E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

안녕하세요, 저는 William Ti입니다. Arnold Creek Stein Lab에서 나왔습니다. 오늘은 저와 동료들이 E 16 쥐 배아의 자궁 내 주입 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Laura Elias입니다.

오늘은 오늘 진행할 뇌실 내 주입과 전기천공법을 위한 미세주입 피펫 준비 및 피펫 로딩 방법을 보여드리겠습니다. 또한 E 16 쥐 배아에서 뇌실 내 주입과 전기천공법을 수행하는 방법도 보여드리겠습니다. 쥐는 유전자 조작을 쉽게 수행할 수 없는 시스템이기 때문에, 쥐의 자궁 내 주입 및 전기천공법이 특히 유용합니다.

이 절차에는 여러 가지 수술 도구가 사용됩니다. 큐렛(curette), 두 쌍의 어딘 포셉(addin forceps)(하나는 톱니 모양이고, 다른 하나는 끝부분에 작은 치형이 있는 것), 그리고 지혈집게(hemostats) 한 쌍을 사용합니다.

이것은 가위이며, 이어서 두 개의 스테이플러를 사용합니다. 이것은 쥐(rat)에게 사용하는 더 큰 크기의 스테이플러입니다. 이것은 생쥐(mice)에게 사용하는 더 작은 크기의 스테이플러로, 7호 스테이플을 사용하며, 다른 하나는 9호 스테이플을 사용하며 두 제품 모두 스프링 방식입니다.

수술을 돕기 위해 사용하는 도구 중 일부로, 저희는 더블 헤드가 장착된 단순한 광섬유 광원을 사용합니다. 체온 유지를 위해 따뜻한 가열수가 순환되는 가열 패드를 사용합니다. 작업 표면에는 BTX 사의 전기천공 시스템을 사용합니다.

배아의 크기에 따라 사용할 수 있도록 몇 가지 다른 크기의 패들을 준비했습니다. 파란색 면이 양극(+) 측입니다. 이제 주입용 피펫의 끝을 비스듬하게 깎는 베벨링 작업을 진행하겠습니다.

이는 매우 중요한데, 피펫의 입구가 DNA를 로딩할 수 있을 만큼 충분히 커야 하면서도, 주입 시 배아에 손상을 주지 않도록 매우 날카로워야 하기 때문입니다. 주입 과정에서 배아가 손상되면 사망률이 훨씬 높아지게 되며, 이는 바람직하지 않은 결과입니다.

이 과정은 본 수술에서 매우 중요한 단계입니다. 먼저, 회전하고 있는 베벨링 스톤(beveling stone) 위에 물을 약간 뿌려줍니다. 그런 다음, 여기 있는 스틱을 하나 사용하겠습니다.

방금 뽑아낸 피펫을 테이프를 이용해 이 스틱에 고정하겠습니다. 그리고 마이크로 매니퓰레이터 중 하나를 사용하여 피펫을 베벨 부분에 고정하고 베벨링이 가능하도록 하겠습니다. 이를 배치한 후, 현미경을 사용하여 피펫의 팁 끝부분을 시각화합니다.

그리고 베벨(bevel) 위에 약간의 압력이 가해지도록 물속에 바로 내려놓습니다. 팁이 이곳의 스톤을 압박하는 것을 볼 수 있습니다. 이 상태로 최소 15분 동안 베벨링이 되도록 둡니다.

저는 이를 약 한 시간 정도 그대로 두기도 합니다. 때로는 팁이 매우 날카로워지기도 하지만, 피펫의 베벨링(beveling)을 얼마나 오래 하는지는 분명 사람마다 다릅니다. 자, 여기 보시면 상단에 아직 베벨링 처리를 하지 않고 당겨낸 피펫이 있습니다.

따라서 끝은 날카롭지만, DNA를 주입할 수 있는 구멍은 없습니다. 반면 하단의 피펫은 끝이 비스듬히 깎여 있으며, 이렇게 각도가 진 개구부를 확인하실 수 있습니다. 이를 통해 DNA를 주입할 수 있으며, 동시에 끝부분은 여전히 날카로워 조직 손상 없이 주입이 가능합니다. 이제 주입용 피펫에 DNA를 채워보겠습니다.

