Name: 블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 Microdissection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 학습하세요 블랙 위도우 거미의 실크 생산 땀새를 효율적으로 분리하는 미세해부법을. 이 방법은 거미 실크 단백질 연구와 생물재료 개발에 중요한 기초 자료를 제공합니다.

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이 작품은 블랙 위도우 스파이더 실크스의 NSF 루이 부여 MCB - 0950372받을 분자 특성에 의해 지원되었다.

1. 복부의 스파이더와 절연을 Anesthetizing <ol><li> 플라스틱 (그림 1A)이 줄지어 판지 상자에 유리 항아리에서 거미를 전송합니다. 우리는 일반적으로 woodpiles, 차고 또는 덤불에서 거미를 수집하고 유리 단지에있는 실험실에서 그들을 집. 거미가 플라스틱 안감을 올라가 수 없기 때문에, 그것은 anesthetizing 목적을 위해 작은 유리병에 유리 병 또는 커피하실 수 있습니다 거미를 전송하는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 시점에서 거미를 처리하는 동안, 당신은 안전을 위해 라텍스 장갑이나 원예 장갑 두 쌍을 착용해야합니다. </li><li> 거미 플라스틱 줄지어 상자에있는 동안 그 후면에서 거미에 접근하고 플라스틱 문화 약병에 거미 슬라이드를 보자. 거미가 병을를 입력 후, 즉시 상단 (그림 1B)를 통해 플러그인을 놓으십시오. 우리는 약 101.6 mm X 31.75 mm (L X D)입니다 병을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 anesthetizing 단계에 필요한 이산화탄소 가스의 양을 최소화합니다. </li><li> 10 분 (그림 1C)에 평방 인치당 5~10파운드에서 이산화탄소 가스를 도입하여 거미를 마취. 가스의이 금액은 너무 anesthetization 후 즉시 1.4-1.5 단계를 진행해야합니다, 5 분 주위에 거미를 노크합니다. </li><li> 작은 해부 접시에 anesthetized 거미 플레이스와 거미 등의 측면 접속 (붉은 모래 시계가 아래로 향하게)를 위치 집게를 사용합니다. </li><li> 거미의 나머지 부분 (그림 1D)에서 복부를 공개하는 작은 꽃자루 (cephalothorax와 복부를 연결하는 좁은 줄기)를 클립. 배양 접시에있는 하룻밤 냉장고에 cephalothorax를 저장하고 다음날 냉동 후 폐기합니다. 거미의 송곳니이 세그먼트에 존재하는 것과 cephalothorax를 이동할 때주의하십시오. </li><li> 단일 곤충 핀을 사용하여 작은 절개 요리에 Sylgard 자료에 복부를 고정. 작은 꽃자루 클리핑 (그림 1E)에서 만들어진 구멍을 통해 곤충 핀을 넣습니다. 이것은 쉽게 유체는 작은 꽃자루의 클리핑에서 신흥있는 사이트로 확인할 수 있습니다. 방적 돌기 (작은 꽃자루의 반대 끝)이 (당신에게 가장 가까운) 하단에 지향되어 있는지 확인하십시오. </li></ol> 2. 외골격의 제거 <ol><li> 작은 꽃자루 클리핑에서 구멍에서 시작, microscissors 한 켤레를 사용하여 외장을 통해 첫 절개를합니다. 등의 측면이 양쪽 (그림 1 층)에 도달할 때까지 옆으로 잘라. 다시 앞의 외골격 세그먼트 껍질, 포셉 한 켤레를 사용하여이 위치에서 두 번째 핀을 삽입합니다. 두 번째 핀의 삽입에 따라, 초기 측면 인하에서 caudally 해부 트레이 (90 ° 각도)를 설정하고 spinnerets가 (그림 1G)에 도달까지 절단을 계속합니다. 이것은 절개는 초기 측면 절단에 수직 또는 수직 것입니다. 수직 절개가 만든 spinnerets (모래 시계로 사후 상대하고 둥근 모양을 가지고)를 통해 잘라하지 마십시오. 두 번째 핀을 삽입하지 않으면 수직 incisions을 수행할 때 회전 복부가 발생합니다. </li><li> 버퍼 솔루션 (0.1 M의 나트륨 염화물, 0.015 M 나트륨 구연 산염, Pyrocarbonate 디에틸 0.1 %) 해부에 잠수함 복부. </li><li> 나머지 외골격 필 다시 초기, 측면 절개부터. 이것이 완료되면, 지방 조직 (그림 1H) 명확하게 표시해야합니다. </li></ol> 3. 실크 생산 땀샘의 분리 <ol><li> 사용 포셉은 지방 계층 (그림 1H)을 멀리 놀리는 시작합니다. 지방 노란색 외관에 약간 흰를해야합니다. 지방의 대부분 제거하고 실크 선들이 분명하게 볼 수 있습니다 때까지 계속합니다. tubuliform의 글랜드은 복강이 풍부 매우 긴 원통형 튜브이 세 켤레로 구성되어 있습니다. 