Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

해마 및 피질 뉴런은 중추신경계의 뉴런 극성, 축삭 및 수지상 돌기 성장, 그리고 시냅스 형성 및 기능을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며, 이러한 뉴런 배양의 장점은 매우 낮은 밀도의 2차원 기질에서 뚜렷한 축삭과 수지상 돌기를 형성하며 쉽게 극성화된다는 점입니다. 이 비디오에서는 뉴클레오펙션(nucleofection)을 통해 마우스 배아의 해마 및 피질 뉴런을 분리, 배양 및 형질전환하는 기술을 시연합니다. 이 기술을 통해 파종 후 약 4~8시간 뒤인 발달 초기 단계부터 형광 표지 융합 단백질을 발현시킬 수 있으며, 형광 표지 단백질의 발현은 배양 상태에서 2개월 이상의 뉴런 수명 동안 유지됩니다. 이를 통해 축삭 성장과 같은 초기 발달 과정과 시냅스 형성 및 시냅스 가소성과 같은 후기 과정을 포함한 단백질 기능을 연구할 수 있습니다.

먼저 생후 1~3일 된 마우스의 피질 반구에서 글리아 세포를 분리하여 플라스크에 배양합니다. 70~100% 합류도(confluency)에 도달하면, 글리아 세포를 유리 커버슬립에 다시 배양합니다.

그 다음, E 15.5 마우스에서 해마 또는 피질 뉴런을 분리하고, 적색 형광 단백질과 같은 형광 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 nucleo affection을 통해 트랜스펙션합니다. 트랜스펙션된 뉴런은 단기 연구를 위해 이미징 챔버에 플레이팅합니다. 장기 배양의 경우, 영양 지원을 제공하기 위해 유리 커버슬립 위의 글리아 세포를 해마 또는 피질 배양물 위에 뒤집어 덮습니다. 이후 개별 뉴런을 이미징하여 뉴런의 축삭 또는 수지상 돌기 전체에서 융합 단백질의 역동적인 국소화를 관찰할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스의 해부학 조교수인 Eric Dent입니다. 오늘은 저의 학부생 세 명인 Chris Wezelman, Jason Bwe, Derek Lombard가 단기 및 장기 배양을 위한 피질 및 해마 뉴런의 분리, 도말 및 배양 유지 절차를 시연할 예정입니다. 이러한 배양법은 초기 뉴라이트 성장부터 축삭 및 수지상 돌기 발달, 그리고 시냅스 형성까지의 뉴런 발달 전 과정에 걸쳐 형광 융합 단백질의 역동성을 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

이미징을 위한 챔버를 준비하기 위해, 배아 마우스의 해마 및 피질 뉴런을 사용합니다. 바닥에 15 millimeter 구멍이 뚫려 있고 모든 버(bur)가 제거된 35 millimeter 페트리 접시를 준비합니다. 원추형 튜브에 파라핀과 페트롤리움 젤리를 3:1 비율로 혼합하여 넣고, 이를 끓는 물 중탕에 두어 녹입니다.

그 다음, 작은 붓을 사용하여 구멍 주변의 디쉬 바닥면을 코팅합니다. 파라핀 석유 젤리 혼합물은 층이 분리되므로 챔버 사이사이에 사용할 때 반드시 저어주어야 합니다. 구멍 위에 커버슬립을 덮습니다.

모든 디쉬의 준비가 완료되면, 파라핀 혼합물이 녹을 때까지 80 °C 오븐에 넣습니다. 이 과정은 약 10분 정도 소요됩니다. 그 후 디쉬를 꺼내 평평한 표면에 놓고 파라핀 혼합물이 최소 1분 동안 굳도록 둡니다.

디쉬를 뒤집어 후드 아래에 놓습니다. UV 램프를 30분 동안 켜서 커버의 안쪽과 챔버의 바닥면을 모두 멸균합니다. 다음으로 코팅을 진행합니다.

챔버 커버 슬립을 poly D lycine으로 1시간 동안 코팅합니다. 그런 다음 코팅된 커버 슬립을 멸균 여과된 탈이온수로 3~5회 충분히 헹구어 보어 버퍼(bore buffer)의 모든 흔적을 제거합니다. 마지막 헹굼 단계 후, 진공 장치를 사용하여 챔버를 건조합니다. 건조된 챔버는 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 조직 배양실에 보관할 수 있습니다.

