Name: 웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 학습하세요 웨스턴 블롯팅 기법을 통해 조직 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 방법을. 고품질 시약과 적절한 프로토콜을 사용하면 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

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1. 샘플 준비 서양은 모래 바닥의 첫 번째 단계는 샘플 준비합니다. 젤 세포와 조직을 실행하기위한 샘플을 준비하기 위해서는 관심의 단백질을 공개 lysed해야합니다. <ul><li> 다목적 및 가용성 단백질 추출에 사용하기 쉬운 편리 즉시 사용 시약은 CytoBuster 또는 PhosphoSafe입니다. 이러한 추출 버퍼는 포유 동물 및 곤충 세포에서 가용성 단백질의 효율적인 추출에 최적화된 세제를 포함하고 있습니다. CytoBuster 단백질 추출 시약의 부드러운 아닌 이온 성분은 sonication이나 동결 / 해동 보조 치료를 위해 필요없이 기능 활성화 내생이나 표현 단백질의 분리 수 있습니다. PhoshoSafe 네 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는의 추가 혜택을했다. <ol><li> 저속 원심 분리 (2,500 XG의 예 5 분)에 의해 펠렛 세포가 잘 세포 펠렛을 물기. </li><li> 10 6 셀 당 150 μL (셀 크기에 따라 달라질 수 있습니다 CytoBuster 단백질 추출 시약의 최적의 금액)을 사용하여 CytoBuster 단백질 추출 시약으로 세포를 Resuspend. </li><li> 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 적합한 튜브로 전송하고 4 16,000 XG에서 5 분 스핀 ° C. </li><li> 전송 새로운 튜브로 (세포 추출물) 뜨는 취소 및 분석 진행합니다. </li></ol></li><li> 전문 단백질 추출을 위해, 우리는 고품질 ProteoExtract 키트를 사용하는 것이 좋습니다. EMD는 mitochondrial 고립, subcellular 프로테옴 추출, transmembrane 단백질의 추출, 그리고 많은 다른 이상 한 다스 키트가 있습니다. 자세한 내용은 우리가 서양 얼룩의 방문 페이지를 방문하십시오. </li><li> EMD는 또한 프로 테아제와 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 세트의 다양한 판매하고 있습니다. 즉시 용해가 발생로서, proteolysis, dephosphorylation 및 변성이 시작됩니다. 샘플 얼음이나 4에 보관하는 경우 이러한 이벤트는 엄청난 속도가 느려졌 수 있습니다 ° 항상 적절한 억제제에 C가 용해 버퍼에 새로운 추가됩니다. 자세한 내용은 우리가 서양 얼룩의 방문 페이지를 방문하십시오. </li></ul> 2. SDS - PAGE 모래 바닥 서양 두 번째 단계는 단백질 분리됩니다. 단백질은 분자량에 따라 구분됩니다. <ul><li> 당신은 자신의 페이지 젤을 할 수 있지만 우리는 상업적으로 사전 캐스트 젤을 사용하는 것입니다. <ol><li> 샘플 준비 후 단백질 농도를 결정하기 위해 준비가되어 있습니다. EMD는 농도를 측정하는이 두 키트를 가지고, 그 중 하나가 아닌 방해하는 단백질 분석 키트 및 BCA 단백질 분석 키트되고있는 다른되지. </li><li> 단백질 농도가 평가되면 우리는 젤 로딩을위한 샘플을 준비하는 준비가되어 있습니다. 항체는 일반적으로 관심의 단백질의 작은 부분을 (에피토프라고도 함)임을 인식하고이 도메인은 단백질의 3 차원 형태 내에 있습니다. 그것은 단백질을 펼쳐 필요가이 부분에 대한 항체의 액세스를 설정하려면 다음과 같이하십시오. </li><li> 변성하려면, 음이온 denaturing 세제 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)로 로딩 버퍼를 사용하고 5 분 95-100 ° C에서 혼합물을 끓여. 사용하기 쉽고 편리하게 로딩 버퍼 4X 샘플 버퍼입니다. </li></ol></li><li> 트레일 믹스 단백질 마커와 잘의 첫 번째 차선을로드합니다. 이 표식은 전기를 모니터링하도록 세 참조 밴드가 있습니다. 겔이 묻은 경우, 10 밴드가 10-225 KDA까지 볼 수 있습니다. </li><li> 버퍼를 실행과 함께 전기 영동 장치를 입력합니다. 페이지 젤 들어,이 트리스 - 글리신 보통 1X입니다. 자세한 버퍼 조리법은 서양 모래 바닥 페이지를 방문하십시오. EMD는 우리 OmniPur 화학 라인 고품질의 버퍼의 시약을 제공합니다. 