Name: Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 배우세요 배아 마우스 해마 및 대뇌피질 뉴런의 핵전달법을 이용한 분리, 배양 및 형광 융합 단백질 발현 기술입니다. 이 방법은 축삭 성장, 시냅스 형성 및 신경 가소성 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

모든 절차 애니멀 케어에 위스콘신 대학위원회의 승인 및 NIH의 지침에 따라 하였다. 우리는 그녀의 Nucleofector 장치의 관대한 사용하기 위해 박사 캐서린 칼릴 감사합니다. 우리는 프로토콜에 대한 덧글에 대한 덴트 실험실의 구성원을 또한 감사드립니다. 이 작품은 EWD 부여 NIH R01 - NS064014, 다나 재단과 화이트홀 재단에 의해 지원되었다 크리스토퍼 Viesselmann, 제이슨 Ballweg와 데릭 Lumbard이 종이에 똑같이 기여.

1. Coverslips와 챔버의 준비 <ol><li> 깨끗한 coverslips와 챔버의 준비는 건강한 문화 필수적입니다. 단축키는 다음 단계 중 하나에서 찍은해서는 안됩니다. </li><li> 전용 유리 JAR 또는 비커에 집중되어 질산 (HNO3)에 하룻밤 - coverslips을 (카롤 어시스턴트 브랜드 12mm 또는 22mm 원형, 독일어, 유리) 씻으십시오. </li><li> 질산에서 coverslips를 제거하고 탈이온수 (5 - 7x) 광범위하게 씻으십시오. </li><li> 층류 흐름 후드 또는 biosafety 캐비닛에 coverslips 건조를 분리합니다. 경우 건조 30 분 동안 자외선으로 그들을 소독. 이곳은 저장을위한 살균 배양 접시에 coverslips를 소독. 12mm coverslips에 도금 뉴런 직접 살균 35mm 접시에 coverslips를 배치하고 제 2로 진행하십시오. </li><li> 이미징 여왕님 35mm 배양 접시의 바닥에 15mm 구멍을 (모든 털은 제거) 드릴링과 파라핀, 석유 젤리의 3시 1분 혼합으로 청소 coverslips을 첨부하여 건설하고 있습니다. </li><li> 끓는 물에 목욕 내부 원뿔 관에 파라핀 / 석유 젤리 혼합물을 용융. 작은 페인트 브러시와 코트 15mm 구멍 주변의 접시의 아래쪽을 사용합니다. 그것이 별도 있으므로 파라핀 / 석유 젤리 혼합물을 교반 보관해야합니다. 요리는 인큐베이터에 배치하는 경우 coverslip 부대의 결과, 점성이 될 것이다 석유 젤리의 높은 농도와 붙어 실에서 이것은 일반적으로 발생합니다. 나머지 파라핀 / 석유 젤리는 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> 평평한 쟁반에 뒤집어 접시를 놓고 구멍을 통해 coverslip를 놓습니다. 80 열 ° C 오븐 파라핀 혼합물을 용해까지 (~ 10 분). 평평한 표면에 요리를 제거하고 파라핀의 혼합 세트를 보자. </li><li> 요리를 뒤집어하고 자외선으로 덮개와 챔버의 바닥의 내부를 모두 소독. </li><li> 외투 coverslips 또는 1.0mg/mL 한 시간 만이라도 borate 버퍼 (0.1M 나트륨 borate, 산도 8.5)에서 폴리 - D - 라이신 (30kDa)와 챔버의 유리 지역. 조직 문화 등급 탈이온수의 풍부한 양의와 함께 3-5 번 씻어. borate 버퍼의 모든 흔적을 제거할 수 있는지 확인하십시오. 건조하고 나중에 사용하기 위해 즉시 또는 상점 챔버 / coverslips 사용합니다. 우리는 일반적으로 준비 1 개월 이내에 청소 coverslips을 사용합니다. </li></ol> 2. 의 연결을 해부 문화 매체의 준비 <ol><li> 조직 문화 등급 물을 10X HBSS와 100X HEPES의 적절한 금액을 추가하여 해부 미디어 (DM)를 준비합니다. 4 스토어 ° C. 해부 동안 얼음 계속. </li><li> 해부 전날은 도금 매체 (PM) 및 혈청없는 매체 (SFM)을 준비합니다. 오후 Neurobasal 매체, B27 보충 2 MM의 글루타민, 0.3 % 포도당, 37.5 MM NaCl과 5% 태아 소 혈청 (FBS)로 구성되어 있습니다. SFM은 Neurobasal 매체, B27 보충 2 MM의 글루타민, 0.3 %의 포도당과 37.5 MM NaCl로 구성되어 있습니다. </li><li> 뚜껑과 야간 보육 약간 열려 있도록 매체 equilibrates의 온도와 CO 2 컨텐츠하는 조직 문화의 해부 및 저장소에 대해서만 충분합니다. 우리는 여분의 포도당을 추가하고 NaCl과 약 310mOsm에 osmolality를 증가시킵니다. 우리는 문화가보다 생리적 osmolality (Neurobasal osmolality는 일반적으로 205 - 245mOsm이다)에서 더 잘할 찾습니다. </li></ol> 3. 장기 문화 두피 Glial 피더 레이어 준비 <ol><li> 장기 문화가 준비되고있다면, 대뇌 피질 또는 hippocampal 해부와 함께 계속하기 전에 프로토콜 2~3주의이 부분을 수행합니다. </li><li> 멤과 glial 중간 (GM), 0.3 % 포도당, 페니실린 / 스트렙토 마이신와 10 %의 목마 혈청을 준비합니다. </li><li> 5 분 얼음에 냉각하여 P1 - P3 마우스 새끼를 안락사. 70 % 에탄올로 얼음과 스프레이에서 각각의 강아지를 제거합니다. 신속하게 가위로 목을 베다. 감기에 DM을 (단계 2.1)이 포함된 음식을 전체 두뇌를 제거합니다. </li><li> 두 대뇌 반구와 meninges를 제​​거합니다. 엑사이스 네크로 텍스와 어떤 매체를 포함하지 새로운 음식을 제거합니다. 총 4 두뇌에서 cortices를 준비합니다. </li><li> 가능한 벌금으로 깨끗하고 살균 면도날로 cortices을 말하다 차가운 DM 12 ML을 포함한 50 ML 원뿔 관에 플라스틱 피펫과 다진 조직을 제거합니다. 각각 0.25 % (1.5 ML)와 0.1 % (1.5 ML)의 최종 농도에 트립신과 DNase를 추가합니다. 간헐적인 소용돌이와 함께 10 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. </li><li> 대뇌 피질의 조직을 포함하고있는 튜브를 제거하고 조직 문화 후드에 가져갈 전에 70 % 에탄올로 철저히 세척한다. 10 ML의 피펫과 Pipet 피질 조직 위쪽 및 아래쪽은 약 10-15 시간, 또는 때까지 대부분의 덩어리가 사라집니다. </li><li> ° C 간헐 소용돌이 다른 10 분 동안 물 목욕에서 37로 튜브를 반환합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 튜브를 깨끗이 청소하고 조직 문화 후드로 가져 오. 5m와 Pipet의 대뇌 피질 조직 위아래L 피펫은 약 덩어리가 사라 10-15 시간, 또는 때까지. </li><li> 15 따뜻한 GM의 ML 10 분 200xg (1000rpm)에서 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 뜨는 폐기, 신선한 GM의 20 ML에 pelleted 세포를 resuspend과 hemocytometer로 계산됩니다. 75cm 2 플라스크 당 GM의 15 ML에 판 5 7.5x10 6 세포. </li><li> 하루 문화의 모든 후속 2-3 일 후에, 손을 반대 휴대용 술병을 두드리는하여 느슨한 세포를 이동시키다. 