Name: 주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 학습하세요 주파수 구성 요소를 활용한 이온 채널 IV 곡선 재현 기법으로 다중 이온 채널 전류를 동시 측정하는 방법입니다. 약리학적 차단제 없이 전압 클램프 실험에서 채널 역학을 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 박사 Poelzing에게 수여 보건 부여 번호 R21 - HL094828 - 01의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 소음 기능 및 입력 신호를 준비 <ol><li> 원하는 주파수 구성 요소를 포함하는 노이즈 함수를 만듭니다. 이것은 주파수 영역에서 원하는 주파수 구성 요소를 설명하는 다음 역 고속 푸리에 변환을 계산하여 수행할 수 있습니다. 본 연구에서는 1 - 15 kHz에서 사용되었다. 모든 푸리에 변환이 연구에서 설명하는 역 푸리에 변환은 Matlab의 FFT 및 IFFT 함수를 사용하여 계산되었다. </li><li> 적절하게 노이즈 함수의 진폭을 크기. 본 연구에서는 노이즈 함수는 노이즈 함수의 진폭을 최대로 제로가 50 또는 100 MV 것을 같은 크기를 조정했습니다. </li><li> 사용중인 수집 소프트웨어에 대한 적절한 방법을 사용하여 자극 파일을 만듭니다. Clampex 8, 먼저 적당한 헤더와 텍스트 파일을 만듭니다. 머리글 아래의 첫 번째 열에 하나의 청소를위한 시간 증가를 삽입합니다. 시간 단위는 측정에 사용되는 샘플링 간격과 같은 시간적 간격이 있어야합니다. 전압 단계 프로토콜의 각 스위프 각 시간 단계에서 원하는 정확한 전압을 삽입합니다. 이것은 노이즈 함수를 포함해야합니다. </li></ol> 2. 전압 클램프 측정을 수행 <ol><li> 이전에 생성된 자극 파일과 호환됩니다 수집 소프트웨어 내에서 측정 프로토콜을 만듭니다. Clampex에서는 사용자가 현재 프로토콜 자극 파일을 연결할 수있는 메뉴가 있습니다. </li><li> 측정 장비에 세포 모델 (또는 생물학) 연결합니다. </li><li> 예정대로 실험을 수행합니다. 제어 목적을 위해, 모든 노이즈 함수를 포함하지 정기적인 측정을 포함해야합니다. </li></ol> 3. 포스트 실험 분석 <ol><li> 개인 기록에 대한 IV 곡선을 계산합니다. 녹음이 노이즈 기능이 적용되어 안정적인 상태에있는 경우, IV 곡선은 temporally 노이즈 함수의 범위 밖 녹음의 안정 상태 부분을 사용하여 만들 수 있습니다. 녹음이 안정 상태에 있지 않은 경우, 소음 기능이 IV 곡선의 계산을 방해할 수있는 두 번째 녹음이 존재하는 노이즈 기능없이해야한다. </li><li> 녹음의 각 전압 단계에 대한 고속 푸리에 노이즈 함수를 삽입했던 녹음 부분의 변환을 계산합니다. amxn m는 FFT의 주파수의 숫자 매트릭스, 그리고 N으로 각 전압 단계에 대한 푸리에 변환을 결합하는 것은 전압 단계의 번호입니다. 이 구성에서는 행렬의 각 행이 실험의 모든 전압 단계에서 단일 주파수의 진폭을 나타냅니다. </li><li> 각 주파수 (위의 행렬의 각 행이 IE) 3.1에서 생성된 IV 곡선으로 행을 상관 관계 및 상관 계수를 기록합니다. </li><li> 높은 IV 커브와 연관 주파수를 시각화하기 위해 상관 계수 대 주파수를 플롯. DC 구성 요소는 FFT의 첫 번째 주파수에 포함된이므로이 주파수에 대한 상관 계수는 항상&gt; 0.99되어야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 대표 전압 클램프 측정은하지 않고 (그림 1A) 및 전압 단계 프로토콜에 삽입 (그림 1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. IV 곡선도 모델 세포 (그림 1C)를 계산했습니다. 