장기 배양을 준비하는 경우, 코팅된 챔버는 준비 후 1주일 이내에 사용해야 합니다. 피질 신경교 세포 피더 층(cortical glial feeder layers)은 피질 또는 해마 박리를 진행하기 2~3주 전에 먼저 준비해야 합니다. P1에서 P3 단계의 생쥐 4마리의 뇌를 차가운 박리 배지가 담긴 접시에 넣고 해부 현미경 아래에 둡니다.

후각구, 두 개의 대뇌 반구 및 뇌수막을 제거합니다. 반구를 배지가 없는 새 배양 접시에 옮깁니다. 깨끗하고 멸균된 면도날을 사용하여 피질을 가능한 한 잘게 다집니다.

그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 잘게 자른 조직을 12 mL의 차가운 dissection Medium이 들어 있는 50 mL conical tube로 옮깁니다. trypsin과 DNase를 각각 최종 농도가 0.25%와 0.1%가 되도록 첨가합니다. 37 °C 항온수조에서 10분 동안 간헐적으로 소용돌이치게 흔들어주며 배양합니다.

배양 후, 튜브를 항온수조에서 꺼내 70% ethanol로 깨끗이 닦은 다음 조직 배양 후드로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 피질 조직을 위아래로 섞어줍니다.

10 mL 피펫을 사용하여 덩어리가 대부분 사라질 때까지 약 10~15회 정도 분주하고, 튜브를 다시 항온수조에 넣어 간헐적으로 소용돌이치게 흔들어주며 10분 동안 더 반응시킵니다. 다시 한번 튜브를 70% ethanol로 철저히 세척한 후 조직 배양 후드로 옮깁니다.

피펫을 이용해 피질 조직을 위아래로 섞어줍니다. 이전과 마찬가지로 이번에는 5 mL 피펫을 사용하여, 따뜻한 glia 배지 15 mL를 첨가하고 1000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛화된 세포를 20 mL의 신선한 glia 배지에 다시 부유시킵니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그 다음, 75 cm² 플라스크당 15 mL의 glial medium에 500만에서 750만 개의 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C 인큐베이터에 넣고, 배양 시작 하루 후부터 이후 2~3일마다 플라스크를 후드 표면에 가볍게 두드려 부착되지 않은 세포들을 떨어뜨립니다.

탈락된 세포와 함께 배지를 제거하고 15 milliliters의 신선한 glia 배지로 교체합니다. glial 세포는 플라스크에서 1~2주 동안 배양하여 약 100%confluent 상태가 되었을 때 수확할 수 있습니다. glia가 코팅된 개별 커버슬립을 준비하려면, 먼저 질산으로 세척하고 멸균한 6개의 커버슬립을 배치하는 것부터 시작하십시오.

10 centimeter 디쉬에 25 millimeter 원형 커버슬립을 놓고, 작은 붓을 사용하여 파라핀 페트롤리움 젤리를 3:1 비율로 혼합한 용액을 커버슬립 위에 삼각형 패턴으로 세 점 찍어 도포합니다. 커버슬립을 디쉬에 고정하기 위해 커버슬립 가장자리에 두 점을 더 찍어 도포합니다.

개방형 디쉬를 UV 광선으로 30분 동안 처리합니다. 커버슬립을 poly D lysine으로 1시간 동안 코팅합니다. 그 후 멸균 여과된 탈이온수로 3~5회 충분히 세척하고 건조시킨 뒤, 인큐베이터에서 글리아 세포를 꺼냅니다.

배지를 버리고 미리 데워둔 trypsin 5 mL로 세척합니다. 플라스크에 trypsin 3 mL를 넣고 37 °C에서 1분 동안 배양합니다. 세포가 떨어지면, glial medium 5 mL를 첨가하여 trypsin 반응을 중단시킵니다.

피펫팅을 10~15회 반복하여 플라스크에서 GL을 제거합니다. 그 다음 배지를 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮겨 1000 RPM에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 10 milliliters의 glial medium에 현탁합니다.