어떤 dislodged 세포와 함께 미디어를 제거하고 신선한 GM의 15 ML로 바꿉니다. </li><li> 그들은 70-100 % 정도 합류하는 경우 Glia는 flasks 성장 1-2 주 후에 수확 수 있습니다. glia와 코팅 개별 coverslips를 준비하려면, 장소 6 질산의 산성은 작은 페인트 브러쉬와 삼각 패턴의 각 coverslip에 파라핀 / 석유 젤리의 3시 1분 혼합물의 3 점 청소하고, 10cm 접시에 25mm 원형 coverslips을 소독하고, 장소 . 30 분 자외선을 걸고 요리를 취급합니다. 코트 borate 버퍼 0.1 MG / ML 폴리 - D - 라이신 (30kDa) 1 시간 후, 무균 조직 배양 등급 탈이온수와 함께 (3 배) 광범위하게 씻어 건조하게 함께 coverslips. </li><li> 인큐베이터에서 glial 함유 플라스크를 제거 매체를 버리고 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 5 ML와 린스. 술병에서 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 제거하고 플라스크에 신선한 사전 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 ML을 피펫. ° C trypsinization를 중지 GM의 5 ML을 추가하기 전에 37 일분에 대한 휴대용 술병을 품어. </li><li> 10-15 번 반복 pipetting하여 플라스크에서 glia를 제거하고 15 ML 원뿔 관에 미디어를 전송합니다. 팔분에 대한 200xg (1000rpm)에 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 coverslips을 포함 10cm 요리 당 GM의 12.5 ML 10 GM의 ML, 개수 세포 및 플레이트 5x10 5 세포를 추가합니다. </li><li> 신선한 사전 예열 GM 모든 2-3일와 매체를 교환. 신경 세포의 해부 전날은 GM을 제거하고 SFM (섹션 2.2)로 대체합니다. 피질 또는 hippocampal 문화를 홍수 때 단계 4.12이 glial - 냉방 SFM을 사용합니다. </li></ol> 4. 피질 및 / 또는 Hippocampal 해부 및 Electroporation <ol><li> nucleofection 솔루션 (Lonza)의 적절한 금액을 제거, 절개를 시작하기 전에 결합하고, 실온에 따뜻한. 결합하면 Nucleofection 솔루션은 한정된 수명을 가지고 있기 때문에, 우리는 각각의 준비 (transfection 당 100 μL)에 필요한 금액을 결합하여. </li><li> CO 2 (플러그의 날이 E0.5 임) E15.5에서 임신 마우스를 안락사와 10cm의 페트리 접시에 자궁을 제거합니다. 추운 DM (섹션 2.1)로 fetuses과 참살을 제거합니다. </li><li> 감기 DM 별도의 그릇에 전체 두뇌를 제거하고 구부러진 텅스텐 바늘로, 두 neocortices를 제​​거합니다. 감기 DM의 새로운 그릇에 microforceps 및 장소 cortices로 meninges를 제​​거합니다. 작은 홍채 또는 웨커 가위로, 감기 DM 1.0 ML 가득 1.5 ML Eppendorf 튜브에있는 피질이나 해마과 장소를 제거합니다. 얼음이 튜브 보관하십시오. </li><li> 모든 cortices 또는 hippocampi을 해부 후 20 분 동안 37 ° C 배양기에서 조직과 장소 튜브가 들어있는 Eppendorf 튜브에 2.5 %의 트립신 110 μL를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 반전 Eppendorf 튜브에 의해 1.0 ML PM (섹션 2.2)로 뜨는 및 세척 cortices 또는 hippocampi를 제거합니다. 튜브 PM 1 ML을두고 두 번 세척을 반복합니다. </li><li> P1000 피펫으로 청크 15 번 씹다하고, Eppendorf 튜브에 남아있는 청크를 떠나, PM 4 ML를 포함하는 새로운 15 ML 원뿔 관에 / 뜨는 세포를 제거합니다. </li><li> 브레이크 해제되는 7 분 20xg (350rpm)에서 15 ML 튜브를 스핀. 뜨는을 취소하고 각각의 transfection에 대해 premixed, 방 온도 nucleofection 솔루션 (Lonza) 100 μL를 추가합니다. P1000 피펫의 최대 부드럽게 아래 모션 5 번 씹다. </li><li> 각각의 새로운 Eppendorf 튜브에 nucleofection 솔루션 / 셀 혼합 100 μL를 제거하고 DNA의 해당 금액을 추가합니다. 장기 문화 우리는 일반적으로 transfection마다 DNA의 1 2μg를 사용합니다. 그러나이 전용 ​​라벨 문화의 뉴런의 작은 &lt;10 %의 비율. 단기 문화 높은 transfection 효율을 원한다면 우리는 일반적으로 transfection마다 DNA의 5 - 10μg을 사용합니다. 서로 다른 두 가지 plasmids와 transfecting 때 우리는 DNA의 40μg의 총까지 사용하고 있습니다. Plasmids는 μL / 1μg에서 TE 버퍼에 저장됩니다. </li><li> 쿠베트 (Lonza)에 세포 현탁액 / DNA를 추가 및 프로그램 O - 005 (마우스 CNS의 뉴런)를 사용, Nucleofector (Lonza)에 세포를 electroporate. </li><li> 신속하게 작업, 쿠베트 사전 예열 및 equilibrated PM 500 μL을 추가하고 솔루션 / 새로운 1.5 ML Eppendorf 튜브에 세포를 제거합니다. 1.0 ML 각 transfection의 볼륨을 가지고 충분한 PM을 추가합니다. 장기 문화 청소년 문화, 또는 5 - 10x10 3 셀 / cm 2 3 5x10 3 셀 / cm 2 hemocytometer 및 플레이트로 세포를 계산합니다. &lt;은/ 리&gt; </li><li> 을위한 단기 문화, 홍수 예열 2.0 ML, 도금 한 시간 후 CO 2 - equilibrated SFM과 함께 35mm 문화 요리. coverslips를 사용하는 경우, 우리는 PM의 절반을 제거하고 SFM로 교체 후, 두 번 더 반복합니다. 어느 이미징 회의소를 홍수 또는 매우 낮은 혈청 콘텐츠 (&lt;0.5 %)에 coverslips 결과를 세척. 단기 문화 glial 피더 계층과 교양이 되야 할 필요는 없어 다시 먹이 필요가 없습니다. </li><li> 장기 문화를 위해, 우리는 파라핀 / 석유 젤리 세 점들을 포함하는 glia 대상 coverslip을 제거하고 35mm 접시에 15mm 구멍, 초기 도금 후에도 한 시간 이상을 반전. glial 접시에서 시설 SFM 두 밀리리터는 다음 이미징 챔버에 추가됩니다. 장기적으로 문화를 피드하기 위해, 우리는 SFM 모든 2~3일의 3 분의 1을 제거하고 신선한 사전 예열 및 CO 2 - equilibrated SFM로 바꾸십시오. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. hippocampal 뉴런 살아있는 대리인의 개발 단계 연속 hippocampal 뉴런 생활. 결합하여 이미지가 차등 간섭 대비 이미지와 해당 형광 현미경 모두로 표시됩니다. 이들 세포의 각각은 pCAX 벡터에서 EGFP - Tubulin과 DsRed2와 transfected되었습니다. 1 단계 (1DIV), 2 단계 (1DIV), 3 단계 (2DIV), 4 단계 (11DIV)와 5 단계 (32DIV) : 뉴런은 체외에 다음과 같은 일 (DIV)에서 몇 군데 있었다. 스케일 바 20μm이다.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

