Name: Microscale 열 대류를 사용하여 신속한 PCR의 Thermocycling (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 열 대류를 활용한 신속 PCR 열사이클링 방법을 통해 DNA 증폭 효율을 높이는 기술을. 반응기 기하학과 CFD 시뮬레이션을 통해 최적의 흐름 패턴을 설계하여 생명공학 연구에 활용하세요.

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우리는 기꺼이 기술 지원 그리고 많은 도움이 토론에 대한 Lynntech 주식 회사에서 T. Ragucci, B. 왓킨스, S. 웡 및 B. Wallek 감사드립니다. 이 작품은 부여 CBET - 0,933,688 아래에있는 미국 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원되었다.

1. 대류 Thermocycler의 기본 설계 <ol><li> 우리는 누구의 온도 독립적으로 (그림 2) 7 제어 두 알루미늄 플레이트 사이에 끼워 넣으면 아르 호환 플라스틱 반응 챔버 "카트리지"로 구성된 간단한 대류 thermocycling 장치를 건설했습니다. </li><li> 원통형 반응기 우물은 구멍 직경하고 원하는 가로 세로 비율 (높이 / 지름 = H / D) 달성을 채용 플라스틱 시트 두께의 다른 조합과 폴리 카보 네이트 블록의 구멍 가공 배열에 의해 포함됩니다. 두 가지 다른 원자로 형상은 여기 제시 결과에 간주됩니다 : H / D = 9 : H = 15.9 mm, D = 1.75 mm, 38.2 μL 볼륨, H / D = 3 : H = 6.02 mm, D = 1.98 mm, 18.5 μL 볼륨. </li><li> 반응기의 바닥 표면은 microprocesser 구동 온도 컨트롤러와 인터페이스 카트리지 히터를 포함하는 알루미늄 블록을 사용하여 가열합니다. </li><li> 반응기의 상단 표면에 온도는 순환 물을 욕조에 연결된 알루미늄 블록을 사용하는 규제이다. </li><li> 온 회중은 반대 알루미늄 블록 사이의 열전도를 제한하는 나일론 나사를 사용하여 서로 고정되어있다. </li></ol> 2. 준비 및 PCR 반응 혼합물의 로딩 <ol><li> 전형적인 100 μL 반응 혼합물은 10X 버퍼 용액, 25 MM 6 μL의 10 μL를 포함 MgCl 2, dNTPs 10 μL (2 MM 각), DI 물, β - 굴지 프로브 10 μL, β 10 μL의 41.2 μL - 굴지 앞으로의 뇌관, β - 굴지의 역방향 프라이머 10 μL, 인간 게놈 DNA 템플릿 (10 NG / μL) 2 μL 및 KOD DNA의 효소 (2.5 단위 / μL)의 0.8 μL. </li><li> 시약을 로딩하기 전에, 알루미늄 테이프 얇은 시트를 사용하여 PCR 챔버의 바닥 표면을 밀봉. </li><li> 비 - X 안티 - 안개 뒤에 소 혈청 알부민의 10 MG / ML 수용액으로 원자로 우물 린스. </li><li> 피펫 긴 젤 - 로딩 피펫 팁을 사용하여 반응기 우물에 시약 및 FEP 테플론 테이프 상부 표면을 밀봉. </li></ol> 3. 대류 Thermocycler의 반응을 실행 <ol><li> 원하는 위턱과 아래턱에 표면 온도에 대한 반응, 앞서 열을 가하다 알루미늄 블록을 모두 시작하기 전에. </li><li> 샌드위치는 플라스틱 원자로는 알루미늄 가열 블록 사이의 PCR 시약과 함께로드하고, 신속하게 나일론 나사를 사용하여 함께 어셈블​​리를 클램프. </li><li> 반응이 원하는 시간에 진행 후 히터를 끄고 급속하게 그것을 냉각하고 대류 흐름을 막을 차게 금속 블록의 상단에있는 장치의 낮은 (뜨거운) 표면을 놓으십시오. </li><li> 플라스틱 원자로를 제거하고 후속 분석을 위해 우물 (긴 겔 로딩 도움말을 사용)의 제품을 피펫. </li></ol> 4. 젤 전기 영동 분석을 수행 <ol><li> 솔루션은 분명해진다 때까지 감동 뜨거운 접시에 1X 버퍼 500 ML와 아가로 오스의 10g을 가열하여 2 % 아가로 오스 겔 WT를 준비합니다. </li><li> 캐스팅 트레이에 아가로 오스 겔을로드하고 빗를 삽입합니다. ~ 30 분 젤 세트를 보자. </li><li> 빗를 제거하고 젤이 변할 때까지 1X 태 버퍼를 추가합니다. </li><li> 찬란 스테인드 DNA 샘플 2 μL 100x SYBR 그린 I 솔루션, 2 μL DNA 샘플, 2 μL 배의 오렌지 로딩 염료, 4 μL 태 버퍼가 포함되어 있습니다. </li><li> 우물에 DNA 샘플을 추가하고 100 BP의 DNA 사다리 사이징 마커 1 H 60 V의 분리를 실행합니다. </li><li> 젤을 제거하고 결과를 얻기 위해 자외선 밑에 사진. </li></ol> 5. 대표 결과 : 대류 thermocyclers의 최적 설계 PCR 과정에 참여의 핵심 온도를 통해 시약을 수송 수있는 순환 흐름을 생성합니다 올바른 원자로 지오메 트리를 선택 포함됩니다. 여기에 고려 원통형 원자로에서 변경될 수있는 기하학적 매개 변수는 높이 (H)와 직경 (D), 또는 equivalently 비율 (H / D)입니다. 우리는 내부 전산 유체 역학 (CFD)을 사용하여 서로 다른 가로 세로 비율의 범위에서 PCR 반응 대류 3 - D 흐름 필드를 탐험하고, 예기치 않게 복잡한 패턴이 발생할 수 것으로 나타났습니다. 