그 후 세포 수를 측정하고, 커버슬립이 들어 있는 10 centimeter 디쉬당 12.5 milliliters의 글리아 배지에 5 × 10⁵ 개의 세포를 분주합니다. 뉴런 분리 전날까지 2~3일마다 배지를 미리 데워둔 신선한 글리아 배지로 교체합니다. 글리아 배지를 제거하고 무혈청 배지로 교체합니다.

이 글리아 조건 무혈청 배지를 나중에 사용하십시오. 피질 또는 해마 배양물을 플러딩할 때, C를 최종 농도 5 µM이 되도록 첨가합니다. 글리아 증식을 방지하기 위해, 제조사의 지침에 따라 트랜스펙션당 핵 도입 시약을 처리한 후, 용액을 상온으로 데웁니다.

E 15.5 마우스 뇌가 담긴 디쉬를 차가운 박리 배지에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 구부러진 텅스텐 바늘을 사용하여 양쪽 신피질을 제거합니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 뇌수막을 제거하고 피질을 차가운 박리 배지가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.

소형 홍채 가위를 사용하여 대뇌 반구의 내측면을 따라 해마와 피질을 확인합니다. 해마를 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 남아 있는 피질을 제거합니다.

전체 리터의 뇌에 대해 동일한 해부 과정을 반복합니다. 해부된 해마와 피질을 cold dissection Medium 1 mL가 채워진 별도의 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 각각 넣습니다. 모든 피질과 해마의 해부가 끝나면 튜브를 얼음에 보관합니다.

조직이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 2.5% trypsin 110 µL를 첨가하고, 튜브를 37 °C 인큐베이터에 20분 동안 둡니다. P 1000 피펫을 사용하여 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거합니다. 그런 다음 각 튜브에 plating medium 1 mL를 첨가하고 마이크로 원심분리 튜브를 부드럽게 뒤집어 조직을 세척합니다.

세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후, 도말 배지 1 mL를 추가합니다. P 1000 피펫을 사용하여 덩어리들을 15회 파이펫팅합니다. 그 다음, 마이크로 원심분리 튜브에 남아 있는 덩어리들은 그대로 두고, 상층액과 세포를 도말 배지 4 mL가 들어 있는 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

15 mL 튜브를 350 RPM에서 7분 동안 원심분리하고 브레이크를 작동시킨 후, 상층액을 제거하고 각 transfection당 미리 혼합하여 상온에 둔 nuclear transfection solution 100 µL를 첨가합니다. 파이펫으로 5회 상하 혼합한 다음, nuclear transfection solution과 세포 혼합물 100 µL를 적절한 양의 DNA가 포함된 각각의 새 마이크로 튜브로 옮깁니다. transfection당 1~2 µg의 DNA를 사용하며, 장기 배양의 경우 배양된 뉴런의 10% 미만이 라벨링됩니다.

배양 시 transfection 효율을 높이려면 transfection당 5~10 µg의 DNA를 사용하며, 세포 현탁액과 DNA 혼합물을 electroporation cuvette에 넣습니다. 그다음 cuvette을 electroporator에 넣습니다. 마우스 CNS 뉴런의 경우 nucleo effector 프로그램을 oh 0 0 5로 설정하고, 신속하게 사전 가온 및 평형화된 plating medium 500 µL를 cuvette에 추가한 후 세포 용액을 새로운 1.5 mL microfuge tube로 옮깁니다.

각 transfection의 부피가 1 mL가 되도록 충분한 도말 배지를 추가합니다. 세포 수를 측정한 후, 단기 배양의 경우 cm²당 3~5 × 10³개의 세포를, 장기 배양의 경우 m²당 5~10 × 10³개의 세포를 도말합니다. 일반적으로 단기 배양을 준비하기 위해 transfection당 5 × 10⁵ 또는 1 × 10⁶개의 세포를 사용합니다.

플레이팅 1시간 후, 35 밀리미터 배양 접시에 이산화탄소가 평형화된 따뜻한 무혈청 배지 2 밀리리터를 가득 채웁니다. 이렇게 하면 이미징 챔버 내의 혈청 함량이 0.5% 미만으로 매우 낮게 유지됩니다. 단기 배양의 경우 글리아 피더 층(glial feeder layer)과 함께 배양하거나 재피딩(refeed)할 필요가 없습니다. 장기 배양을 준비하려면 무혈청 배지에 글리아 컨디션 배지(glial condition) 1 밀리리터를 첨가하십시오.