culturing 배아 hippocampal 및 대뇌 피질의 마우스 뉴런에이 프로토콜은 쥐 신경 1,2을 사용 뱅커 프로토콜의 변경으로 개발되었습니다. 우리는 잘 3,4,5,6,7로 culturing 마우스와 햄스터 뉴런에이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 hippocampal과 neocortical 두 뉴런에 동일하게 잘 작동하고 Meberg와 밀러 8 시까지 출판 프로토콜과 유사합니다. 그들이 잘 특징과 더 설립 모델 시스템이기 때문에 일반적으로, 우리는 장기적인 문화 hippocampal 뉴런을 사용합니다. 또한, 그들은 네크로 텍스 이상의 뉴런보다 균일한 인구를 포함할 가능성이 높습니다. 그러나, neocortical 뉴런은 생존과 (되지 않은 데이터) 마찬가지로 차별이 프로토콜을 사용하는 양식. 우리는 일상적으로 단기 문화 hippocampal과 neocortical 뉴런을 사용합니다. 네크로 텍스의 절개는 또한 서양 예를 들어, 모래 바닥에 대한 자료를 더 나은 선택하게 hippocampal 해부 (hippocampi의 쌍 당 2.5x10 5 뉴런)보다 실질적으로 더 많은 뉴런 (cortices의 쌍 당 1.5x10 6 뉴런)의 결과. 어떤 차 문화와 마찬가지로, 그것은 동물의 죽음에서 세포의 도금을하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 것이 필수적입니다. 그것은 일반적으로 절개하고 도금에서 일관 빠른 될 10-20 해부를 취할 것입니다. 그들이 nucleofection 버퍼에 남아있는 경우 뉴런의 생존이 빠르게 감소로 또한, Lonza Nucleofector 작업을 할 때, 그것은, electroporation 과정에서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 대부분의 이미징의는 총 내부 반사율의 형광 현미경 (TIRFM)에 실시됩니다. 현미경 이런 유형의 coverslip 넘어 이미징 수백 나노미터에 불과 가능합니다. 따라서, 우리는 자주 이미지, axonal 성장 원뿔과 돌기의 쪽이은 coverslip에 직접 준수하는 뉴런의 영역을 필요. 따라서, 우리는 장기적인 문화 glial 먹이를 필요로 저밀도 문화를 사용합니다. 우리는 장기적인 문화, glial 피더 레이어없이 (&gt; 2x10 4 셀 / cm 2) 높은 밀도 문화를 사용하고 그들이 약간의 먹이로 잘 살아남을 것으로 나타났습니다. 그들이 쉽게 와이드 필드 현미경이나 공촛점 현미경과 함께 발견 될 수 있지만 그러나 이러한 뉴런의 돌기 쪽이은 자주 너무 멀리 기판에서 TIRFM의 이미지입니다. 우리의 연구의 대부분 우리는 도금 전에 신경을 transfect, 최대 문화에 3 개월에 대한 찬란 - 표시된 단백질을 몇 군데있다. 찬란 - 분류 단백질의 장기 표현은 DNA (1 2μg)의 낮은 농도를 사용하여 우리는 뉴런에서 overexpression 유물을 생산하지 않는 우리에게 자신감을 준다. 그러나,이 절차는 또한 DNA의 높은 금액가 (10 - 20μg) 사용하는 경우에는 단백질 overexpression을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리도 DsRed2 또는 혼자 EGFP로의 연결을 세포질에 레이블을하지만, 우리가 신경을 transfect하는 데 사용하는 plasmids은 일반적으로, EGFP 또는 mCherry 융합 단백질을 포함하고 있습니다. 이 electroporation 기술은 벡터의 번호와 잘 작동합니다. 우리는 CMV 향상제 및 β - globin과 β - 굴지의 프로 모터를 포함 plasmids를 선호 쓰임새 표현의 상대적으로 높은 수준으로 인해 꼬리 (pCAGGs 또는 pCAX plasmids) 9,, 그들은 뉴런에 의해 잘 용납있다는 사실 - 단기 및 장기 문화를 모두 인치 일반적으로, 단백질은 도금의 약 4 시간 이내 Express 및 10 - 24 10 시간 영상에 충분한 수준에 도달하기 시작합니다. 우리는 성공적으로 단기 문화에 CMV - 발기인 기반 plasmids를 사용해야하지만, 그들은 장기적인 문화에 신경을 죽일 것을 overexpression 높은 수준을 일으킬 수 있다고 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 낮은 밀도 문화의 glial 에어컨 높은 밀도를 (비 - glial 공급) 문화에 비해, CMV - 발기인 구동 plasmids와 transfected 뉴런의 생존과 도움 것으로 나타났습니다.