각 스위프 들어, 그림 1에서 기록에서 FFT는 노이즈 함수를 삽입했던 시간 프레임 (그림 1A, 1B에 빨간색 상자 참조)를 통해 계산되었다. 그림 2A와 2B는 각각 그림 1A와 1B에 표시된 레코딩 계산 FFTs를 보여줍니다. 육안 검사시 DC 구성 요소 (빨간색으로 강조) IV 곡선의 모양을 모방하기 위해 나타납니다. 소음없는 함수, DC 위의 모든 주파수가 제로 (그림 2A) 근처 amplitudes을 가지고 나타납니다. 노이즈 함수가 삽입되면, 1 kHz에서 15 사이의 주파수는 시각적으로 눈에 띄는 amplitudes (그림 2B)를했습니다. 그림 3은 IV 곡선에 대한 전압 단계의 범위 개별 주파수 amplitudes을 연관의 결과를 보여줍니다. 그림 3A - C는 실험이 제어 조건 (없음 소음 기능)에 따라 각각 50과 100 뮤직 비디오의 노이즈 amplitudes와 함께 끝났다고 상관 계수를 보여줍니다. 모든 경우에 공지 사항, DC 구성 요소는 IV 곡선과 거의 완벽하게 연관시키는가 나타납니다. 사실, 모든 레코딩을 위해,이 주파수에 대한 상관 계수는 0.99 (R = 0.9996 ± 1E - 5, 말은 ± 표준 편차)보다되었습니다. 우리가 그림 3A (제어 조건)에 보면, 진폭 크게 IV 커브와 상호 DC 구성 요소 이외에는 주파수가 없습니다. 특히,이 주파수의 아무도는 0.5 이상의 상관 계수가 없습니다. 가장 낮은 진폭 노이즈 기능 (50 뮤직 비디오) 삽입시이 같은 주파수는 아직 0.5 이상의 상관 계수가 덜했다. 에 대한 상관 계수노이즈 진폭 100 뮤직 비디오로 증가되었을 때 SE 주파수는 0.5보다 큰이 없어요. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> . 그림 1 모델 셀 레코딩 : 전압 클램프 레코딩을하지 않고 (1A) 및 전압 단계 프로토콜에 포함 (1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. 각 스위프의 첫 번째와 지난 20 MS에 대한, 가능성이 개최 가능성 (0 MV)에서 유지되었다. 각 전압 단계 80 MS 길이었고, 소음 기능 단계의 시작 후 40 MS를 삽입했습니다. 노이즈 함수는 30 MS의 기간을했다 1 15 kHz에서 사이의 주파수가 포함되어 있습니다. 전압이 서있는 다섯 MV 단위 -150에 50 MV를 강화했다. 모델 세포에 대한 IV 곡선도 (1C) 표시됩니다. 읽기 레코딩을보다 쉽게​​하기 위해, 오직 모든 다섯째 청소는 1A 및 1B에 포함되었지만, 모든 감시 장치는 1C에 포함되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 레코딩 FFT :. FFT는 노이즈 함수 (그림 1A에 빨간색 상자 1B에 묶여 지역) 삽입하기 위해 각 스위프의 30 MS 부분에 대한 계산했다. 그림 2A와 2B는 FFTs가 각각 소음 기능없이 함께 계산 보여줍니다. 다시 한번, 명확성을 위해, 모든 다섯째 수색에서만 FFT는 그림에 포함되어 있지만, 모든 감시 장치는 앞으로 계산에 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> . 그림 3 IV 주파수 상관 관계 : 녹음의 IV 곡선 및 전압 단계의 범위에서 각각의 주파수의 진폭 사이의 상관 관계의 결과가 표시됩니다. 그림 1A - 1C는 각각 제어 조건 하에서 0에서 20 kHz에서하는 주파수에 대한 50 또는 100 MV 노이즈 기능의 존재의 상관 계수를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 IV 곡선의 재 창조 :. 모델 세포 (그림 1C와 같음) 두 주파수의 크기에 대한 IV 곡선이 겹쳐 있었다. 