1 시간 220V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 단백질이 분​​리되면, 단백질이 골고루하고 균일하게 마이 그 레이션이 보장 쿠매시과 청색의 젤 얼룩. RAPIDstain가 - 사용 준비가되어있는 극도로 민감한 얼룩이다. 아무 destaining은 필요하지 않습니다. </li></ul> 3. 단백질 전송 전기 요금과 단백질은 전기 분야에서 젤을 통해 여행을 유도 할 수있는 것처럼, 그래서 단백질은 PVDF 또는 nitrocellulose 중 하나되고, 멤브레인로 젤에서 전기 분야에 전송할 수 있습니다. <ul><li> 오늘 우리는 젖은 전송을 할 것입니다. 서부 유럽 표준시 전송에서 젤 및 멤브레인는 스펀지와 종이 (스폰지 / 종이 / 젤 / 멤브레인 / 종이 / 스펀지)와 모든 기포가가 젤과 막 사이에 형성이 없습니다 확인한 후 함께 단단히 고정되어 아르 사이에 끼워 넣으면됩니다. 샌드위치는 전기장이 적용입니다 전송 버퍼에 빠져들 수 있습니다. 부정적 - 충전 단백질은 긍정적 - 충전 전극을 향해 여행을하지만, 멤브레인 그들을 중지, 그들을 바인딩, 및 계속에서 그들을 방지합니다. </li><li> 세포막의 두 종류가 있습니다 : nitrocellulose 및 PVDF. 둘 다 잘 작동. 오늘 우리는 PVDF를 사용하는 것입니다. PVDF의 점막은 methano에 몸을 담글 필요5 분 얼음 차가운 전송 버퍼로 다음 몇 분 동안 리터. 젤은 또한 얼음 차가운 전송 버퍼에서 몇 분 동안 평형을해야합니다. 이렇게하지 ​​않으면 전송 중에 젤 축소 있습니다. </li><li> 서부 유럽 표준시 전송을위한 버퍼 20 % 메탄올로 1X 트리스 - 글리신입니다. 상세 버퍼 준비는 저희 웹사이트에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 전송이 완료되면, 아무 공기 주머니로 전송도 보장하기 위해 단백질을 시각화하는 것이 좋습니다. 이것은 쉽게 RedAlert 서양 얼룩 얼룩도 함께 수행할 수 있습니다. 이 얼룩은 - 사용 준비하고 destaining는 물로 쉽게 수행할 수 있습니다. </li></ul> 4. 항체 및 액세서리 시약 <ul><li> 항원을 탐색하고 항체를하고의 첫 번째 단계는 멤브레인을 차단하는 것입니다. 멤브레인를 차단하면 불특정 배경 바인딩을 방지할 수 있습니다. </li><li> 비 - 지방 우유 또는 BSA 중 하나는 차단 솔루션으로 사용할 수 있습니다. 그러나, phospho 특정 항체를 사용하는 경우, 그것은 그것이 높은 배경의 원인이되므로 우유를 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> EMD이 아닌 포유 동물 차단 에이전트 및 준비 얼룩 QuickBlocker입니다 SeaBlock 포함한 여러 고품질 차단 시약,,, 즉시 사용 에이전트를 차단.을 제공합니다 우리는 또한 고품질 BSA (분수 V)를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 부드러운 교반에 따라 상온에서 막 1 시간 품어. </li><li> 부화 후 TBST 또는 PBST로 세 번 씻으십시오. TBST 또는 PBST를 만들기 위해 쉽고 편리한 방법은 (PBS 트윈의 위패 / TBS 트윈 제나) 우리의 타블렛을 사용하는 것입니다 </li></ol></li><li> 멤브레인가 차단되면, 당신은 기본 항체와 부화 준비가되어 있습니다. EMD는 30 년 이상 업계 최고의 항체 보증과 탁월한 항체의 포괄적인 포트폴리오를 제공하고 있습니다. 모든 EMD 항체와 함께, 우리는 전체 백퍼센트 노 위험 보장을 제공하는 기억하십시오. 항체를 구입하고 원하는 어떤 종류의 특이성 또는 응용 프로그램을 위해 사용합니다. 항체가 만족을 위해 노력하지 않으면, 우리는 다른 제품에 사용되는 전체 크레딧을 제공합니다. 자세한 내용은 Google 서양 모래 바닥 웹 페이지를 방문하시기 바랍니다. <ol><li> 오늘 우리는 SignalBoost의 해결 방법 1을 사용하는 우리의 기본 항체를 잠복기 것입니다. SignalBoost는 신호가 크게 향상 될 수 있도록 좋은 제품입니다. 단순히 솔루션 1 기본 항체를 품어 1 시간 동안이나 평소처럼 품어. 자세한 차단 에이전트를 추가할 필요가 없습니다. 또는 BSA 또는 차단 요원으로 무지방 건조 우유를 사용할 수 있습니다. </li><li> TBST로 씻으십시오. 우리는 사용 준비를 해산하기 위해 TBST 태블릿을 TBST합니다. </li><li> SignalBoost의 솔루션 2를 사용하여 보조 항체를 품어. 1 시간 버퍼를 차단에서 보조 항체를 품어. TBST로 다시 여러 번 멤브레인 씻으십시오. </li></ol></li></ul> 5. 검색 HRP 항체 결합 보조 들어, ECL은 전통적으로 사용됩니다. 우리가 제공하는 뛰어난 ECL 시약은 RapidStep입니다. RapidStep의 장점은 luminal 또는 확장기에 대한 혼합이 필요하지는 것입니다. 단순히 막 몇 번 스프레이하고 X - 선 필름을 사용하여 개발할 수 있습니다. RapidStep는 기판의 추가 후 낮은 그림 문 감도뿐만 아니라 최대 2 시간 동안 발광 빛을 제공합니다.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