더 중요한 건, 우리의 분석은 크게 반응 12 가속 이러한 복잡한 유동 분야의 일부를 발견했습니다. 이러한 기하학적인 효과는 분명하게 높고 낮은 가로 세로 비율에서 반응기의 흐름 필드를 비교하여 볼 수 있습니다. 높은 비율의 경우에는 (H / D = 9; 키, 마른 체형의 실린더), 유체 요소는 기본적으로 루프를 폐쇄 경로를 추적 궤도를 따라 advected 있으며, 그들은 오랜 기간 동안 동일한 경로를 따라 잠겨있다 시간 (그림 3A). 따라서, F 사이의 교환을위한 약간의 기회가 있습니다PCR (어닐링과 반응의 상단 및 하단 표면에 극단을 denaturing 사이 진동)과 (중앙에 가까이화된 증폭에 기여하지 남은 궤도의 훨씬 더 큰 앙상블을위한 온도 조건을 최적의 순서에 시약을 노출 낮은 궤도 원자로의). 유체 요소의 탄도는 더 이상 닫힌 경로 (그림 3B)을 따라 그 의미에 더 혼란되고; 흐름 필드는 작은 비율 (짧고, 넓은 실린더 H / D = 3)에서 많은 차이가 있습니다. 따라서 시약은 더 복잡한 온도 프로파일의 대상에도 불구하고, 유체 요소는 시약 볼륨의 이상이 최적의 온도 프로파일을 경험할 수있는 기회를 가지고 있도록 궤도의 훨씬 넓은 범위를 탐험하실 수 있습니다. 이러한 결과는 counterintuitively H / D에서 동시에 각각의 흐름 궤도가 = 9 온도 프로파일을 제작하여 PCR에 대한 더 유리한 것으로 나타날 수 있습니다하는 것이 좋습니다되는 종래의 thermocycler / H에서 유동 분야의 혼란 자연 속에서 고용 비슷한 "모양" D = 3 궁극적으로 시약이 매우 오래 불리 궤도에 갇혀있다가하지 않도록 강화된 교류를 촉진하여 세계적인 규모로 역할을 하죠. 이 가설을 테스트하고 원자로 기하학은 PCR에 대한 더 유리한되었던 확인하려면, 우리는 인간 게놈의 DNA 템플릿에서 β - 굴지의 유전자와 관련된 295 BP 대상의 PCR 복제를 수행하는 둘 다를 사용합니다. 현저하게, 우리는 정기적으로 H에서만 10 분에 올바른 대상 제품의 증폭을 달성 / D 감지 제품 전에 최소한 20 분 필요 같은 반응은 H / D에서 관찰하는 동안 = 3 (그림 4A) = 9 (그림 4B) . 반응 특이성도 H에 훨씬 큰 / D = 3 어디서 여러 특이 현상이 제품은 H에 생성되는 동안 단일 PCR 제품이, 얻은 것입니다 / D = 9 어디 흐름 필드 트랩 오랜 기간 동안 불리한 열됐던 유체 요소. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 상단 및 하단 표면 원통형 챔버에서 열 대류는 다른 고정 온도에서 유지됩니다. 바닥 표면의 온도가 상단에보다 높은 경우, 수직 밀도 기울기는 순환 흐름 패턴을 생성할 수있는 동봉된 유체 내에 설립. 기하학적 매개 변수 (높이 H와 직경 D)의 올바른 선택을 통해 대류 흐름 필드가 위쪽과 아래쪽 표면이 각각 온도 (중력이 수직 하향 행위) 소둔 및 denaturing 근처 manintained 때 PCR의 thermocycling을 행동시키다을 무력화 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. (A) 대류 흐름의 주요 구성 요소가 PCR thermocyler. 원자로 카트리지는 원통형 챔버의 배열을 포함하는 폴리 카보 네이트 블록으로 구성되어 있습니다. 블록 순환 물 목욕 및 임베디드 히터를 통합 하단 플레이트에 연결하도록 설계된 최고의 접시 사이에 끼워 넣으면됩니다. (B) PCR의 시약은 장치가 반응을 수행하기 위해 조립하는 후, 로드된 및 원자로 카트리지 내부에 봉인하고 있습니다. 완료되면, procucts 쉽게 후속 분석을 위해 밖으로 pipetted 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 53과 96 온도와 원통형 반응기 내부에 생성되는 3 - D 대류 유동 분야의 전산 시뮬레이션 ° C 각각의 상단 및 하단 표면에 내려졌다. 결과의 가로 세로 비율에 표시됩니다 (A) H / D = 9 (38.2 μL 원자로 볼륨) 및 (b) H / D = 3 (18.5 μL 원자로 볼륨). 3D 흐름 필드를 통해 여행 유체 요소로 다음 대표 궤도가에 표시되는 경로의 - 상단과 측면보기 예측과 함께 왼쪽, 유체 요소에 다음과 같은 온도 대 시간의 해당 플롯은 오른쪽에 표시됩니다. H / D = 9시 온도 프로파일은 종래의 thermocycler의 가까이에 나타나지만, H / D = 3에서 혼돈 흐름 필드는 PCR에 대한 counterintuitively 더 유리한 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. DNA 복제 그림 3 (표면이 각각 53과 96 ° C로 유지되었다 상단과 하단)에 표시된 반응기 형상에서 얻어진 결과를. (A) PCR은 크게 반응 시간을 불과 10 분 (: 100 BP의 사다리, 차선 1-4 : 4 개의 원통형 실에서 병렬 반응의 제품 M) 이후에 보이는 강한 제품으로 분명, H / D = 3 가속됩니다. (B H / D = 9시 공연 같은 반응은 적어도 20 분이되어 있어야하고, 여러 밴드가 원하는 제품 이외에 불특정 대상의 DNA 명백히 나타내는 복제 아르 : 100 BP 사다리, 레인스 1-2 : 2 다른 원통형 실에서 병렬 반응의 제품).