쌍에서 발견되는 주요 ampullate은, 긴 뒤얽힌 말초 꼬리하고 거미의 spinnerets 접근으로 폭 감소 근위 덕트와 대형 초승달 모양 ampulla입니다. 작은 ampullate은 주요 ampullate에 형태에서 매우 유사하지만, 그것은 상당히 작습니다. 또한 쌍의 발생 flagelliform의 글랜드은, spinnerets 향해 아래로 확장 덕트가 지그 - 재그 작은 원형과 원형과 multilobular입니다. 집계 선은 (쌍에서 발견) 그 위에 대형 불규칙한 엽 (叶)을 갖고있는 매우 큰 배설 관을 가진 매우 큰, multilobular 글랜드입니다. aciniform의 땀샘이 다수 발생하고 짧은, 작은 fingerlike의 전망을 닮은. pyriform의 글랜드은 복부에서 가장 작은 선 (腺)이며 spinnerets 아래로 확장할 수 많은 작은 배설 덕트와 팬과 유사한 많은 압축, 원통형 덕트 있습니다. </li><li> pyriform (그림 2A - B) 다음 tubuliform, 주요 ampullate, flagelliform, 사소한 ampullate, 집계, aciniform 후 우리는 다음과 같은 순서로 선들을 제거하는 것이 좋습니다. </li><li> tubuliform으로 시작 일의 나머지 이러한 땀샘을 애타게전자 땀샘은 - 그들은 다른 선들은 (그림 2A)의 꼭대기에 앉아 있어야합니다. 단일 거미에 tubuliform 땀샘이 세 켤레가 있습니다. 그들이 무료로 부동 그러나 그들의 덕트하여 spinnerets에 첨부된 남아 수 있습니다. </li><li> 다음의 주요 ampullate의 땀샘 멀리 애타게. 한 거미에있는 두 가지 주요 ampullate의 땀샘이 있습니다. 제거 절차 동안, 덕트의 분비 (그림 2A)에 연결된 남아 있는지 확인하십시오. </li><li> 특히 집계 및 flagelliform의 땀샘을 분비 중 하나를 펑쳐링 않도록 조심스럽게 작업, 서로 떨어져 분비의 나머지 부분을 감히 계속합니다. 각 선은 spinnerets에 외골격으로의 출구 지점에있는 모든 방법을 떠 무료로해야합니다. 이러한 분비는 짝을 찾을 수 있습니다. 포셉와 덕트를 곤란하게하고 멀리 출구 지점에서 휴식 시간 때까지 조심스럽게 당겨 각 선 (腺)을 제거합니다. 주요 ampullate, flagelliform, 가벼운 ampullate 및 집계 선들이 짝을 찾을 수 있습니다. aciniform과 pyriform 땀샘이 많은 쌍으로 발생합니다. </li><li> 포셉와 덕트를 곤란하게하고 방적 돌기에 의해 아래 출구 지점에서 멀리 휴식 때까지 조심스럽게 당겨 각 선 (腺)을 제거합니다. 우리는 일반적으로 선들이 젖었 저장 있지만, 우리는 추가적인 버퍼를 추가하지 마십시오. </li><li> 이 선들이 제거됩니다로서, 살균 미리 표시 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 그들을 놓으십시오. 개인 분비는 그림 3A - G에 표시됩니다. 얼음이 분비 유지하고 플래시는 액체 질소에서 그들을 동결. 액화 질소에 냉동 플래시에 따라, -80에서 그들을 자리 ° C를 저장. </li></ol> 4. 대표 결과 flagelliform 및 집계 선들을 처리하는 동안이 두 구조가 쉽게 구멍과 포셉 함께 손상될 수있는 여러 선들을 제거하면, 극단주의, 주의해야한다. 또한, 그것은 morphologically flagelliform 및 집계 선들 전에 자신의 제거와 매우 유사한 모양과 그들이 종종 서로 고리로 연결되었다는 것을 주목할 가치가있다. 제거시이 조직의 교차 오염을 방지하기 위해, 해부학자 신중하게 이러한 구조를 따로 애타게한다. 또한, 실크 생산 땀샘의 초기 노출시, aciniform 및 pyriform 땀샘은 즉시 그들의 작은 크기와 해부 학적 위치로 인해 시각화하는 가장 어려운 것입니다. 종종 많은 계란의 존재가 있습니다. 이 조직은 매우 끈적이고 자주 포셉을 준수하므로 또한, 추가적인 치료는 pyriform의 글랜드를 제거하면 이동해야합니다. 이 절차가 제대로 완료되면, 그것은 매우 정화 방식으로 하나의 거미에서 일곱 비단 생산 분비를 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 하나는 하나의 거미 해부에서 총 RNA와 단백질의 마이크로 그램 수량을 복구할 수 있습니다. tubuliform 제한된 피브로인 유전자, TuSp1의 mRNA 수준을 검사 qPCR에 대한 총 RNA를 사용하는 예제는 (그림 4) 표시됩니다. 