저자 안나 Eslami 제시 루얀이 문서에 사용되는 시약 및 악기를 생산 EMD 화학 병원에서 근무하고 있습니다.

이 비디오 프레 젠 테이션에서 우리는 SDS - PAGE, 항체와 프로빙 / 차단 막하고, 감지, 샘플 준비 아르 서양은 모래 바닥의 주요 단계를 강조합니다. 프로세스의 각 단계에 대해 적절한 프로토콜과 적절한 시약은 고품질 결과를 달성하는 데 사용해야합니다.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; 단백질 추출 시약</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; 추출 시약</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>비간섭성 단백질 분석법&amp;#8482; 키트</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA 단백질 정량 분석 키트 </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS 시료 완충액 </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>트레일 믹스&amp;#8482; 단백질 마커</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>단백질&amp;#8211;추출물&amp;#8482; 단백질 추출 키트</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;추출물&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;추출물&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;추출물&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;추출물&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; 제품</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; 시약</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;웨스턴 블로팅(Western blotting)은 조직 균질액 또는 추출물 샘플 내의 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술입니다. 이 기술은 젤 전기영동을 이용하여 폴리펩타이드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3차원 구조(비변성 조건)에 따라 천연 또는 변성 단백질을 분리합니다. 그 후 단백질을 막(일반적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 전이시키며, 여기서 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 단백질을 프로빙(검출)합니다.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X 웨스턴 블롯 염색액</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; 시약, 연어 혈장</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker 시약</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; 정제</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; 정제</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>시그널부스트(SignalBoost)&amp;#8482; 면역반응 증진 키트</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL 시약</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다. 그것은 polypeptide의 길이 (denaturing 조건) 또는 단백질의 3 차원 구조 (기본 / 비 denaturing 조건)에 의해 기본 또는 변성 단백질을 분리하는 겔 전기 영동을 사용합니다. 단백질은 다음 대상 단백질에 특정한 항체를 사용하여 그들이 탐지하는 막 (일반적으로 nitrocellulose 또는 PVDF), (감지)으로 전송됩니다.