우리는 -80에서 저장소 ° C가뿐만 아니라 -20 ° C에 저장된 수 있습니다 * 대부분의 시약. -80에서 그들을 저장 ° C들의 수명과 약간 더 일관성있는 문화의 결과를 길게.

nucleofection 및 배아 마우스 hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal과 대뇌 피질의 뉴런은 중추 신경계 (CNS)의 연결을 편광, 축삭 / dendrite 파생물 및 버렸네 형성과 기능을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다. culturing 이러한 뉴런의 장점들은 쉽게 매우 낮은 밀도에서 2 차원 기판에 특유의 axons과 dendrites을 형성, 분극이다. 이 속성은의 연결을 개발의 여러 측면을 결정을 위해 매우 유용하게되었다. 또한, 이러한 뉴런에 glial 컨디셔닝을 제공하여 그들이 기능 시냅스 연결을 형성하고 문화에 몇 개월 동안 생존 개발 나갈 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 해부하다하는 기술, 문화, transfect 배아 마우스 hippocampal과 대뇌 피질의 뉴런을 설명합니다. Transfection은 nucleofection 통해 도금 전에 뉴런에 DNA를 electroporating에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 분극, 축삭의 가지와 분기 동안 단백질의 역학과 기능을 연구 개발 (~ 4 8hrs 도금 후) 초기에 찬란 - 태그 융합 단백질을 표현하는 장점이 있습니다. 또한 도금 전에 하나의 transfection은 신경 세포 (문화&gt; 2 개월)의 수명에 걸쳐 이미징에 적합한 수준에서 찬란 - 태그 융합 단백질 발현을 유지 것을 발견했습니다. 따라서,이 방법론의 연결 기능을 거의 또는 전혀 방해와 CNS 개발 전반에 걸쳐 단백질 현지화 및 기능을 공부하는 데 유용합니다.

이 프로토콜은 electroporation과 문화 마우스 hippocampal 및 대뇌 피질의 뉴런을 통해 transfect, 해부하다하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 장기 문화가 synaptogenesis 및 돌기 척추 분석 연구에 사용할 수 있지만 단기 문화는 축삭의 파생물과지도의 연구에 사용할 수 있습니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

해마 및 피질 뉴런은 중추신경계(CNS) 뉴런의 분극화, 축삭/수지상돌기 성장 및 ...을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다.