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

유동 및 화학 반응 사이의 상호 작용은 혼란 advection의 영향에 따라 크게 변경할 수 있습니다. 그러나 이러한 복잡한 흐름 상태는 특히 3D 효과가 중요 해지고 현실적인 형상에서 공부를 도전하고 있습니다. H에서 레일리 - 버나드의 대류 / D&gt; 1뿐만 아니라 이러한 현상을 탐험하는 편리한 플랫폼을 제공, PCR을 수행하기 위해 응용 프로그램은 또한 탐지하는 흐름과 화학 반응 사이의 커플링을 수 있습니다. 이 독특한 기능은 가능한 혼란 효과 행위 (counterintuitively) DNA 복제의 속도를 가속하기 위해 최적의 흐름 상태를 선택할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA 중합효소 키트</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan &amp;#946;-actin 대조군 시약 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 테이프</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X 안티포그</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>롱 겔 로딩 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>FEP 테플론 테이프</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>TAE 전기영동 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>6x 오렌지 로딩 다이</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 래더 크기 측정 마커</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale 열 대류를 사용하여 신속한 pcr의 thermocycling

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

많은 분자 생물학의 assays가 감지 농도 수준에 초기 희석 대상의 DNA 샘플을 증폭하는 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 어떤 식으로든 따라 달라집니다. 그러나 기존의 PCR의 thermocycling 하드웨어의 설계는 주로 그의 온도 열전 히터에 의해 규제되어 심각하게 달성 반응 속도 1 제한 대규모 금속 가열 블록을 기반으로. 상당한 전력 또한 휴대용 형식으로이 악기를 배포할 수있는 능력을 제한, 반복 열 및 시약 혼합물을 냉각이 필요합니다. 열 대류는 이러한 한계를 극복에게 2-9으로 잠재력을 가진 유망 대체 thermocycling 접근 방식으로 부상했다. 대류 흐름은 장식과 다채로운 용암 램프에 지구의 대기, 바다, 인테리어,에 이르기까지 설정의 다양한 배열에서 매일 발생하고 있습니다. 유체 운동은 각각의 경우에 같은 방법으로 시작됩니다 부력 중심 불안정 액체가 국한 볼륨 공간의 온도 기울기의 대상이되었을 때 발생합니다. 이 같은 현상은 PCR의 thermocycling을 수행하는 매력적인 방법을 제공합니다. 적절하게 설계된 원자로 기하학에 걸쳐 정적 온도 기울기를 적용함으로써, 지속적인 순환 흐름이 반복, denaturing 어닐링과 반응 (그림 1)의 확장 단계와 관련된 온도 영역을 통해 PCR 시약의 수송을 것입니다 설정할 수 있습니다. Thermocycling 따라서 완전히 반복 열 및 악기를 냉각하지 않아도, 간단하게 고정 온도에서 두 대립 표면을 개최하여 의사 등온 방식으로 actuated 수 있습니다. 대류 thermocyclers의 디자인을 직면하고있는 주요 과제 중 하나는 정확하게 시약은 순차적으로 시간 10,11의 충분한 기간 동안 정확한 온도 영역을 차지할 수 있도록 원자로 내의 공간 속도 및 온도 배포판을 제어하기 위해 필요합니다. 여기 microscale 대류 thermocyclers 12 전체 3 - D 속도 및 온도 배포판을 탐사하기위한 노력의 결과를 설명합니다. 예기치 않게, 우리는 시약 최적의 온도 프로파일의 전체 범위를 샘플 수있는 향상된 기회를 제공하는 흐름 경로 사이에 (1) 지속적인 교류의 시너지 조합에 의한 PCR을위한 매우 유리한 아르 복잡한 유동 궤도의 하위 집합을 발견하고, (이 2) 증가 시간은 PCR의 단계를 제한 확장 온도 영역 내에서 속도를 보냈다. 매우 빠른 DNA를 증폭 시간 (10 분 이하) 이러한 흐름을 생성하기위한 원자로에서 달성하고 있습니다.

우리는 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해 DNA의 복제를 수행하는 소설 방법을 설명합니다. 열 대류는 일정한 온도에서 반응기의 표면에 반대 유지하여 denaturing 소둔 및 확장 조건 사이의 지속적인 셔틀 시약을 무력화합니다. 이것은 본질적으로 단순한 디자인은 신속한 PCR 더 접근할 수 있도록 약속드립니다.

Microscale 열 대류를 사용하여 신속한 PCR의 Thermocycling

많은 분자 생물학 분석법은 초기 농도가 낮은 표적 DNA 샘플을 검출 가능한 수준으로 증폭시키기 위해 어떤 방식으로든 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의존합니다.