모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다.

웨스턴 블로팅(Western blotting)은 특정 조직 균질액 또는 추출물 샘플 내에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술입니다. 이 기술은 젤...

본 절차의 전반적인 목적은 적절한 제품을 사용하여 웨스턴 블롯을 간편하게 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 시료 준비 후, 단백질을 크기별로 분리하여 고체 상으로 전이시킵니다. 이후 항체를 이용해 단백질을 탐지하며, 적절한 프로토콜과 고품질의 가성비 좋은 시약을 사용함으로써 개선된 웨스턴 블로팅 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아주 샌디에이고에 위치한 EMD Chemicals의 R&amp;D 과학자 Jesse Luhan입니다. EMD는 독일 다름슈타트의 Merck, KGAA 계열사입니다. 오늘은 웨스턴 블로팅 절차를 보여드리겠습니다.그럼 시작하겠습니다. 웨스턴 블로팅의 첫 번째 단계는 시료 준비입니다. 2,500 ×g에서 5분간과 같이 저속 원심분리를 이용하여 세포를 펠렛화하여 시료 준비를 시작하십시오.원심분리 후, 세포 펠렛을 제거합니다. 세포 10⁶개당 150 µL의 cyto buster 단백질 추출 시약을 사용하여 세포를 충분히 재현탁합니다. 샘플을 상온에서 5분 동안 배양합니다.다음으로, 원심분리 후 4 °C에서 16,000 ×g로 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 상층액의 SNA를 새 튜브로 옮기고 분석을 진행합니다. 샘플의 단백질 농도를 측정한 후, 단백질을 변성시키기 위해 겔 로딩용 샘플을 준비합니다.sodium dodecyl sulfate 또는 SDS와 같은 이온성 변성 세제가 포함된 샘플 버퍼를 사용하십시오. 혼합물을 95~100°C에서 5분 동안 가열하십시오. 시판되는 프리캐스트 겔을 사용하면 단백질을 분자량에 따라 빠르게 분리할 수 있습니다.전기영동 장치를 전개 버퍼로 채웁니다. 전개 버퍼는 Omni PU 화학 제품군에서 제공하는 시약으로 제조할 수 있습니다. 웰의 첫 번째 레인에 trail mix 단백질 마커를 로딩합니다. 이 마커에는 전기영동 과정 중 모니터링이 가능하도록 세 개의 기준 밴드가 포함되어 있습니다.겔 염색이 완료되면 10에서 225 kilo Daltons 범위의 10개 밴드가 관찰됩니다. 변성된 시료를 나머지 웰에 로딩하십시오. 220 volts에서 한 시간 동안 겔 전기영동을 수행하십시오.단백질 분리가 완료되면, ready-to-use no DS 제품인 rapid stain 및 ultrasensitive stain을 사용하여 쿰시 블루(kumasi blue)로 젤을 염색함으로써 단백질이 균일하고 고르게 이동했는지 확인합니다. 전기 전하를 띤 단백질이 전기장 내에서 젤을 통해 이동할 수 있는 것과 마찬가지로, 전기장을 이용해 젤의 단백질을 NITROCELLULOSE 또는 PVDF와 같은 막으로 전이시켜야 하므로 염색 과정이 필요합니다. PVDF 막을 사용할 때는 막을 메탄올에 몇 분간 담근 후, 얼음처럼 차가운 전이 버퍼(transfer buffer)에서 5분 동안 평형화합니다. 젤 또한 얼음처럼 차가운 전이 버퍼에 몇 분간 담급니다. 이러한 평형화 과정은 전이 중 젤이 수축되는 것을 방지합니다.