해마 및 피질 뉴런은 중추신경계의 뉴런 극성, 축삭 및 수지상 돌기 성장, 그리고 시냅스 형성 및 기능을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 이러한 뉴런 배양의 장점은 매우 낮은 밀도의 2차원 기질에서 뚜렷한 축삭과 수지상 돌기를 형성하며 쉽게 극성화된다는 점입니다. 이 비디오에서는 뉴클레오펙션(nucleofection)을 통해 마우스 배아의 해마 및 피질 뉴런을 분리, 배양 및 형질전환하는 기술을 시연합니다. 이 기술을 통해 파종 후 약 4~8시간 뒤인 발달 초기 단계부터 형광 표지 융합 단백질을 발현시킬 수 있으며, 형광 표지 단백질의 발현은 배양 상태에서 2개월 이상의 뉴런 수명 동안 유지됩니다. 이를 통해 축삭 성장과 같은 초기 발달 과정과 시냅스 형성 및 시냅스 가소성과 같은 후기 과정을 포함한 단백질 기능을 연구할 수 있습니다.먼저 생후 1~3일 된 마우스의 피질 반구에서 글리아 세포를 분리하여 플라스크에 배양합니다. 70~100% 합류도(confluency)에 도달하면, 글리아 세포를 유리 커버슬립에 다시 배양합니다.그 다음, E 15.5 마우스에서 해마 또는 피질 뉴런을 분리하고, 적색 형광 단백질과 같은 형광 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 nucleo affection을 통해 트랜스펙션합니다. 트랜스펙션된 뉴런은 단기 연구를 위해 이미징 챔버에 플레이팅합니다. 장기 배양의 경우, 영양 지원을 제공하기 위해 유리 커버슬립 위의 글리아 세포를 해마 또는 피질 배양물 위에 뒤집어 덮습니다. 이후 개별 뉴런을 이미징하여 뉴런의 축삭 또는 수지상 돌기 전체에서 융합 단백질의 역동적인 국소화를 관찰할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스의 해부학 조교수인 Eric Dent입니다. 오늘은 저의 학부생 세 명인 Chris Wezelman, Jason Bwe, Derek Lombard가 단기 및 장기 배양을 위한 피질 및 해마 뉴런의 분리, 도말 및 배양 유지 절차를 시연할 예정입니다. 이러한 배양법은 초기 뉴라이트 성장부터 축삭 및 수지상 돌기 발달, 그리고 시냅스 형성까지의 뉴런 발달 전 과정에 걸쳐 형광 융합 단백질의 역동성을 연구하는 데 활용될 수 있습니다.이미징을 위한 챔버를 준비하기 위해, 배아 마우스의 해마 및 피질 뉴런을 사용합니다. 바닥에 15 millimeter 구멍이 뚫려 있고 모든 버(bur)가 제거된 35 millimeter 페트리 접시를 준비합니다. 원추형 튜브에 파라핀과 페트롤리움 젤리를 3:1 비율로 혼합하여 넣고, 이를 끓는 물 중탕에 두어 녹입니다.그 다음, 작은 붓을 사용하여 구멍 주변의 디쉬 바닥면을 코팅합니다. 파라핀 석유 젤리 혼합물은 층이 분리되므로 챔버 사이사이에 사용할 때 반드시 저어주어야 합니다. 구멍 위에 커버슬립을 덮습니다.모든 디쉬의 준비가 완료되면, 파라핀 혼합물이 녹을 때까지 80 °C 오븐에 넣습니다. 이 과정은 약 10분 정도 소요됩니다. 그 후 디쉬를 꺼내 평평한 표면에 놓고 파라핀 혼합물이 최소 1분 동안 굳도록 둡니다.디쉬를 뒤집어 후드 아래에 놓습니다. UV 램프를 30분 동안 켜서 커버의 안쪽과 챔버의 바닥면을 모두 멸균합니다. 다음으로 코팅을 진행합니다.챔버 커버 슬립을 poly D lycine으로 1시간 동안 코팅합니다. 그런 다음 코팅된 커버 슬립을 멸균 여과된 탈이온수로 3~5회 충분히 헹구어 보어 버퍼(bore buffer)의 모든 흔적을 제거합니다. 마지막 헹굼 단계 후, 진공 장치를 사용하여 챔버를 건조합니다. 건조된 챔버는 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 조직 배양실에 보관할 수 있습니다.장기 배양을 준비하는 경우, 코팅된 챔버는 준비 후 1주일 이내에 사용해야 합니다. 피질 신경교 세포 피더 층(cortical glial feeder layers)은 피질 또는 해마 박리를 진행하기 2~3주 전에 먼저 준비해야 합니다. P1에서 P3 단계의 생쥐 4마리의 뇌를 차가운 박리 배지가 담긴 접시에 넣고 해부 현미경 아래에 둡니다.후각구, 두 개의 대뇌 반구 및 뇌수막을 제거합니다. 반구를 배지가 없는 새 배양 접시에 옮깁니다. 깨끗하고 멸균된 면도날을 사용하여 피질을 가능한 한 잘게 다집니다.그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 잘게 자른 조직을 12 mL의 차가운 dissection Medium이 들어 있는 50 mL conical tube로 옮깁니다. trypsin과 DNase를 각각 최종 농도가 0.25%와 0.1%가 되도록 첨가합니다. 37 °C 항온수조에서 10분 동안 간헐적으로 소용돌이치게 흔들어주며 배양합니다.배양 후, 튜브를 항온수조에서 꺼내 70% ethanol로 깨끗이 닦은 다음 조직 배양 후드로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 피질 조직을 위아래로 섞어줍니다.10 mL 피펫을 사용하여 덩어리가 대부분 사라질 때까지 약 10~15회 정도 분주하고, 튜브를 다시 항온수조에 넣어 간헐적으로 소용돌이치게 흔들어주며 10분 동안 더 반응시킵니다. 다시 한번 튜브를 70% ethanol로 철저히 세척한 후 조직 배양 후드로 옮깁니다.피펫을 이용해 피질 조직을 위아래로 섞어줍니다. 