첫 번째 주파수는 DC 성분 (R = 0.995)이었고, 두 번째는 낮은 상관 관계 (R = 0.3212)으로 무작위로 선택된 주파수했다. 주파수 amplitudes는 IV 곡선으로 거의 같은 진폭을 축소했다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현재 나중에 각 채널 유형에 기인한다 얼마나 많은 전류 결정의 의도와 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정 연구자 방지 기술 장애가 있습니다. 때문에 이러한 제한의 이온 채널은 일반적으로 같은 전압, 전류 및 행동 잠재력을 클램프로 기술을 사용하여 개별적으로 연구하고 있습니다. 1 개별 채널 유형, heterologous 표현 시스템이 자주 사용하는 연구를합니다. 2 등 cardiomyocytes과 같은 조직에서 분리된 세포와 작업하는 경우 다른 수단은 다양한 이온 채널을 차단하는 데 사용해야합니다. 예를 들어, 나트륨 채널이 느린 depolarizing 전압 램프에 의해 inactivated 수있는 3 내향 정류 칼륨 채널은 세포 BaCl2와 차단할 수, 4, 칼슘 채널 verapamil을 사용하여 차단할 수 5. 부분적으로이 제한을 극복 사용하는 한 가지 방법은 선택적으로 적절한 에이전트 하나의 채널 유형을 차단 후 측정을 반복 동시에 다음 두 채널 유형을 통해 현재의 유량을 측정하는 것입니다. 두 측정 뺄셈 그 다음 차단했습니다 채널 유형에 전류 기인의 양을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 6 단,이 방법을 두 가지 주요 한계가 있습니다. 첫째, 화학 약품이 선택 각각의 이온 채널을 차단할 수 파악, 일부 널리 사용되는 약물은 다른 채널 유형이 아닌 구체적인 상호 작용이되지 않았습니다. 5,7 둘째, 그것은 하나의 채널이 다른가 변조 여부를이 기술에서 결정 수 없습니다 채널. 예를 들어, 우심실에서 상위 Kir 2.1 표현식이 전도 속도를 depresses 이러한, NAV 1.5 Kir 2.1의 이질적인 표현은 실험용 돼지 심실에 표시하고 있으며, 그것은 시너지 관계가 두 채널 사이에 존재하는 것을 제안했습니다. 현재 8 , 이것은 확인할 수 없습니다. 본 연구에서는, 우리는 그 임피던스 분광 동시에 측정한 여러 이온 채널 유형을 공부를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다 제안합니다. 제출 방법가 동시에 측정이 채널 유형에서 전류를 분별하는 데 사용되는 적이 있지만, 임피던스 분광은 이온 채널 기능의 다른 측면의 숫자를 연구하는 데 사용되었습니다. 굿맨 예술 현재 클램프 프로토콜이 서로 다른 주파수로 세포를 조정하도록 수정하고, transmembrane 잠재력의 oscillations가 안으로 정류 K + 채널과 칼슘 2 + 채널 사이의 상호 작용에 의한 수있는 거북이 청각 세포를 사용했다. 9 한나라와 프레 이저는 임피던스가 주파수의 넓은 범위 (100 Hz에서 5 MHz의) 이상의 단일 셀에 측정할 수 시연하고, K + 또는 칼슘 2 + 채널 차단되었습니다가 간단한 의미가 있었을 때 임피던스의 증가가 관찰 높은 처리량 약물 화면에서 채널 블록을 감지하면. 10 하야시와 피쉬맨은 내향 정류 K + 채널. 11 다른 그룹은 다른 채널 형식의 전압 클램프 프로토콜에 단일 주파수를 삽입하고 있습니다의 운동 특성을 공부하고 복잡한 도전을 사용한 것은 보여주 그 관찰 주파수 응답은 어떤 주파수 아니라 다른 사람에 대한 예상 응답 하였다. 12,13 Millonas과 Hanck 어떤 주파수는 예상 반응은 마르코프 모델에서 여러 속도 상수의 존재는 생성하지 않은 이유를 제안했습니다. 