쥐에서 Active 지연 유형 과민성 (DTH)의 유도 및 모니터링

안녕하세요, 저는 Christine Beaton입니다. 저는 UCI 생리학 및 생물물리학과의 George Chandy 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 쥐에서 활성 DTH를 유도하는 방법을 보여드리겠습니다.

이를 위해 항원인 KLH와 프레온(Freund) 보조제를 사용하여 에멀젼을 준비하겠습니다. 그다음 이 에멀젼을 루이스 쥐(Lewis Rats)의 꼬리 기저부에 주입하겠습니다. 이렇게 하면 쥐에게 KLH에 대한 면역 반응이 유도됩니다. 일주일 후, 쥐에게 KLH를 다시 투여하여 챌린지를 수행하고, 부종의 정도를 측정하여 지연형 과민 반응(DTH reaction)을 측정하겠습니다.

그곳이 유발 부위이며, 저희는 실험실에서 DTH와 같은 염증 반응에 대한 PO 채널 차단제의 효과를 확인하기 위해 이를 사용하고 있습니다. 여기 에멀젼을 만드는 데 사용할 불완전 프라이젠트 보조제(incomplete Freund's adjuvant)가 있습니다. 완전 프라이젠트 보조제(complete Freund's adjuvant)를 사용할 수도 있습니다.

오늘 항원으로 사용할 KLH입니다. 여기 2 mg/mL 농도의 PBS 용액이 준비되어 있습니다. 이 5 mL 주사기를 사용하여 불완전 트랜스 보조제(incomplete trans adjuvant)를 취해 15 mL 튜브로 옮기겠습니다. 그다음 튜브를 볼텍스 믹서(vortex) 위에 올리고, 볼텍싱을 하면서 항원을 보조제에 한 방울씩 첨가하겠습니다.

그런 다음 5분 동안 더 볼텍싱합니다. 작업이 완료되면, 혼합물을 5 mL 유리 시린지에 채웁니다. 보조제(adjuvant)가 플라스틱을 부식시키는 경향이 있으므로 반드시 유리 시린지를 사용해야 합니다. 또한, 에멀젼을 제조하는 데에는 5 mL 시린지가 가장 적합하다는 것을 확인했습니다.

더 작거나 크면 적절하지 않습니다. 혼합물이 담긴 시린지를 준비한 후, 금속 브리지를 사용하여 이 유리 시린지를 다른 5 mL 유리 시린지와 연결하겠습니다. 그런 다음 시린지에 압력을 가해 혼합물이 한 시린지에서 다른 시린지로 최대한 빠르게 이동하게 하며, 에멀전이 매우 단단해질 때까지 이 과정을 반복하면 주입 준비가 완료됩니다.

이제 보조제를 2.5 mL 넣겠습니다. 보조제를 더 쉽게 추출하기 위해 공기를 주입한 후, 모든 보조제를 튜브에 넣습니다. 이제 보조제 2.5 mL를 취해 넣고 볼텍스 믹서로 섞어주겠습니다.

면역증강제(adjuvant)를 2.5 µL 취했으므로, KLH도 2.5 µL 취하겠습니다. 한 방울씩 추가함에 따라 혼합물의 색이 변하며 하얗게 변하는 것을 볼 수 있습니다. 이제 모든 항원을 면역증강제에 추가했습니다.

이제 혼합물을 5분 동안 더 볼텍싱하겠습니다. 하지만 5분 내내 튜브를 손으로 잡고 있을 수는 없으므로, 튜브를 볼텍스 믹서에 테이프로 고정하겠습니다. 튜브 내부에서 소용돌이가 형성되도록 하되, 내용물이 넘치지 않는 범위 내에서 가능한 한 빠르게 설정하십시오. 이 상태로 5분 동안 둡니다.

5분이 지났습니다. 이제 볼텍싱을 멈추겠으며, 혼합물은 흰색입니다. 이제 튜브를 꺼내겠습니다. 어라.

현재 혼합물은 완전히 하얀색이지만, 여전히 매우 액체 상태입니다. 주입을 위해 더 점도가 높기를 원하므로, 이제 혼합물 전체를 5 M 유리 주사기로 옮기겠습니다.

이렇게 오토클레이브 멸균 처리된 시린지들이 준비되었습니다. 먼저 시린지 하나를 전체적으로 브리지에 연결합니다. 그리고 다른 시린지에서는 배럴 부분만 연결합니다.

플런저를 뺀 상태에서 상단 주사기에 혼합물을 붓습니다. 그런 다음 모든 내용물을 하단 주사기로 옮깁니다. 이어서 여기에 있는 기포를 밀어내어 제거해야 합니다.

이제 상단 시린지를 분리하고 기포를 밀어내겠습니다. 기포가 잘 보이지 않지만 바로 여기에 있습니다. 따라서 기포를 밀어내어 제거합니다.

또한 브릿지 밖으로 밀어낸 다음 상단 주사기를 다시 연결합니다. 모든 연결 부위가 단단히 고정되었는지 확인한 후, 혼합물을 한 주사기에서 다른 주사기로 옮깁니다. 처음에는 쉽지만 곧 혼합물이 굳기 시작할 것입니다.

따라서 오늘 밤은 작업이 더 어려워지고 있으며, 브리지를 망가뜨리고 싶지 않으므로 주사기를 돌려줍니다. 때로는 시간이 더 오래 걸리기도 합니다. 이는 에멀젼마다 다릅니다.