이전과 마찬가지로 이번에는 5 mL 피펫을 사용하여, 따뜻한 glia 배지 15 mL를 첨가하고 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛화된 세포를 20 mL의 신선한 glia 배지에 다시 부유시킵니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그 다음, 75 cm² 플라스크당 15 mL의 glial medium에 500만에서 750만 개의 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에 넣고, 배양 시작 하루 후부터 이후 2~3일마다 플라스크를 후드 표면에 가볍게 두드려 부착되지 않은 세포들을 떨어뜨립니다.탈락된 세포와 함께 배지를 제거하고 15 milliliters의 신선한 glia 배지로 교체합니다. glial 세포는 플라스크에서 1~2주 동안 배양하여 약 100%confluent 상태가 되었을 때 수확할 수 있습니다. glia가 코팅된 개별 커버슬립을 준비하려면, 먼저 질산으로 세척하고 멸균한 6개의 커버슬립을 배치하는 것부터 시작하십시오.10 centimeter 디쉬에 25 millimeter 원형 커버슬립을 놓고, 작은 붓을 사용하여 파라핀 페트롤리움 젤리를 3:1 비율로 혼합한 용액을 커버슬립 위에 삼각형 패턴으로 세 점 찍어 도포합니다. 커버슬립을 디쉬에 고정하기 위해 커버슬립 가장자리에 두 점을 더 찍어 도포합니다.개방형 디쉬를 UV 광선으로 30분 동안 처리합니다. 커버슬립을 poly D lysine으로 1시간 동안 코팅합니다. 그 후 멸균 여과된 탈이온수로 3~5회 충분히 세척하고 건조시킨 뒤, 인큐베이터에서 글리아 세포를 꺼냅니다.배지를 버리고 미리 데워둔 trypsin 5 mL로 세척합니다. 플라스크에 trypsin 3 mL를 넣고 37 °C에서 1분 동안 배양합니다. 세포가 떨어지면, glial medium 5 mL를 첨가하여 trypsin 반응을 중단시킵니다.피펫팅을 10~15회 반복하여 플라스크에서 GL을 제거합니다. 그 다음 배지를 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮겨 1000 RPM에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 10 milliliters의 glial medium에 현탁합니다.그 후 세포 수를 측정하고, 커버슬립이 들어 있는 10 centimeter 디쉬당 12.5 milliliters의 글리아 배지에 5 × 10⁵ 개의 세포를 분주합니다. 뉴런 분리 전날까지 2~3일마다 배지를 미리 데워둔 신선한 글리아 배지로 교체합니다. 글리아 배지를 제거하고 무혈청 배지로 교체합니다.이 글리아 조건 무혈청 배지를 나중에 사용하십시오. 피질 또는 해마 배양물을 플러딩할 때, C를 최종 농도 5 µM이 되도록 첨가합니다. 글리아 증식을 방지하기 위해, 제조사의 지침에 따라 트랜스펙션당 핵 도입 시약을 처리한 후, 용액을 상온으로 데웁니다.E 15.5 마우스 뇌가 담긴 디쉬를 차가운 박리 배지에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 구부러진 텅스텐 바늘을 사용하여 양쪽 신피질을 제거합니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 뇌수막을 제거하고 피질을 차가운 박리 배지가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.소형 홍채 가위를 사용하여 대뇌 반구의 내측면을 따라 해마와 피질을 확인합니다. 해마를 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 남아 있는 피질을 제거합니다.전체 리터의 뇌에 대해 동일한 해부 과정을 반복합니다. 해부된 해마와 피질을 cold dissection Medium 1 mL가 채워진 별도의 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 각각 넣습니다. 모든 피질과 해마의 해부가 끝나면 튜브를 얼음에 보관합니다.조직이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 2.5% trypsin 110 µL를 첨가하고, 튜브를 37 °C 인큐베이터에 20분 동안 둡니다. P 1000 피펫을 사용하여 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 그런 다음 각 튜브에 plating medium 1 mL를 첨가하고 마이크로 원심분리 튜브를 부드럽게 뒤집어 조직을 세척합니다.세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후, 도말 배지 1 mL를 추가합니다. P 1000 피펫을 사용하여 덩어리들을 15회 파이펫팅합니다. 그 다음, 마이크로 원심분리 튜브에 남아 있는 덩어리들은 그대로 두고, 상층액과 세포를 도말 배지 4 mL가 들어 있는 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.15 mL 튜브를 350 RPM에서 7분 동안 원심분리하고 브레이크를 작동시킨 후, 상층액을 제거하고 각 transfection당 미리 혼합하여 상온에 둔 nuclear transfection solution 100 µL를 첨가합니다. 파이펫으로 5회 상하 혼합한 다음, nuclear transfection solution과 세포 혼합물 100 µL를 적절한 양의 DNA가 포함된 각각의 새 마이크로 튜브로 옮깁니다. transfection당 1~2 µg의 DNA를 사용하며, 장기 배양의 경우 배양된 뉴런의 10% 미만이 라벨링됩니다.