이러한 12 연구, 뿐만 아니라 다른 사람으로 임피던스 분광법을 사용하면서 이온 채널의 측정 이온 전류가 이론적으로 주파수 응답 동의하지 않는 경우가있다는 것을 증명하고있다. 본 연구에서는 메서드의 목적은 멤브레인 전기 회로의 기본 가정 독립 현재 진폭과 상관 관계 주파수를 식별할 수 있기 때문에 이것은 본 연구에서는 문제가되지 않습니다. Furtheremore는 현재의 진폭은 그들에 삽입된 모든 노이즈 함수를하지 않는 기록의 일부에서 계산됩니다. 다른 연구의 숫자는 또한 수많은 이온 채널의 현재 모델은 모두 자신의 속도 상수와 다수의 실시와 비 전도 상태를 전시. 14,15,16 톰슨 외가 KcsA 채널의 선택도 필터가 나에 대해 다른 바인딩 사이트를 가지고 것으로 나타났다 + 리가 + 및 K +, 그리고 선택도 필터를 통해 이온 이동으로 다른 하나의 구속력이 사이트에서 이동의 활기찬 비용이 채널은 우선적으로 그 구멍을 통해 K + 이온을 실시하는 이유가 무엇입니까합니다. 17 본 논문에서 우리는 범위를 삽입 전압 단계 프로토콜로 주파수 (소음 기능)과 그의 진폭 높은 전반적인 현재의 진폭과 주파수 상관 관계에 대한 보았다. 강력한 증거가 제시 제시되어 있기 때문에 여러 속도 상수는 differen을 통해 이온의 전도에 역할을t 채널, 이러한 속도 상수와 관련된 주파수의 도입은 특정 주파수가 울려 또는 높은 달리하지 않았을 현재의 진폭,와 연관시키는 원인이 될 수 있습니다. 본 연구에서 보여준 기술은 일반적으로 전압 클램프 회로 및 수집 장비를 테스트하는 데 사용되는 병렬 RC 회로는 모델 세포에 수행됩니다. 이것은 DC 이외의 모든 주파수가 현재의 크기와 연관 것이라고 예상하고, 이것은 우리가 데이터에 표시됩니다. 우리는 또한 노이즈 함수의 또한 어떤 주파수가 높은 현재의 진폭와 연관시키는 원인이 아니라고 표시됩니다. 그들은 측정 장비와 소음 기능 어​​떤 주파수는 현재 진폭와 연관시키는 원인이 스스로하지 표시하기 때문입니다이 두 연구 결과는 중요합니다. 미래 연구 이온 채널을 포함하는 세포막을 사용하여 측정을하면, 그것은 사용하는 채널에 따라 선택도 필터 또는 아마도 구멍에서 속도 상수에 해당하는 주파수는 채널의 주파수 응답에 영향을하고 주파수가 높은 갖고있는 영향을 미칠 것이다 것으로 기대된다 현재 진폭 또는 낮은 상관 관계. 이 방법은 이온 채널을 연구하기위한 새로운 기술이기 때문에, 미래의 연구 방향에 따라 수의 숫자가있다. 첫째, 기술은 특정 격리 채널의 주파수 응답을 특성화하는 데 사용해야합니다. 추가 작업은 또한 현재 amplitudes에 주파수 amplitudes를 보정하기 위해 완료해야합니다. 여러 채널을 개별적 특징되면, 다중 채널 형식은 동시에 측정해야합니다. 이 기술은 또한 잠재적인 행동 클램프, 현재 클램프 및 현장 자극 연구에 사용하기 위해 적응 수 있습니다. 이 새로운 기술이지만, 그것은 이전에 불가능했다 electrophysiological 측정하고 이온 채널의 생리적 역할에 가치있는 새로운 통찰력을 제공하는 강력한 방법이 될 수 있습니다 무엇 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>해당 없음</td><td>Natick, MA</td></tr><tr><td>Clampex 8</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 8</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>적분형 패치 클램프 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>헤드스테이지</td><td>Molecular Devices</td><td>CV202</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>16비트 데이터 수집 시스템</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>모델 세포</td><td>Molecular Devices</td><td>Patch 1 모델 세포</td><td>Sunnyvale, CA</td></tr></tbody></table>