단백질이 분​​비에서 수집한 lysates 관련 대표 실험 MS 분석 (또한 MS / MS 분석을 위해 사용될 수) 또는 아미노산 조성 분석 (각각 그림 5-6,) 표시됩니다 다음에 - 솔루션 tryptic 소화 예를 들어. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="그림 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1E"> 그림 1. 처리는 anesthetizing, 그리고 여성 검은 과부 거미의 복부에서 외골격의 제거. 작은 플라스틱 약병에 거미를 이동 촉진하기 위하여 플라스틱이 줄지어 판지 상자에 거미) 전송합니다. B) 스파이더 플러그인과 플라스틱 유리병에 배치. C) 이산화탄소 가스와 거미를 Anesthetizing. microscissors를 사용하여 복부에서 cephalothorax의 D) 분리. 곤충 핀을 사용하여 해부 트레이에있는 복부의 E) 고정. F) 수평 절개가 가위와 외골격의 일부 포셉로 다시 pealed는 만든 후 볼 수 있습니다. G) Incisions은 초기 측면 잘라 직각 만들어지고. 지방 레이어의 외골격과 노출 H) ​​제거. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 거미뿐만 아니라, 주변 조직의 복부 동안 그대로 7 개의 비단 생산 분비의 시각화. tubuliform의) 이미지, 주요 ampullate, flagelliform, 12 배 확대 집계, 사소한 ampullate 조직. 12 배 확대에 aciniform 및 pyriform 선들의 B) 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="그림 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3A"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="그림 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3E"> 복부으로부터 제거 후 일곱 비단 생산 분비의 그림 3. 사진. 모든 이미지는 40X에 마쳤을 aciniform과 pyriform 땀샘의 예외 20X 확대에 점령되었다. A) 주요글랜드을 ampullate, 크기 비교를 위해 B) 전공 및 부전공 ampullate (오른쪽), C) tubuliform, D) flagelliform, E) 집계, F) aciniform, G) pyriform. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 에서 총 RNA의 양적 실시간 PCR (qPCR) 다음과 격리를 사용하여 다른 비단 생산 분비에 TuSp1 mRNA 수준을 조사 후 실크 유전자, TuSp1 (pyriform의 글랜드 제외)의 표현 패턴 그림 4. 대표 결과 이 선들. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 인 솔루션 tryptic 소화 다음 pyriform의 글랜드에서 얻은 단백질 추출물 MS 분석의 예. 참고 : X2는 스펙트럼 강도의 2 배 배율을 나타냅니다. PySp1의 피브로인의 지역에 해당하는 스펙트럼 펩타이드 이온 질량은 # 기호로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. tubuliform의 글랜드에서 추출한 단백질의 아미노산 조성 프로필의 전형적인 결과. 참고 : ASX = ASP 및 ASN, GLX = GLU과 Gln. 붉은 착색이 아닌 정반대의 사이드 체인 그룹과 아미노산 잔류물을 나타내는 반면 블루 착색은 북극 사이드 체인 그룹과 아미노산을 반영합니다.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
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<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
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<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

