Microscale 열 대류를 사용하여 신속한 PCR의 Thermocycling

이 절차의 전체적인 목적은 열대류에 의한 PCR 열 순환(Thermocycling) 원리를 실제 반응에 어떻게 적용할 수 있는지 보여주는 것입니다. 이는 먼저 자연 대류 열 순환의 작동 방식과 기본 설계 원리에 대한 개념을 소개함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 반응기 카트리지를 준비하고 내부에 시약을 로딩하는 방법을 보여주는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 리액터 카트리지를 히터 유닛에 조립하고 반응을 진행하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 반응 후 시약을 제거하고 겔 전기영동으로 결과를 확인하는 것입니다. 최종적으로, 자연 대류 PCR 열 순환을 통한 신속한 DNA 복제를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, Texas A&M University의 UGAs 연구실 소속 Radha OU입니다. 오늘은 라바 램프와 같은 자연 대류를 이용한 신속 PCR 열순환(Thermocycling) 수행 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 원리를 활용하는 열순환 장치의 설계 및 최적화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 본 프로토콜은 간단한 대류식 열순환 장치의 설계 및 제작부터 시작합니다. 본 시연에 사용된 장치는 온도가 독립적으로 제어되는 두 개의 알루미늄 플레이트 사이에 끼워지는 교체 가능한 플라스틱 반응 챔버 카트리지로 구성됩니다.

원하는 종횡비를 달성하기 위해 전체 직경과 플라스틱 시트 두께의 다양한 조합을 사용하여 폴리카보네이트 블록에 구멍 배열을 가공함으로써 원통형 반응기 웰을 삽입하였습니다. 최적의 설계에는 PCR 과정에 관여하는 주요 온도 구간을 통해 시약을 운송할 수 있는 순환 흐름을 생성할 수 있는 적절한 반응기 기하학적 구조를 선택하는 것이 포함됩니다. 여기서 고려된 원통형 반응기에서 변경 가능한 기하학적 매개변수는 높이와 직경, 또는 이와 동일한 종횡비입니다.

반응기의 바닥면은 마이크로프로세서 구동 온도 조절기와 연결된 카트리지 히터가 포함된 알루미늄 블록을 사용하여 가열합니다. 반응기 상단 표면의 온도는 재순환 수조에 연결된 알루미늄 블록을 사용하여 조절합니다. 전체 어셈블리는 대향하는 알루미늄 블록 간의 열전도를 제한하기 위해 나일론 나사로 함께 고정됩니다.

10배 농축 완충액, 25 millimolar 염화마그네슘, 두 종류의 dNTP, 증류수, beta actin 프로브, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 인간 게놈 템플릿 DNA 및 K-O-D-D-N-A 중합효소를 혼합하여 100 µL 분량의 PCR 반응액을 각각 준비합니다. 시약을 넣기 전, 알루미늄 테이프의 얇은 시트로 PCR 챔버의 바닥면을 밀봉하고, 10 mg/mL 농도의 소 혈청 알부민 수용액으로 반응조 웰을 헹군 후 Rain-X 안티포그 처리를 합니다. 마지막으로 겔 로딩 팁을 사용하여 반응조 웰에 시약을 분주하고 FEP 테플론 테이프로 윗면을 밀봉합니다.

반응을 시작하기 전, 두 알루미늄 블록을 원하는 상단 및 하단 표면 온도로 예열하십시오. PCR 시약이 충전된 플라스틱 반응기를 알루미늄 가열 블록 사이에 끼우고, 나일론 나사를 사용하여 어셈블리를 빠르게 고정하십시오. 원하는 시간 동안 반응이 진행되면 히터를 끄고, 장치의 하단 가열면을 냉각된 금속 블록 위에 올려 신속하게 냉각시켜 대류 흐름을 중단시키십시오.

플라스틱 리액터를 제거하고 후속 분석을 위해 웰에서 생성물을 피펫으로 옮깁니다. 10g의 agarose를 500mL의 1× 버퍼와 함께 교반 가열판 위에서 용액이 투명해질 때까지 가열하여 2% agarose 겔을 준비합니다. agarose 겔을 캐스팅 트레이에 붓고 콤을 삽입합니다.