이 절차의 전체적인 목적은 열대류에 의한 PCR 열 순환(Thermocycling) 원리를 실제 반응에 어떻게 적용할 수 있는지 보여주는 것입니다. 이는 먼저 자연 대류 열 순환의 작동 방식과 기본 설계 원리에 대한 개념을 소개함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 반응기 카트리지를 준비하고 내부에 시약을 로딩하는 방법을 보여주는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 리액터 카트리지를 히터 유닛에 조립하고 반응을 진행하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 반응 후 시약을 제거하고 겔 전기영동으로 결과를 확인하는 것입니다. 최종적으로, 자연 대류 PCR 열 순환을 통한 신속한 DNA 복제를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, Texas A&M University의 UGAs 연구실 소속 Radha OU입니다. 오늘은 라바 램프와 같은 자연 대류를 이용한 신속 PCR 열순환(Thermocycling) 수행 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 원리를 활용하는 열순환 장치의 설계 및 최적화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작하겠습니다. 본 프로토콜은 간단한 대류식 열순환 장치의 설계 및 제작부터 시작합니다. 본 시연에 사용된 장치는 온도가 독립적으로 제어되는 두 개의 알루미늄 플레이트 사이에 끼워지는 교체 가능한 플라스틱 반응 챔버 카트리지로 구성됩니다.원하는 종횡비를 달성하기 위해 전체 직경과 플라스틱 시트 두께의 다양한 조합을 사용하여 폴리카보네이트 블록에 구멍 배열을 가공함으로써 원통형 반응기 웰을 삽입하였습니다. 최적의 설계에는 PCR 과정에 관여하는 주요 온도 구간을 통해 시약을 운송할 수 있는 순환 흐름을 생성할 수 있는 적절한 반응기 기하학적 구조를 선택하는 것이 포함됩니다. 여기서 고려된 원통형 반응기에서 변경 가능한 기하학적 매개변수는 높이와 직경, 또는 이와 동일한 종횡비입니다.반응기의 바닥면은 마이크로프로세서 구동 온도 조절기와 연결된 카트리지 히터가 포함된 알루미늄 블록을 사용하여 가열합니다. 반응기 상단 표면의 온도는 재순환 수조에 연결된 알루미늄 블록을 사용하여 조절합니다. 전체 어셈블리는 대향하는 알루미늄 블록 간의 열전도를 제한하기 위해 나일론 나사로 함께 고정됩니다.10배 농축 완충액, 25 millimolar 염화마그네슘, 두 종류의 dNTP, 증류수, beta actin 프로브, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 인간 게놈 템플릿 DNA 및 K-O-D-D-N-A 중합효소를 혼합하여 100 µL 분량의 PCR 반응액을 각각 준비합니다. 시약을 넣기 전, 알루미늄 테이프의 얇은 시트로 PCR 챔버의 바닥면을 밀봉하고, 10 mg/mL 농도의 소 혈청 알부민 수용액으로 반응조 웰을 헹군 후 Rain-X 안티포그 처리를 합니다. 마지막으로 겔 로딩 팁을 사용하여 반응조 웰에 시약을 분주하고 FEP 테플론 테이프로 윗면을 밀봉합니다.반응을 시작하기 전, 두 알루미늄 블록을 원하는 상단 및 하단 표면 온도로 예열하십시오. PCR 시약이 충전된 플라스틱 반응기를 알루미늄 가열 블록 사이에 끼우고, 나일론 나사를 사용하여 어셈블리를 빠르게 고정하십시오. 원하는 시간 동안 반응이 진행되면 히터를 끄고, 장치의 하단 가열면을 냉각된 금속 블록 위에 올려 신속하게 냉각시켜 대류 흐름을 중단시키십시오.