습식 전사를 위해 스펀지와 여과지 사이에 겔과 막을 배치하여 샌드위치 구조를 만듭니다. 그런 다음 겔과 막 사이에 기포가 생기지 않았는지 확인한 후 조립체를 단단히 고정합니다. 이 샌드위치 구조를 전사 버퍼에 담그고 전기장을 가합니다.음전하를 띠는 단백질은 양전하 전극 방향으로 이동합니다. 이후 막이 단백질을 멈추게 하고 결합시켜 더 이상 이동하지 않도록 합니다. 전사가 완료되면, 기포 없이 균일하게 전사되었는지 확인하기 위해 단백질을 시각화합니다.이는 red alert Western blot 염색액으로 간단히 수행할 수 있습니다. 이 염색액은 바로 사용할 수 있으며, 물을 이용하여 쉽게 탈색할 수 있습니다. 이는 항체를 반응시키기 전, 물로 세척하여 탈색한 후 멤브레인을 블로킹한 상태의 겔 모습입니다.비특이적 결합을 방지하기 위해 고품질의 블로킹 시약을 사용하여 막을 블로킹하십시오. 배경 신호의 증가를 피하려면 블로킹 용액에 넣고 실온에서 가볍게 흔들어주며 1시간 동안 배양한 다음, 배양 후 TBST 또는 PBST로 막을 3회 세척하십시오. 이러한 버퍼는 각각 TBS tween 정제와 PBS tween 정제를 사용하여 쉽고 편리하게 제조할 수 있습니다.멤브레인의 블로킹과 세척이 완료되면 1차 항체와 함께 배양할 수 있습니다. 신호를 상당히 증폭시켜 주는 시그널 부스트(signal boost) 성분이 포함된 솔루션 1을 사용하여 1차 항체를 처리하십시오. 솔루션 1에 1차 항체를 준비하여 멤브레인을 1시간 동안 배양하십시오.배양 후 추가적인 블로킹제를 첨가할 필요는 없습니다. TBST로 막을 세척하십시오. 다음으로, Signal Boost의 솔루션 2에 희석한 2차 항체와 함께 막을 1시간 동안 배양하십시오.마지막으로, HRP 접합 2차 항체 검출을 위해 막을 TBST로 여러 번 다시 세척합니다. 여기서는 전통적으로 화학 발광 또는 ECL 방식을 통한 2차 항체 검출이 사용됩니다. 루미놀이나 증폭제를 섞을 필요가 없는 ECL reagent rapid step 제품이 사용되었습니다.멤브레인에 수 차례 분사한 후 2분 동안 배양하고, X선 필름을 사용하여 현상합니다. Rapid Step은 low picogram 수준의 민감도를 제공하며, 기질 첨가 후 최대 2시간 동안 신호가 유지됩니다. Trail mix 단백질 마커를 사용하면 표준 Western blot 프로토콜과 비교하여 전기영동 중 단백질 추적이 가능합니다.Signal Boost를 사용하면 더 넓은 동적 범위(dynamic range)와 감도를 확보할 수 있습니다. 마지막으로, 기존의 ECL 시약 대신 Rapid 단계를 사용하면 더욱 뛰어난 감도를 얻을 수 있습니다. 지금까지 종합적인 제품 라인업을 통해 효율적이고 비용 효과적으로 Western blinding을 수행하는 방법을 살펴보았습니다.결과의 품질은 사용하시는 시약의 품질에 달려 있다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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학습하세요 웨스턴 블롯팅 기법을 통해 조직 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 방법을. 고품질 시약과 적절한 프로토콜을 사용하면 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

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