겔이 약 30분 동안 굳도록 둡니다. 콤을 제거하고 겔이 잠길 때까지 1배 TAE buffer를 추가합니다. 100배 cyber green 2 µL를 사용하여 형광 염색된 DNA 샘플을 준비합니다.

DNA 샘플 2 µL, 6배 농축 오렌지 로딩 다이 2 µL, TAE 버퍼 4 µL를 혼합합니다. 100 base pair DNA ladder 사이즈 마커와 DNA 샘플을 겔의 웰에 로딩합니다. 60 V에서 1시간 동안 겔 전기영동을 수행하여 DNA를 분리합니다.

젤을 꺼내어 UV 광선 아래에서 촬영하여 결과를 확인합니다. 대류식 PCR 반응기 내부의 3D 유동장은 전산 유체 역학(CFD)을 이용하여 다양한 종횡비 범위에서 조사되었습니다. 이 데이터는 복잡한 패턴이 나타날 수 있으며, 이러한 복잡한 유동장의 일부가 반응 속도를 상당히 가속화할 수 있음을 보여주었습니다.

이러한 기하학적 효과는 높은 종횡비와 낮은 종횡비를 가진 반응기의 유동장을 비교함으로써 명확하게 확인할 수 있습니다. 유체 요소들은 궤적을 따라 영향을 받으며, 기본적으로 폐쇄 루프 형태의 경로를 그리게 되어 장기간 동일한 경로를 따라 고정됩니다. 결과적으로, 시약을 PCR을 위한 최적의 열 조건 순서에 노출시키는 유동 궤적과 증폭에 기여하지 않는 훨씬 더 많은 나머지 궤적들 사이의 교환 기회가 거의 없게 됩니다.

종횡비가 더 작을 때 유동장은 훨씬 다르게 나타납니다. 유체 요소의 궤적이 더 이상 폐쇄 경로를 따르지 않기 때문에 유동장이 더 무질서해집니다. 반응이 더 복잡한 온도 프로파일의 영향을 받음에도 불구하고, 유체 요소가 훨씬 더 넓은 범위의 궤적을 탐색할 수 있어 더 많은 시약 부피가 최적의 열 프로파일을 경험할 기회를 갖게 됩니다.

이러한 결과는 H/D가 9일 때의 개별 유동 궤적이 기존 써모사이클러에서 사용되는 것과 유사한 온도 프로파일을 생성하여 PCR에 더 유리해 보일 수 있음을 시사합니다. 그러나 H/D가 3일 때 유동장의 혼돈 특성은 물질 교환을 촉진하여 시약이 불리한 궤적에 오랫동안 갇혀 있지 않게 함으로써, 결과적으로 전역적 규모에서 더 지배적인 영향을 미칩니다. 이 가설을 검증하고 어떤 반응기 기하구조가 PCR에 더 유리한지 결정하기 위해, 두 실린더를 모두 사용하여 인간 게놈 DNA 템플릿으로부터 beta actin 유전자와 관련된 295 base pair 표적의 PCR 복제를 수행하였습니다. 그 결과, H/D가 3인 경우에만 정확한 표적 산물의 증폭이 10분 만에 반복적으로 달성되었습니다.

반대로, H/D=9에서는 검출 가능한 생성물이 관찰되기까지 동일한 반응에 최소 20분이 소요되었습니다. 반응 특이성 또한 H/D=3에서 훨씬 더 높게 나타났으며, 이 조건에서는 단일 PCR 생성물이 얻어졌습니다. 반면 H/D=9에서는 유동장이 유체 요소를 불리한 열 궤적에 장시간 가두기 때문에 다수의 비특이적 생성물이 생성됩니다.

대류 흐름 열순환기(convective flow thermocycler)를 사용하여 PCR 반응을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 공기 방울이 생기지 않도록 반응기 챔버 내부의 시약을 밀봉하는 것이 중요합니다. 공기 방울이 생기면 내부 유동장이 방해받아 반응이 억제될 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.