플라스틱 리액터를 제거하고 후속 분석을 위해 웰에서 생성물을 피펫으로 옮깁니다. 10g의 agarose를 500mL의 1× 버퍼와 함께 교반 가열판 위에서 용액이 투명해질 때까지 가열하여 2% agarose 겔을 준비합니다. agarose 겔을 캐스팅 트레이에 붓고 콤을 삽입합니다.겔이 약 30분 동안 굳도록 둡니다. 콤을 제거하고 겔이 잠길 때까지 1배 TAE buffer를 추가합니다. 100배 cyber green 2 µL를 사용하여 형광 염색된 DNA 샘플을 준비합니다.DNA 샘플 2 µL, 6배 농축 오렌지 로딩 다이 2 µL, TAE 버퍼 4 µL를 혼합합니다. 100 base pair DNA ladder 사이즈 마커와 DNA 샘플을 겔의 웰에 로딩합니다. 60 V에서 1시간 동안 겔 전기영동을 수행하여 DNA를 분리합니다.젤을 꺼내어 UV 광선 아래에서 촬영하여 결과를 확인합니다. 대류식 PCR 반응기 내부의 3D 유동장은 전산 유체 역학(CFD)을 이용하여 다양한 종횡비 범위에서 조사되었습니다. 이 데이터는 복잡한 패턴이 나타날 수 있으며, 이러한 복잡한 유동장의 일부가 반응 속도를 상당히 가속화할 수 있음을 보여주었습니다.이러한 기하학적 효과는 높은 종횡비와 낮은 종횡비를 가진 반응기의 유동장을 비교함으로써 명확하게 확인할 수 있습니다. 유체 요소들은 궤적을 따라 영향을 받으며, 기본적으로 폐쇄 루프 형태의 경로를 그리게 되어 장기간 동일한 경로를 따라 고정됩니다. 결과적으로, 시약을 PCR을 위한 최적의 열 조건 순서에 노출시키는 유동 궤적과 증폭에 기여하지 않는 훨씬 더 많은 나머지 궤적들 사이의 교환 기회가 거의 없게 됩니다.종횡비가 더 작을 때 유동장은 훨씬 다르게 나타납니다. 유체 요소의 궤적이 더 이상 폐쇄 경로를 따르지 않기 때문에 유동장이 더 무질서해집니다. 반응이 더 복잡한 온도 프로파일의 영향을 받음에도 불구하고, 유체 요소가 훨씬 더 넓은 범위의 궤적을 탐색할 수 있어 더 많은 시약 부피가 최적의 열 프로파일을 경험할 기회를 갖게 됩니다.이러한 결과는 H/D가 9일 때의 개별 유동 궤적이 기존 써모사이클러에서 사용되는 것과 유사한 온도 프로파일을 생성하여 PCR에 더 유리해 보일 수 있음을 시사합니다. 그러나 H/D가 3일 때 유동장의 혼돈 특성은 물질 교환을 촉진하여 시약이 불리한 궤적에 오랫동안 갇혀 있지 않게 함으로써, 결과적으로 전역적 규모에서 더 지배적인 영향을 미칩니다. 이 가설을 검증하고 어떤 반응기 기하구조가 PCR에 더 유리한지 결정하기 위해, 두 실린더를 모두 사용하여 인간 게놈 DNA 템플릿으로부터 beta actin 유전자와 관련된 295 base pair 표적의 PCR 복제를 수행하였습니다. 그 결과, H/D가 3인 경우에만 정확한 표적 산물의 증폭이 10분 만에 반복적으로 달성되었습니다.반대로, H/D=9에서는 검출 가능한 생성물이 관찰되기까지 동일한 반응에 최소 20분이 소요되었습니다. 반응 특이성 또한 H/D=3에서 훨씬 더 높게 나타났으며, 이 조건에서는 단일 PCR 생성물이 얻어졌습니다. 반면 H/D=9에서는 유동장이 유체 요소를 불리한 열 궤적에 장시간 가두기 때문에 다수의 비특이적 생성물이 생성됩니다.대류 흐름 열순환기(convective flow thermocycler)를 사용하여 PCR 반응을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 공기 방울이 생기지 않도록 반응기 챔버 내부의 시약을 밀봉하는 것이 중요합니다. 공기 방울이 생기면 내부 유동장이 방해받아 반응이 억제될 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