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 iv 곡선의 재현부

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

소개 : 현재, 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정하고 각 채널 유형에 기인 일부로 측정된 전류를 분해 할 정해진 방법이 없습니다. 이 연구는 임피던스 분광가 높은 전압 클램프 실험 기간 동안 측정된 정상 상태 전류 진폭와 연관 특정 주파수를 식별하는 데 사용될 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 방법은 전압 단계 프로토콜에 특정 주파수를 포함하는 노이즈 함수를 삽입이 포함됩니다. 제출 작품에서 모델 세포는 더 높은 상관 관계가 더 이온 채널이 존재없는 경우 소음이 기능 자체가 높은 상관 관계를 소개하지 않습니다 또한 전압 클램프 회로에 의해 도입하지 않으며는 것을 입증하는 데 사용됩니다. 기술은 이온 채널을 포함하는 준비를 적용하기 전에이 유효성 검사가 필요합니다. 제출 프로토콜의 목적은 노이즈 함수에 단일 이온 채널 형식의 주파수 응답을 특성화하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 특정 주파수가 개별 채널 유형 확인되고 나면, 그들은 정상 상태 전류 전압 (IV) 곡선을 재현하는 데 사용할 수 있습니다. 높은 하나의 채널 유형 상관 관계와 최소한 다른 채널 유형과 상관 관계 주파수는 다음 동시에 측정 다중 채널 형식의 현재의 기여를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 방법 : 전압 클램프 측정은 표준 전압 단계 프로토콜 (-150에 50 뮤직 비디오, 5mV 단계)을 사용하여 모델의 세포에서 수행되었다. 1-15 kHz에서 주파수 (최대 amplitudes에 제로 : 50 또는 100mV)의 동등 magnitudes를 포함하는 노이즈 함수는 각 전압 단계에 삽입되었다. 출력 신호의 고속 푸리에 변환 (FFT)의 실제 구성 요소와 각 단계에 잠재력에 대한 잡음없이 계산했다. 전압 단계의 함수로 각 주파수의 크기는 해당 전압에서 전류 진폭과 상관했다. 결과 및 결론 : 소음이없는 (제어), DC 구성 요소를 제외한 모든 주파수의 magnitudes 상관이 저조한 (| R | &lt;0.5) IV 곡선과 DC 구성 요소가 모든 측정에서 0.999 이상의 상관 계수를했다 반면. 노이즈 기능이 전압 단계 프로토콜에 추가되었을 때 각각의 주파수와 IV 곡선 사이의 상관 관계의 품질은 변경되지 않았다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 진폭을 증가하면 상관을 증가하지 않았다. 제어 측정 자체적으로 전압 클램프 회로가 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 높은 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 존재에 측정 노이즈 기능이 더 이온 채널이 존재없는 경우 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 검증을 바탕으로, 방법은 지금 amplitudes 해당 채널의 유형과 특별히 상관 관계 식별 주파수의 목적으로 단일 이온 채널 유형을 포함하는 준비를 적용할 수 있습니다.