아마 온도와 습도 수준에도 영향을 받을 것입니다. 하지만 이제 에멀젼이 준비된 것 같습니다. 부었을 때보다 훨씬 더 걸쭉해졌습니다.

완전히 흰색입니다. 그리고 단일 상으로 존재합니다. ACO 상이 오일과 분리되어서는 안 됩니다.

이제 주입할 준비가 되었습니다. 주입액이 준비되었으므로, 각 헛(hut)당 200 µL씩 주입하겠습니다.

이를 위해 3 mL 주사기를 사용하겠습니다. 에멀션이 매우 걸쭉하여 주입하기 어려울 수 있으므로, 바늘이 빠지지 않도록 루어락(lu lock) 팁 주사기를 사용합니다. 바늘의 경우, 에멀션이 통과할 수 있는 범위 내에서 가능한 가장 가는 바늘을 사용합니다.

이 에멀젼에는 20 3G 주사기로도 충분하다는 것을 확인했습니다. 더 점도가 높은 에멀젼의 경우에는 더 큰 주사기를 사용해야 할 수도 있습니다. 저희가 수행하는 방식은 한 사람이 쥐를 잡고 다른 사람이 주사하는 것입니다.

그리고 안전을 극대화하기 위해, 쥐들이 매우 온순하고 핸들링에 익숙해져 있기는 하지만, 쥐를 잡는 사람은 쥐에게 물리는 일을 방지하기 위해 최대로 안전하게 설치된 설치류 치아 방지 장갑을 착용합니다. 그런 다음 모든 에멀젼을 유리 주사기 하나에 넣고, 브릿지에서 비어 있는 유리 주사기를 분리합니다. 그리고 그 자리에 3 mL 플라스틱 루어락 주사기를 장착합니다.

이제 에멀션 한 번의 러트(rut)에 필요한 양보다 더 많이 옮깁니다. 기포를 밀어냅니다. 러트당 200 µL를 주입할 예정이므로, 시린지에 300 µL를 남겨둡니다.

브리지를 분리하고, 플라스틱 주사기에 바늘을 장착한 후 바늘을 채우고 플런저를 200 µL까지 내립니다. 이렇게 하면 공기 방울이 없음을 확실히 할 수 있습니다. 이제 주입할 준비가 되었습니다.

이제 쥐가 움직이지 않도록 고정해야 합니다. 쥐를 잡고 한 손의 손가락 하나는 어깨 위쪽에, 다른 하나는 아래쪽에 배치한 다음, 다른 손으로는 뒷다리와 꼬리를 잡습니다. 이제 양쪽 옆구리에 주사할 것인데, 이쪽에 수 마이크로리터를 주입하고 반대편에도 수 마이크로리터를 주입합니다. 지난주에 저는 항원으로서 KLH를 포함하는 에멀젼으로 쥐를 면역화했습니다.

오늘은 항원인 KLH와 관련 항원인 o albumin을 사용하여 쥐의 등에 피내 챌린지를 진행하겠습니다. 우선 등에 피내 주사를 하기 위해 털을 깎아야 하며, 이를 위해 일반 전기 면도기를 사용하겠습니다. 그리고 바늘이 무뎌지지 않도록 쥐를 바꿀 때마다 바늘을 교체합니다.

이렇게 하면 피내 주사를 훨씬 쉽게 할 수 있으며, 특히 각 항원을 20 µL의 소량으로 주입하는 경우에 유용합니다. 이제 모든 쥐에게 두 가지 항원을 주입하였으며, 내일까지 케이지에 그대로 둘 예정입니다. 그리고 내일이면 염증 반응을 확인할 수 있을 것입니다.

따라서 주사 부위가 붉게 붓게 되며, 염증 정도를 측정하기 위해 염증 부위의 직경을 측정할 수 있습니다. 어제 쥐의 등에 관련 항원인 KLH와 무관한 항원인 albumin을 피내 주사하여 자극을 주었습니다. 그리고 24시간이 지난 지금, 쥐를 관찰하여 염증이 발생했는지 확인하겠습니다.

따라서 저는 KLH 주사 부위에만 염증이 발생할 것으로 예상하며, 염증은 발적과 부종으로 나타날 것입니다. 염증을 확인한 후에는 해당 부위의 직경을 측정하여 염증 부위의 크기를 측정하겠습니다. 여기는 KLH를 주입한 부위이며, 보시다시피 심한 염증이 발생한 것을 확인할 수 있습니다.

정상 피부와 비교했을 때 매우 붉고 부어 있습니다. 이제 알부민을 투여한 다른 부위를 보면, 바로 여기에 주사 부위가 보이지만 유의미한 발적이나 부종은 없습니다. 따라서 음성 대조군이 제대로 작동했습니다.

이제 염증 부위의 크기를 측정하겠습니다. 이를 위해 일반 자를 사용하여 밀리미터 단위로 측정하겠습니다. 이 부위는 6mm이며, 두 번째 측정을 수행합니다.

이것의 크기는 5mm입니다. 발적은 거의 없으며, 측정해 보겠지만 1mm 정도에 불과합니다. 지금까지 항원을 이용한 에멀젼으로 준비하는 방법, 이 에멀젼으로 랫드를 면역하는 방법, 그리고 일주일 후 면역 시 사용한 항원 및 관련 항원으로 챌린지하는 방법, 그리고 Chan 실험실에서 사용되는 염증 정도의 시각화 및 측정 방법을 보여드렸습니다.

당사는 쥐의 염증에 대한 칼륨 채널 차단제의 효과를 측정하기 위한 간단한 분석법으로서 이 기술을 상당히 일상적으로 사용합니다.