고, 그러면 트레이스가 베이스라인으로 돌아갑니다. 이 과정은 정해진 시간 간격으로 반복하여 타임랩스 데이터를 생성하거나, 샘플을 약간 이동시켜 서로 다른 위치에서 측정하는 방식으로 수행할 수 있습니다. 이제 TE 공간 전류 매핑 데이터의 대표적인 결과들을 보여드리겠습니다.각막 상처의 현재 전류 프로파일을 보면 상처 가장자리에서 최대 전류가 흐르는 것을 알 수 있습니다. 타임랩스 데이터는 피부 상처에서 전류 변화의 시간 경과를 보여줍니다. 빨간색 점은 상처 형성 전과 후의 전류를 나타냅니다.일시적인 내향 전류가 발생한 후 외향 전류로 전환되며, 쥐 뇌에서의 측정 결과 후각구에서는 외향 전류가, 외측 뇌실에서는 내향 전류가 나타납니다. 여기에는 이 절차 이후 각막 상처 부위의 전류 공간 매핑 결과가 제시되어 있습니다. 선택적 미세 전극과 같은 다른 방법을 사용하여, 전기 전류 발생 후 어떤 ES가 전류 전달을 담당하는지와 같은 추가적인 의문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 기술은 의학 연구 분야의 연구자들이 상처 치유, 배아 발달 및 척수 손상을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

외부 전기장은 세포의 막에 전압을 유도, 유도 멤브레인 전압 (ΔΦ) 칭했다. potentiometric 염색 DI - 8 - ANEPPS을 사용하여, 그것은 noninvasively ΔΦ를 측정할 수 있습니다. 이 비디오는 측정을위한 프로토콜을 보여줍니다 ΔΦ DI - 8 - ANEPPS를 사용합니다.

디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

신경 기록 전극의 전극 - 조직 인터페이스는 전기 임피던스 분광법 (EIS)과 순환의 voltammetry (CV)로 특성화 할 수 있습니다. 전압 변화에게 전극 - 조직 인터페이스의 전기 특성을 바이어스 및 향상시킬 수있는 녹음 기능의 응용. 전압 바이어스, EIS, CV, 그리고 신경 녹음 보완 있습니다.

신경 인터페이스 전압 바이어스, 순환 Voltammetry, &amp; 전기 임피던스 분광학

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

신경 세포의 문화는 하나의 신경 세포에 대한 효과 나 신경 세포의 인구를 통해 새로운 뇌 자극 기술을 연구하는데 좋은 모델입니다. 목욕 전극에 의해 직접 생산 또는 시변 자기장에 의해 유도되는 전계에 의해 패터닝 신경 배양 자극하는 다른 방법들이 여기에 제시 하였다.

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

살아있는 미생물 biofilms 순수 관련 조건에서의 전기 전도도 측정 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

특성화 생활 Biofilms 통해 전자 전송

여기서, 우리는 경피 / 내피 전기 저항 측정을위한 상업적으로 이용 가능한 젓가락 전극과 함께 사용할 수있는 프로그래밍 가능한 출력 주파수와 저렴한 볼트 암페어 미터를 설정하는 방법을 보여줍니다.

프로그래밍 가능한 출력 주파수를 사용하여 자체 제작 된 볼트 암페어미터를 사용하여 TEER 측정을 수행하는 간단한 접근 방식

문신과 섬유의 두 가지 최근 기술은 피부 감각에서 유망한 결과를 보여주었습니다. 여기에서는 피부 전기 생리 감지를위한 문신 및 섬유 전극의 제조 및 평가 방법을 제시합니다. 전도성 폴리머로 만들어진 이러한 전자 인터페이스는 편안함과 감도 측면에서 기존 표준을 능가합니다.

적합성 웨어러블 전극: 제작에서 전기생리학적 평가에 이르기까지

이 기사에서는 설치류 비복근 근육에서 생체 내 (표면 및 바늘 전극 어레이 사용) 및 생체 외 (유전체 셀 사용) 전기 임피던스 근조영술을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 생쥐와 쥐 모두에서 기술을 시연하고 사용 가능한 수정 (즉, 비만 동물, 새끼)을 자세히 설명합니다.

설치류에서 생체 내 및 생체 외 전기 임피던스 근전도 수행

이 연구에서는 생체 전기 임피던스 벡터 분석 (BIVA)을 통해 유체 과부하의 존재를 평가하는 방법과 응급실에 입원 한 환자에서 사극 다중 주파수 장비를 사용하여 측정 한 임피던스 비율을 보여줍니다. BIVA 및 임피던스 비율은 나쁜 결과를 예측하는 데 신뢰할 수 있고 유용한 도구입니다.

생체 전기 임피던스 벡터 분석에 의한 유체 과부하 평가

여기에서는 상피 조직 항상성의 전기기계적 조절을 연구하기 위해 고유한 2층 미세유체 장치를 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 조직 평면에 수직인 정적 생리학적 전류를 적용하여 세포 간 접착, 증식 및 압출에 영향을 미칩니다. 살아있는 세포 이미징 및 기계적 응력 측정은 이러한 과정의 메커니즘을 보여줍니다.

2층 미세유체 장치를 이용한 조직 항상성의 전기기계적 제어 공개

배우세요 진동 프로브를 이용한 생체 전류 비침습 측정 기법으로 생물학적 시스템의 전기적 특성을 연구하는 방법을 익히세요. 이 기술은 높은 감도와 신호 대 잡음비로 상처 치유 및 세포 행동 연구에 활용됩니다.

진동 프로브와 함께 생체 전류의 측정

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