가 동시에 여러 이온 채널을 통해 전류 흐름을 측정하는 기술적인 장애가되며, transmembrane 전류 이후 안목 어떤 부분은 각 채널의 종류에 의한 것입니다. 이 필요를 해결하기 위해,이 방법은 특정 주파수 구성 요소를 사용하여 개별 채널 유형의 IV 곡선을 생성하는 방법을 보여줍니다.

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

서론: 현재로서는 여러 종류의 이온 통로를 동시에 측정하고, 측정된 전류를 ...로 분해할 수 있는 확립된 방법이 없습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 여러 유형의 이온 채널을 통해 흐르는 전류 플럭스를 동시에 측정하기 위해 이온 채널의 주파수 응답 특성을 분석하는 기술을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 전압 단계 프로토콜에 포함될 노이즈 함수를 생성하고 이를 자극 파일에 통합하는데, 이는 clamp X 소프트웨어에서 사용자 정의 파형을 사용하기 위해 필수적인 과정입니다. 절차의 두 번째 단계는 방금 생성한 전압 단계 프로토콜을 표준 전세포 전압 클램프(whole cell voltage clamp) 기술을 사용하여 모델 세포에 적용하고 그 결과로 발생하는 전류를 기록하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 세포의 IV 곡선과 노이즈 함수가 포함된 각 스윕(sweep) 부분의 FFT를 계산하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 모든 전압 단계에서 각 주파수의 진폭을 해당 세포의 IV 곡선과 개별적으로 상관 분석하는 것입니다. 결과에 따르면 모델 세포의 IV 곡선과 높은 상관관계를 보이는 주파수는 없는 것으로 나타났습니다. 표준 전세포 전압 클램프와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 약리학적 차단제나 활성화 프로토콜의 전압을 사용하지 않고도 한 번에 두 가지 이상의 이온 채널 유형을 측정할 수 있는 수단을 제공할 수 있다는 점입니다.이 방법은 동일한 조직 내에서 한 종류의 이온 채널 발현 수준이 다른 이온 채널 종류의 활성에 어떠한 영향을 미치는지와 같은 이온 채널 생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 원하는 주파수 성분을 포함하는 노이즈 함수를 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 주파수 영역에서 원하는 주파수 성분을 정의하십시오.본 연구에서는 1에서 15 kHz 사이의 주파수 성분을 사용합니다. 그 후, MATLAB의 IFFT 함수를 사용하여 역 고속 푸리에 변환을 계산함으로써 선택한 주파수를 시간 영역으로 변환하고, 이어서 노이즈 함수의 진폭을 적절하게 조정합니다.본 연구에서는 노이즈 함수를 두 번 스케일링하는데, 첫 번째는 노이즈 함수의 제로-피크 진폭이 50 millivolts가 되도록 하고, 두 번째는 제로-피크 진폭이 100 millivolts가 되도록 합니다. 다음 단계는 matlab과 같은 프로그램을 사용하여 자극 파일을 생성하는 것입니다. 자극 파일은 clamp X eight 획득 소프트웨어에 매 시점마다 어떤 전압을 사용해야 하는지 정확히 알려주는 헤더가 포함된 텍스트 파일입니다.먼저 자극 파일을 생성하려면, 적절한 헤더가 포함된 텍스트 파일을 만들고 헤더 아래 첫 번째 열에 단일 스윕에 대한 시간 증분을 삽입하십시오. 이때 시간 증분은 측정에 사용된 샘플링 간격과 동일한 시간 간격을 가져야 합니다. 