따라서 DNA를 주입할 때 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides)가 함께 주입되지 않도록 endotoxin-free 방식으로 DNA를 준비하는 것이 중요합니다. 이제 DNA를 가져와서, 여기 파라필름(parafilm)을 준비하겠습니다. 파라필름을 펼친 후, DNA를 채취하여 파라필름 위에 작은 점 형태로 놓아주십시오.

그런 다음, 저는 보통 1.5~1.7 µg/µL 농도로 사용하는 DNA 10 µL당, 이 fast cream dye를 약 1 µL 사용합니다. 이는 주입 위치를 파악하고 뇌실에 성공적으로 주입되었는지 확인하기 위한 것입니다.

그런 다음 이 Fast Green 염료를 DNA와 혼합합니다. 그다음 주입 전극을 사용하여 플런저를 뒤로 당겨 피펫을 채웁니다. 여기 보시면 피펫이 정확하고 개구부가 충분히 크다면, DNA가 매우 쉽게 로딩되는 것을 알 수 있습니다.

때로는 플런저를 앞뒤로 몇 번 움직여야 정확하게 흡입될 때가 있습니다. 그런 다음 이와 같이 피펫을 로딩합니다. 이제 DNA가 피펫에 완전히 로딩되어 주입 준비가 되었습니다.

이제 동물을 마취하겠습니다. 저희는 이 Decapicone을 사용합니다. 잡기 편하도록 가장자리 부분을 살짝 뒤로 젖혀줍니다.

그럼 시작하겠습니다. 저는 보통 동물이 들어갈 수 있도록 케이지 가장자리에 이렇게 작은 터널 모양으로 놓아줍니다. 좋습니다, 동물이 들어간 것으로 보입니다.

동물의 상태를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 반응을 확인하겠습니다. 발가락을 잡고 가볍게 꼬집어 줍니다. 너무 강하게 꼬집어 동물이 다치지 않도록 주의하되, 마취가 충분히 되었는지 확인해야 합니다.

동물이 확실히 진정되었습니다. 이제 복부를 삭모하겠습니다. 유두 끝부분이 잘리지 않도록 주의하며 진행하겠습니다.

동물에게 매우 고통스러울 수 있다고 생각합니다. 따라서 동물의 털을 깎아주었습니다. 이제 후드로 옮기겠습니다.

동물을 세척한 후 시술을 시작하겠습니다. 이제 이 동물이 다시 마취 상태임을 확인하였으므로, 먼저 세척을 준비하겠습니다. 각 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 소량 도포하겠습니다.

그다음으로 알코올 솜과 요오드 솜을 교대로 사용하여 세척합니다. 이렇게 교대로 닦는 과정을 총 3회 반복합니다. 이때 배아에 손상을 줄 수 있으므로 매우 조심스럽게 작업해야 합니다.

그저 아래로 곧게 닦아내고, 다시 그대로 뒤로 닦아내시면 됩니다. 이것이 첫 번째 단계입니다. 먼저 충분히 적신 후에 닦아내기 작업을 수행하겠습니다. 좋습니다.

두 개, 그리고 세 개입니다. 좋습니다, 멸균 상태를 유지하기 위해 덮개를 씌웠으며 이제 동물을 절개하겠습니다. 자, 자릅시다.

먼저, 멸균 장갑을 착용해야 합니다. 멸균 장갑을 착용한 후 절개를 시작할 준비를 합니다. 항상 동물이 여전히 마취 상태인지 확인해야 합니다.

이제 다시 발가락 끝을 집어 올릴 것이며, 시술 전반에 걸쳐 이 작업을 반복할 것입니다. 보통 저는 조직의 일부를 살짝 집어 올린 다음, 빠르게 절개하고, 상단 부분을 잡고 아래로 자른 뒤, 다른 포셉을 이용해 조직을 벌려 고정하는 방식으로 진행합니다.

그런 다음 원하는 근육을 잡고, 혈관이나 신경이 손상되지 않도록 정중앙선을 따라 절개합니다. 잡을 때 주의하십시오. 이제 적절한 양의 시료가 얻어진 것으로 보입니다.

