웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 적절한 제품을 사용할 때 웨스턴 블롯을 쉽게 수행할 수 있음을 입증하는 것입니다. 시료 전처리 후 단백질은 크기에 따라 분리된 다음 고체상으로 옮겨집니다. 그런 다음 단백질을 항체로 조사하고 적절한 프로토콜과 고품질의 비용 효율적인 시약을 사용하여 향상된 웨스턴 블로팅 결과를 생성하도록 검출합니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 샌디에이고에 있는 EMD Chemicals의 과학자인 Jesse Luhan입니다. EMD는 독일 Dharm stat에 있는 Merck, KGAA의 계열사입니다. 오늘은 웨스턴 블로팅 시술을 소개해 드리겠습니다.

시작하겠습니다. 웨스턴 블로팅의 첫 번째 단계는 시료 전처리입니다. 2, 500배 중력에서 5분과 같은 저속 원심분리를 사용하여 세포를 펠릿화하여 샘플 준비를 시작합니다.

원심분리 후 세포 펠릿을 배출합니다. 6개의 세포에 10개당 150마이크로리터를 사용하여 세포를 사이토 버스터 단백질 추출 시약으로 잘 재현탁시킵니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 16, 000 시간 중력에 5 분 동안 원심분리 다음 섭씨 4도에서 샘플을 회전시킵니다. 투명화된 SNA를 새 튜브로 옮기고 분석을 진행합니다. 샘플의 단백질 농도를 평가한 후 단백질을 변성시키기 위해 겔을 로딩하기 위해 샘플을 준비합니다.

s를 사용하십시오.ampsodium doil sulfate 또는 SDS와 같은 onic 변성 세제가 포함된 버퍼. 혼합물을 섭씨 95도에서 100도까지 5분 동안 끓입니다. 상업적으로 이용 가능한 프리캐스트 겔을 사용하여 분자량에 따라 단백질을 빠르게 분리할 수 있습니다.

전기영동 장치를 Omni PU 화학 라인을 통해 제공되는 시약으로 만들 수 있는 러닝 버퍼로 채웁니다. 우물의 첫 번째 레인에 트레일 믹스 단백질 마커를 로드합니다. 이 마커에는 전기영동 중 모니터링을 허용하는 3개의 참조 대역이 있습니다.

젤이 염색되면 10에서 225 킬로 달튼에 이르는 10개의 띠가 보입니다. 변성된 샘플을 나머지 웰에 로드합니다. 젤을 220볼트에서 1시간 동안 실행합니다.

단백질이 분리되면 젤을 kumasi blue로 염색하여 DS를 사용하지 않을 준비가 된 빠른 염색 및 초민감 염색을 사용하여 단백질이 균일하고 균일하게 이동했는지 확인합니다. 전하를 가진 단백질이 전기장에서 겔을 통해 이동하도록 유도될 수 있는 것처럼 염색이 필요하므로 단백질은 겔에서 니트로셀룰로오스 또는 PVDF와 같은 멤브레인으로 전기장으로 전달될 수 있습니다. PVDF 멤브레인을 사용할 때 멤브레인을 메탄올에 몇 분 동안 담근 다음 얼음 저온 전달 버퍼에서 5분 동안 평형을 이룹니다. 또한 겔을 얼음 냉간 전달 버퍼에 몇 분 동안 담그십시오 : E 평형은 전달 중 겔의 수축을 방지합니다.

젖은 전사를 위해 스폰지와 종이 사이에 젤과 멤브레인의 샌드위치를 조립하십시오. 그런 다음 젤과 멤브레인 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인한 후 어셈블리를 단단히 고정합니다. 샌드위치를 전송 버퍼에 담그고 전기장을 가합니다.

음전하를 띤 단백질은 양전하를 띤 전극으로 이동합니다. 그런 다음 멤브레인은 그것들을 멈추고, 묶고, 계속하는 것을 막습니다. 전달이 완료되면 단백질을 시각화하여 공기 주머니 없이 균일하게 전달되도록 합니다.

이것은 적색 경보 웨스턴 블롯 얼룩으로 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 얼룩은 바로 사용할 수 있으며 물로 쉽게 염색할 수 있습니다. 이것은 멤브레인이 항체로 입증되기 전에 물로 세척하여 유지되면 멤브레인이 차단된 젤입니다.

비특이적 결합을 방지하려면 고품질 차단 시약으로 멤브레인을 차단하십시오. 부드러운 교반 하에서 실온에서 1 시간 동안 차단 용액에 배양하여 배경 증가를 피하려면 배양 후 TBST 또는 PBST에서 멤브레인을 3 회 세척하십시오. 이러한 버퍼는 TBS 트윈 정제 및 PBS 트윈 정제를 각각 사용하여 쉽고 편리하게 만들 수 있습니다.

멤브레인을 차단하고 세척한 후에는 1차 항체와 함께 배양할 수 있습니다. 신호 부스트 중 하나인 용액을 사용하여 1차 항체를 적용하면 신호가 크게 향상될 수 있습니다. 용액 1에서 1차 항체를 준비하고 멤브레인을 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 추가 차단제를 추가할 필요가 없습니다. TBST로 멤브레인을 세척하십시오. 다음으로, 신호 부스트의 용액 2에 희석된 2차 항체로 멤브레인을 1시간 동안 배양합니다.

마지막으로, HRP 접합체에 대해 TBST로 멤브레인을 여러 번 다시 세척합니다. Enhanced chemiluminescence 또는 ECL에 의한 2차 항체 검출이 전통적으로 여기에 사용됩니다. ECL 시약 rapid step은 루미놀 또는 인핸서를 혼합할 필요가 없기 때문에 사용됩니다.

멤브레인을 몇 번 분사하고 2분 동안 배양한 다음 X-ray 필름을 사용하여 현상하기만 하면 됩니다. Rapid Step은 기판 추가 후 최대 2시간 동안 낮은 피코그램 감도와 더 가벼운 임무를 제공합니다. Trail mix 단백질 마커는 표준 웨스턴 블롯 프로토콜과 비교할 때 전기영동 중 단백질 추적을 가능하게 합니다.

Signal Boost를 사용하면 더 큰 다이내믹 레인지와 감도를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 기존 ECL 시약 대신 Rapid step을 사용하여 우수한 감도를 얻을 수 있습니다. 우리는 방금 포괄적인 범위의 제품을 사용하여 서양 블라인드를 효율적이고 비용 효율적으로 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

결과의 품질은 시약의 품질에 달려 있음을 기억하십시오. 그거에요. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.