검은 과부 거미의 실크 생산 땀샘의 microdissection을위한 우리의 방법론은 높은 정화 비단 생산 분비를 얻을 수있는 효과적인 수단을 제공합니다. 해부는 일곱 별개의 전체 집합 비단 생산 cobweavers의 분비를 항복, 1.5-3 시간에 완료할 수 있습니다. 높은 정화 실크 글랜드 샘플을 구하기 조사관에게 다른 선들에 선택적으로 표현 유전자에 대한 mRNA 수준의 질량 분광법, 분석을 사용하여 선의 luminal 내용에 저장되어있는 새로운 실크 또는 보호자의 단백질의 식별을 포함하여 생화학 연구의 넓은 범위를 수행할 수있는 능력을 수 그리고 실크 생산의 메커니즘을 연구하기 위해 체외에서 특정 분비의 culturing.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>물에 0.1 M</td></tr><tr><td>디에틸 파이로카보네이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>시트르산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>물에 0.015 M</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>디지털 현미경 카메라</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>소프트웨어 - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 핀셋</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>곤충 핀 #2</td></tr><tr><td>소형 또는 대형 해부 접시</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S 또는 DD-90-S</td><td>직경 52 mm x 높이 18 mm (Sylgard 깊이 ~6mm) 또는 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 배양 바이알</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>크기는 직경 31.75 mm x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 microdissection

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

현대 스파이더는 운동, 먹이 캡쳐 및 자손 1,2을 개발의 보호를 포함하여 생물 학적 기능의 광범위한 높은 성능의 실크 섬유를 스핀. 거미는 다양한 기계적 특성을 가지고 몇 가지 서로 다른 파이버 유형을 회전하여 이러한 작업을 수행. 섬유 종류의 이러한 전문 작은 biofactories 같은 기능을 다른 비단 생산 분비의 진화를 통해 발생했습니다. 이러한 biofactories 제조 및 섬유 생산을위한 실크 단백질의 대량를 저장합니다. 생화 학적 사건의 복잡한 일련의를 통해 다음과 실크 단백질은 압출시 고체 물질로 액체에서 변환됩니다. 기계 연구 거미 비단 높은 인장 강철 3보다 더 강한 것을 증명하고있다. 거미 실크 스레드의 구조와 기능 사이의 관계를 이해하는 분석 거미 실크는 크게 자신의 단백질 시퀀스 4 이내 블록 반복을 가지고 단백질, 또는 fibroins들로 이루어져 것으로 나타났다있다. 놀라운 인장 강도와 거미 실크 옷의 확장성에 기여하는 일반적인 분자 서명 번역 실크 cDNAs의 분석을 통해 풀어되고 있습니다. 거미 실크 옷의 특별한 재료 속성을 감안할 때, 전세계 연구소 이해하고, 상업 군사 및 산업용 애플 리케이션을위한 합성 실크 섬유를 생산하기 위해 회전 과정을 모방하기 위해 경주하고 있습니다. 연구 실험실에서 인공 거미 실크를 회전하는 주요 과제 중 하나는 실크 생산 땀샘에서 섬유의 압출하는 동안 발생하는 생화학 과정의 전체 이해를 포함한다. 여기서 우리는 7 개의 비단 생산의 주요 및 사소한 ampullate의 땀샘을 포함 cobweaving 검은 과부 거미에서 분비를 5,6, tubuliform [합성 달걀 케이스 실크] [드래그 라인 및 발판 실크를 제조] 7 격리하는 방법을 제시 , 8, flagelliform [코브 - 위버스에서 알 수없는 함수], 집계 [글루 실크하게], aciniform [합성의 먹이 포장 계란 케이스 스레드] 9 pyriform 10 [첨부 디스크 실크를 생산]. 이 접근법은 이산화탄소 가스, 복부에서 cephalothorax의 후속 분리 및 비단 생산 분비를 얻기 위해 복부의 microdissection와 거미 anesthetizing을 기반으로합니다. 다른 비단 생산 분비의 분리에 따라,이 조직은 식별 정량적 실시간 PCR, 북부 및 서부 모래 바닥, 질량 분석계 (MS 또는 MS / MS)는 분석을 포함하여 별개의 생화 학적 분석에 대해 다른 macromolecules를 검색하는 데 사용할 수 있습니다 새로운 실크 단백질 시퀀스, 실크 조립 경로에 참여하거나, 세포 배양 또는 histological 실험에 대한 손상 조직을 사용하는 단백질을 검색합니다.