건조해지지 않도록 충분히 윤활 상태를 유지하겠습니다. 그리고 상태가 괜찮은지 확인하기 위해 한 번 더 체크하겠습니다. 네, 괜찮아 보입니다. 저는 항상 일관성을 위해 배아의 머리가 어미 쥐의 오른쪽을 향하도록 배치합니다.

이제 시작하겠습니다. 여기 배아를 볼 수 있습니다. 여기 꼬리와 뒷다리를 볼 수 있으며, 더 위쪽에는 머리가 보입니다.

여기 배아의 머리 부분을 보고 있습니다. 이 어두운 선을 통해 정중선을 확인할 수 있습니다. 왼쪽 반구와 오른쪽 반구, 그리고 후뇌가 관찰됩니다.

이제 주입을 위해 좌반구를 대상으로 하겠습니다. 피펫으로 주입하고, 약간 끌어올린 후 염료를 주입합니다. 그러면 이제 좌측 측뇌실로 퍼지는 것을 볼 수 있습니다.

성공적으로 주입된 것으로 보입니다. 이제 뇌실이 적절하게 채워진 것을 확인할 수 있습니다. 염료가 실제로 좌심실에서 우심실로 이동했습니다.

이제 양쪽 뇌실에 D와 DNA가 들어갔습니다. 이 시점에서 전기천공법 전극을 사용하여 뇌 가로질러 배치하고, 왼쪽 면에 양극을 위치시키겠습니다. 이렇게 하면 DNA가 왼쪽 반구의 전구세포와 피질벽으로 들어오게 됩니다.

이제 전류를 흘려보내겠습니다. 전해 전류를 흘리기 시작하면 전극의 음극단에 거품이 생기는 것을 볼 수 있습니다. 이는 접촉이 올바르게 이루어졌음을 확인해 주는 표시입니다.

이제 배아들에 전기천공을 마쳤으므로, 배아들을 다시 넣고 봉합하겠습니다. 이제 항생제 10 mL를 투여하고 외과적 봉합을 하겠습니다. 저는 블록 스티치(block stitches) 방식을 선호합니다.

그 후, 피부 스테이플러를 사용하여 피부를 봉합하겠습니다. 알겠죠? 네. 마취에서 깰 때 통증을 느끼지 않도록 부프레노르핀(buprenorphine)을 투여했습니다. 이제 저체온증이 발생하지 않도록 회복되는 동안 체온을 유지해 줄 인큐베이터에 넣겠습니다.

자, 지금까지 자궁 내 뇌실 내 주입 및 전기천공법 수행 방법을 살펴보았습니다. 쥐의 경우, 여러 가지 다른 물질을 주입할 수 있습니다. 렌티바이러스나 레트로바이러스를 포함한 바이러스를 뇌실 내로 직접 주입할 수 있습니다.

이 경우에는 바이러스가 세포 내로 통합되기 때문에 전기천공법을 수행할 필요가 없습니다. 오늘 우리가 한 것처럼 DNA 플라스미드를 주입하는 경우에는 뇌실을 라이닝하는 세포 내부로 플라스미드를 전달하기 위해 전기천공법을 수행해야 합니다. 따라서 이러한 벡터들을 다양한 가능성에 맞춰 사용할 수 있습니다.

단순히 세포를 추적하고 GFP를 발현시켜 이러한 전구세포의 분열과 이동을 관찰하는 용도로 사용할 수 있습니다. 또한, 이 벡터들을 사용하여 세포를 조작할 수도 있습니다. 예를 들어 S-H-R-N-A 헤어핀을 발현시켜 특정 유전자를 넉다운(knock down)할 수 있습니다.

특정 유전자를 과발현시킬 수도 있으며, 이러한 방식으로 전기천공법으로 도입하거나 바이러스로 감염시킨 세포를 조절할 수 있습니다. 이는 관심 있는 과정에서 특정 단백질의 역할을 연구하는 데 매우 강력한 기술이 될 수 있습니다. 특히 쥐(rat)에서는 생쥐(mouse)만큼 유전자 조작을 쉽게 수행할 수 없기 때문에, 이러한 방법이 매우 중요합니다.