배양 시 transfection 효율을 높이려면 transfection당 5~10 µg의 DNA를 사용하며, 세포 현탁액과 DNA 혼합물을 electroporation cuvette에 넣습니다. 그다음 cuvette을 electroporator에 넣습니다. 마우스 CNS 뉴런의 경우 nucleo effector 프로그램을 oh 0 0 5로 설정하고, 신속하게 사전 가온 및 평형화된 plating medium 500 µL를 cuvette에 추가한 후 세포 용액을 새로운 1.5 mL microfuge tube로 옮깁니다.각 transfection의 부피가 1 mL가 되도록 충분한 도말 배지를 추가합니다. 세포 수를 측정한 후, 단기 배양의 경우 cm²당 3~5 × 10³개의 세포를, 장기 배양의 경우 m²당 5~10 × 10³개의 세포를 도말합니다. 일반적으로 단기 배양을 준비하기 위해 transfection당 5 × 10⁵ 또는 1 × 10⁶개의 세포를 사용합니다.플레이팅 1시간 후, 35 밀리미터 배양 접시에 이산화탄소가 평형화된 따뜻한 무혈청 배지 2 밀리리터를 가득 채웁니다. 이렇게 하면 이미징 챔버 내의 혈청 함량이 0.5% 미만으로 매우 낮게 유지됩니다. 단기 배양의 경우 글리아 피더 층(glial feeder layer)과 함께 배양하거나 재피딩(refeed)할 필요가 없습니다. 장기 배양을 준비하려면 무혈청 배지에 글리아 컨디션 배지(glial condition) 1 밀리리터를 첨가하십시오.파라핀 페트롤리움 젤리 세 점이 도포된 GL 커버슬립을 제거하여 35 dish의 15 millimeter 구멍 위에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 장기 배양을 위해 배지를 1 milliliter 더 추가합니다. 2~3일마다 무혈청 배지의 1/3을 교체합니다.배양 후 5~7일이 지나면, 글리아 세포의 증식을 막기 위해 cytosine Arab IDE 또는 aee를 최종 농도 5 µM이 되도록 첨가합니다. 다음의 대표적인 살아있는 해마 뉴런 쌍 이미지는 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지와 그에 해당하는 형광 현미경 사진을 모두 보여줍니다. 이 세포들은 각각 PA 벡터를 통해 EGFP, tubulin 및 DS red two가 형질전환되었습니다.1단계 동안 뉴런은 처음에 부착되며, 하루 정도의 기간에 걸쳐 세포체 주변부로 시트 모양의 lamellipodia와 손가락 모양의 filopodia를 돌출시킵니다. 2단계 동안, 초기 돌출물들은 세포체에서 뻗어 나오는 여러 개의 neurite로 분화하며, 보통 길이는 약 30 to 50 microns 정도로 유지됩니다. 3단계 동안에는 확률적으로 neurite 중 하나가 빠르게 신장하기 시작하여 axon이 됩니다.다른 신경 돌기들은 짧게 유지되며 이를 부수 돌기라고 합니다. 대부분의 해마 및 피질 뉴런은 배양 후 2~3일 이내에 3단계로 진입합니다. 이후 1~2주에 걸쳐 진행되는 4단계에서는 부수 돌기들이 굵어지고 길어지며 가지를 쳐서 여기서 녹색으로 표시된 수지상 돌기가 됩니다. 한편, 축삭은 계속해서 성장하고 분지하며 2~3주에 걸쳐 가늘어집니다.배양 시, 수지상돌기는 수지상돌기를 따라 형성되는 작은 돌기인 수지상돌기 가시(dendritic spines)를 형성하며 분화합니다. 5단계 뉴런은 모양과 크기가 다양할 수 있으나, 대부분은 이러한 일련의 발달 단계를 거쳐야 합니다. 단백질의 과발현이 뉴런의 발달을 방해하는 경우, 형질전환된 뉴런은 이러한 단계로 진행되지 않을 수 있습니다.또한, 뉴런이 모든 발달 단계를 거치지 않을 수 있습니다. 커버스립이 제대로 세척되지 않았거나 폴리리신이 적절히 부착되지 않은 경우, 특히 C를 사용하지 않았다면 글리아 세포가 과도하게 증식할 수 있습니다. 이것은 2주 된 배양물의 위상차 이미지로, 장기 배양 시 글리아 세포가 배양물을 과성장시킨 모습입니다.배지를 너무 자주 교체하거나 충분히 자주 교체하지 않는 것 또한 뉴런의 생존력에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 대부분의 뉴런이 사멸하고 남은 뉴런들의 세포체가 수축되고 돌기가 구슬 모양으로 변한 배양 상태의 위상차 이미지입니다. 비교를 위해, 여기 배양 2주 차의 건강한 해마 뉴런의 위상차 이미지가 있습니다. 더 큰 세포체와 돌기의 구슬 모양 변성이 없음에 주목하십시오.또한, 이 단계에서 수지상 돌기는 굵어졌으며 축삭 돌기의 광범위한 그물망이 형성되어 있습니다. 숙달되면, 제대로 수행할 경우 배아 및 피질 해부, 형질전환 및 태아 한 배 전체의 플레이팅 작업을 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 해마와 피질 뉴런이 기계적 손상에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.또한, 신경세포 분리 과정 중 대사 활동을 낮게 유지하기 위해 용액을 가능한 한 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 관심 있는 형광 융합 단백질이 신경세포의 서로 다른 영역으로 어떻게 분리되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 살아있는 세포 이미징 및 활동의 생리학적 기록과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이는 단백질 국소화가 시냅스 활동의 변화와 관련이 있는지, 또는 이러한 단백질의 기능이 서로 다른 약물 처리에 의해 어떻게 영향을 받는지를 확인하기 위함입니다.