본 프로토콜에서는 200 kilohertz 샘플링 속도를 사용합니다. 각 스윕에 대해, 각 시간 단계에서 원하는 정확한 전압을 삽입하십시오.각 열은 개별 스윕으로 간주되므로, -150 mV에서 +50 mV까지 5 mV 증분으로 단계별 진행하는 프로토콜의 경우 시간 열 뒤에 41개의 열을 추가해야 합니다. 지정된 전압에는 clamp X의 노이즈 함수가 포함되어야 합니다. 각 실험에 대해 프로토콜을 생성해야 하므로, 다음 단계는 이전에 생성된 자극 파일과 호환되는 측정 프로토콜을 만드는 것입니다. clamp X에서 자극 파일을 현재 프로토콜과 연결할 수 있는 acquirer edit protocol wave zero 메뉴 옵션을 선택하십시오.다음 단계는 세포에 정의된 자극을 가하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 병렬 RC 회로를 가진 모델 세포를 사용합니다. 모델 세포를 측정 장비에 연결하고, 기록 버튼을 클릭한 후 X 클램프를 수행하십시오.이 실험은 대조군 목적을 위해 계획되었습니다. 데이터 수집 후, 노이즈 함수가 포함되지 않은 주기적 측정값을 반드시 포함시키십시오. 다음 단계는 IV 곡선을 생성하고 고속 푸리에 변환(fast fourier transforms)을 수행하는 것입니다. 개별 기록에 대한 IV 곡선을 계산하려면, 노이즈 함수의 시간적 범위 밖에 있는 기록의 정상 상태(steady state) 부분을 사용하여 전류 진폭을 측정하십시오.노이즈 함수가 적용될 때 기록 상태가 정상 상태(steady state)가 아니면, 노이즈 함수가 IV 곡선 계산을 방해할 수 있으며, 이 경우에는 대조군 기록을 사용해야 합니다. 기록 내 각 전압 단계에 대한 IV 곡선을 계산하는 대신, 노이즈 함수가 삽입된 기록 부분의 FFT를 계산하십시오. 각 전압 단계의 푸리에 변환 결과들을 M × N 행렬로 결합하며, 여기서 M은 FFT의 주파수 수이고 N은 해당 구성의 전압 단계 수입니다.행렬의 각 행은 실험의 모든 전압 단계에서 단일 주파수의 FFT 진폭을 나타냅니다. 다음 단계는 각 주파수에 대한 상관계수를 계산하는 것이며, 해당 행을 이전에 생성한 IV 곡선과 상관 분석합니다. 상관계수를 기록하십시오.다음으로, IV 곡선과 높은 상관관계를 보이는 주파수를 시각화하기 위해 상관계수 대 주파수 그래프를 생성합니다. 여기에는 노이즈 함수를 삽입하지 않은 전압 클램프 측정 결과가 나타나 있습니다. 각 스윕의 처음과 마지막 20밀리초 동안 전위는 0밀리볼트의 유지 전위로 유지되었습니다.그 사이 전압은 -150 mV에서 +50 mV까지 5 mV 증분으로 단계적으로 변화되었습니다. 각 전압 단계의 길이는 80 ms였으며, 그림의 가독성을 높이기 위해 매 다섯 번째 스윕(sweep)만 그림에 포함하였습니다. 빨간색 상자는 이러한 스윕에 노이즈 함수가 적용되었다면 어느 시점에 적용되었을지를 나타냅니다.이 그림은 이전 그림과 유사하지만, 전압 단계 프로토콜 시작 40 milliseconds 후에 노이즈 함수가 삽입되었으며, 빨간색 상자는 노이즈 함수가 삽입된 위치를 나타냅니다. 노이즈 함수의 지속 시간은 30 milliseconds였으며, 1에서 15 kilohertz 사이의 주파수를 포함했습니다. 이 그림은 모델 세포에 대해 계산된 IV 곡선을 보여줍니다.모델 셀이 단순한 병렬 RC 회로이므로, 이 IV 곡선은 선형으로 나타나며 이는 예상된 결과입니다. 이 그림은 각 스윕(sweep)에 대해 노이즈 함수를 제외한 FFT 결과를 보여줍니다. 모델 셀 기록에서 FFT는 노이즈 함수가 삽입된 시간 범위에 대해 계산되었습니다.