PCR은 많은 분자 생물학 연구소의 일반적인 기법으로 부상하고있다. 여러 기존의 PCR 프로토콜에 대한 안내서가 여기에 제공됩니다. 각 반응은 독특한 실험, 제품이 다양 생성하는 데 필요한 최적의 조건이기 때문에. 반응의 변수를 이해하는 것은 크게함으로써 원하는 결과를 얻을 수있는 기회를 증가 문제 해결 효율성을 향상시킬 것입니다.

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 prion 변환과 변형 및 종 장벽의 연구에서 시험 관내 분석이다. 또한 prion 검출 분석으로 사용할 수 있습니다.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

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이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

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이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제시합니다.

연속 유동 PCR 미세유체 칩에서 대장균 의 증폭 및 모세관 전기영동 시스템을 사용한 검출

조직 소화 및 PCR 판독 포함 마우스 꼬리 샘플의 전체 genotyping은, 하나는 시그마의 SYBR 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 시간 반에서 이루어집니다.

시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping

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배우세요 열 대류를 활용한 신속 PCR 열사이클링 방법을 통해 DNA 증폭 효율을 높이는 기술을. 반응기 기하학과 CFD 시뮬레이션을 통해 최적의 흐름 패턴을 설계하여 생명공학 연구에 활용하세요.

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