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

우리는 쥐 배아에서 hippocampal과 대뇌 피질의 신경 세포를 분리하고 문화에 빠른 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 우리가 거​​의 순수의 연결을 문화가 요구되는 실험을 수행할 수 있습니다.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

이 비디오는 쥐 해마에서 뉴런을 배양하는 방법을 보여줍니다. 처음에 해마는 세포외 조직 기질을 분해하기 위해 효소 소화를 거칩니다. 그 후, 소화된 조직은 개별 뉴런을 분리하기 위해 기계적으로 파괴됩니다. 마지막으로, 이러한 뉴런은 신경교세포(glial feeder cell)에서 배양됩니다.

쥐 해마 뉴런을 배양하는 기술

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

이 문서에서는 아교 세포 단층을 통해 반전 커버 글라스에 성장 저밀도 차 해마 신경 세포를 배양 프로토콜을 설명합니다. 신경 세포 및 아교 층 파라핀 왁스 비드에 의해 분리된다. 이 방법에 의해 성장 된 뉴런 고해상도 광학 이미징 및 기능 분석에 적합하다.

낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

여기서, 우리는 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트(AIS)의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 프로토콜을 기술하였다.

축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

바로 사용할 수있는 냉동 뉴런은 시냅스 기능을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 여기에서는 96웰 플레이트를 사용하여 냉동 재고에서 쉽게 추출한 저밀도 1차 배양을 소개합니다.

배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

배우세요 배아 마우스 해마 및 대뇌피질 뉴런의 핵전달법을 이용한 분리, 배양 및 형광 융합 단백질 발현 기술입니다. 이 방법은 축삭 성장, 시냅스 형성 및 신경 가소성 연구에 활용됩니다.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

더 많은 동영상 탐색