빨간색으로 강조 표시된 DC 성분은 IV 곡선의 형태를 모방하는 것으로 보입니다. DC 이상의 모든 주파수는 진폭이 0에 가까운 것으로 나타나며, 명확성을 위해 매 다섯 번째 스윕의 FFT만 그림에 포함하였습니다. 삽입된 노이즈 함수가 포함된 기록에 대해 FFT를 계산하면, 1~15 kHz 사이의 주파수에서 눈에 띄는 진폭이 나타납니다. 전압 클램프 실험에서는 일반적으로 나타나지 않는 이러한 고주파 성분의 존재는, 이들 주파수 중 어느 하나의 크기가 전류 진폭에 비례하여 변화하는지에 대한 의문을 제기합니다.다음 세 개의 그림은 개별 주파수의 진폭과 기록된 IV 곡선 사이의 상관 계수를 보여줍니다. 첫 번째 그림에서는 노이즈 함수를 사용하지 않았습니다. 두 번째 그림에서 노이즈 함수의 피크 진폭은 50 millivolts였으며, 세 번째 그림에서 노이즈 함수의 피크 진폭은 100 millivolts였습니다.모든 경우에 DC 성분, 즉 0 Hz에서의 응답은 상관 계수가 0.99보다 크며, 따라서 IV 곡선과 거의 완벽하게 상관관계가 있는 것으로 나타남에 유의하십시오. 또한, 세 가지 그림 모두에서 다른 주파수 중 상관 계수가 0.5보다 큰 경우는 없었다는 점에 주목하십시오. 아울러, 50 또는 100 mV 진폭의 노이즈 함수를 삽입하더라도 이러한 패턴은 변하지 않았습니다.이러한 결과는 전압 클램프 회로와 노이즈 함수 자체가 IV 곡선에 높은 상관관계를 유도하지 않음을 나타냅니다. 이 검증은 이온 채널을 포함하는 표본에 이 기술을 적용하기 위해 중요합니다. 이 그림은 두 세트의 주파수 데이터에서 상관관계의 존재 여부를 보여주기 위해 IV 곡선을 재구성한 것입니다.이 그림에서 actual IV로 표시된 모델 셀의 IV 곡선은 빨간색 점선 위에 겹쳐져 보이는 점선입니다. 빨간색 점선은 DC 성분을 나타내며, actual IV 선과 0.995의 상관계수를 가집니다. 세 번째로 표시된 톱니 모양의 곡선은 무작위로 선택된 4.399 kilohertz의 주파수를 나타내며 상관관계가 낮습니다.이 직선과 IV 곡선 간의 상관 계수는 0.3212입니다. 이러한 결과는 측정 장비와 노이즈 함수 자체가 전류 진폭과 상관관계가 있는 주파수를 유발하지 않음을 보여줍니다. 본 검증을 바탕으로, 전압 클램프 실험 중 전압 단계에 노이즈 함수를 삽입하는 여기서 제시된 방법은 단일 이온 채널 유형을 포함하는 막 표본에 먼저 적용하고, 이후 여러 채널 유형을 포함하는 표본에 적용할 수 있습니다. 단일 이온 채널 실험 결과는 여기서 제안한 FFT 및 상관 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.이 분석은 진폭이 특정 채널 유형과 구체적으로 상관관계가 있는 주파수를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 서로 다른 채널을 통한 이온 전도에 여러 속도 상수가 관여한다는 강력한 증거가 제시되었습니다. 따라서 주파수가 식별되면, 해당 주파수는 하나의 채널 유형과는 높은 상관관계를 보이고 다른 채널 유형과는 최소한으로 상관관계가 있습니다.이러한 빈도를 사용하여 이 절차에 따라 동시에 측정된 여러 채널 유형의 현재 기여도를 추정할 수 있습니다. 이온 채널이 차단되거나 비활성 상태일 때 채널의 주파수 응답이 어떻게 작동하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 약리학적 차단 및 프리펄스(pre pulse)와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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