파라핀 페트롤리움 젤리 세 점이 도포된 GL 커버슬립을 제거하여 35 dish의 15 millimeter 구멍 위에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 장기 배양을 위해 배지를 1 milliliter 더 추가합니다. 2~3일마다 무혈청 배지의 1/3을 교체합니다.

배양 후 5~7일이 지나면, 글리아 세포의 증식을 막기 위해 cytosine Arab IDE 또는 aee를 최종 농도 5 µM이 되도록 첨가합니다. 다음의 대표적인 살아있는 해마 뉴런 쌍 이미지는 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지와 그에 해당하는 형광 현미경 사진을 모두 보여줍니다. 이 세포들은 각각 PA 벡터를 통해 EGFP, tubulin 및 DS red two가 형질전환되었습니다.

1단계 동안 뉴런은 처음에 부착되며, 하루 정도의 기간에 걸쳐 세포체 주변부로 시트 모양의 lamellipodia와 손가락 모양의 filopodia를 돌출시킵니다. 2단계 동안, 초기 돌출물들은 세포체에서 뻗어 나오는 여러 개의 neurite로 분화하며, 보통 길이는 약 30 to 50 microns 정도로 유지됩니다. 3단계 동안에는 확률적으로 neurite 중 하나가 빠르게 신장하기 시작하여 axon이 됩니다.

다른 신경 돌기들은 짧게 유지되며 이를 부수 돌기라고 합니다. 대부분의 해마 및 피질 뉴런은 배양 후 2~3일 이내에 3단계로 진입합니다. 이후 1~2주에 걸쳐 진행되는 4단계에서는 부수 돌기들이 굵어지고 길어지며 가지를 쳐서 여기서 녹색으로 표시된 수지상 돌기가 됩니다. 한편, 축삭은 계속해서 성장하고 분지하며 2~3주에 걸쳐 가늘어집니다.

배양 시, 수지상돌기는 수지상돌기를 따라 형성되는 작은 돌기인 수지상돌기 가시(dendritic spines)를 형성하며 분화합니다. 5단계 뉴런은 모양과 크기가 다양할 수 있으나, 대부분은 이러한 일련의 발달 단계를 거쳐야 합니다. 단백질의 과발현이 뉴런의 발달을 방해하는 경우, 형질전환된 뉴런은 이러한 단계로 진행되지 않을 수 있습니다.

또한, 뉴런이 모든 발달 단계를 거치지 않을 수 있습니다. 커버스립이 제대로 세척되지 않았거나 폴리리신이 적절히 부착되지 않은 경우, 특히 C를 사용하지 않았다면 글리아 세포가 과도하게 증식할 수 있습니다. 이것은 2주 된 배양물의 위상차 이미지로, 장기 배양 시 글리아 세포가 배양물을 과성장시킨 모습입니다.

배지를 너무 자주 교체하거나 충분히 자주 교체하지 않는 것 또한 뉴런의 생존력에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 대부분의 뉴런이 사멸하고 남은 뉴런들의 세포체가 수축되고 돌기가 구슬 모양으로 변한 배양 상태의 위상차 이미지입니다. 비교를 위해, 여기 배양 2주 차의 건강한 해마 뉴런의 위상차 이미지가 있습니다. 더 큰 세포체와 돌기의 구슬 모양 변성이 없음에 주목하십시오.

또한, 이 단계에서 수지상 돌기는 굵어졌으며 축삭 돌기의 광범위한 그물망이 형성되어 있습니다. 숙달되면, 제대로 수행할 경우 배아 및 피질 해부, 형질전환 및 태아 한 배 전체의 플레이팅 작업을 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 해마와 피질 뉴런이 기계적 손상에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한, 신경세포 분리 과정 중 대사 활동을 낮게 유지하기 위해 용액을 가능한 한 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 관심 있는 형광 융합 단백질이 신경세포의 서로 다른 영역으로 어떻게 분리되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 살아있는 세포 이미징 및 활동의 생리학적 기록과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이는 단백질 국소화가 시냅스 활동의 변화와 관련이 있는지, 또는 이러한 단백질의 기능이 서로 다른 약물 처리에 의해 어떻게 영향을 받는지를 확인하기 위함입니다.