여기 우리는 여성의 검은 과부 거미의 복부에서 비단 생산 땀샘을 제거하는 효율적인 전략을 설명합니다. 이 절차는 일곱 별개의 비단 생산이 높은 정화 패션, 거미 실크의 생산 및 섬유 조립을 공부 조사를위한 중요한 프로세스의 분비를의 급속한 고립 수 있습니다.

블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 Microdissection

현대의 거미는 이동, 먹이 포획 및 ...의 보호를 포함하여 광범위한 생물학적 기능을 가진 고성능 실크 섬유를 뽑아냅니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 거미의 복부에서 7개의 서로 다른 제사선을 분리하고, 이 조직들을 분자 및 생화학적 연구에 사용하는 것입니다. 이는 먼저 거미를 마취시킴으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 두부, 흉부 및 복부를 분리한 후 소형 해부 접시에서 곤충 핀으로 복부를 고정하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 외골격에 절개선을 만들어 실 생산 샘을 노출시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 서로 다른 실 생산 샘들을 제거하는 것입니다. 결과적으로, 정량적 실시간 PCR 또는 질량 분석법과 같은 분자 및 생화학적 접근 방식을 통해 서로 다른 실 생산 샘이 각각 뚜렷하게 구별되는 실 mRNA 또는 단백질을 발현한다는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 실크 생산 샘 내에 저장된 단백질을 밝혀냄으로써 거미 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공할 것입니다. 이러한 단백질은 군사 및 의료 분야뿐만 아니라 다양한 상업적 및 산업적 응용 분야에 활용될 수 있습니다. 저희는 실크 생산 샘 내에 저장된 단백질에 대해 더 많은 정보를 알아야 했을 때 처음으로 이 특정 연구를 수행한다는 아이디어를 얻었습니다.이 기술의 주요 장점은 암컷 검은과부거미의 복부가 매우 커서 실 생산샘을 분리하기가 매우 쉽다는 점입니다. 이 방법에 익숙하지 않은 사람은 해부 과정 중 샘이 파열되는 경우가 많아 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 분리하기 어려운 특정 해부학적 구조들이 존재합니다.성공적인 해부를 위해서는 시각적 시연이 매우 중요합니다. 해부 절차는 Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame, Y Shaw가 시연할 예정입니다. 해부를 시작하기 전에 0.1 molar sodium chloride, 0.015 molar sodium citrate 및 0.1% ethyl bicarbonate로 구성된 해부 완충액 500 milliliters를 준비하십시오.그 다음, 거미를 수용하고 밖으로 기어나가는 것을 방지하기 위해 플라스틱 라이닝이 처리된 판지 상자를 준비합니다. 일반적으로 검은과부거미는 장작 더미, 덤불 또는 차고에서 채집하며, 실험실 내에서는 유리병에 넣어 보관합니다. 채집 후, 거미를 다루면서 유리병에서 상자로 옮깁니다.안전을 위해 라텍스 장갑이나 원예용 장갑을 두 겹으로 착용하십시오. 그런 다음 작은 플라스틱 배양 바이알을 사용하여 거미의 뒤쪽에서 접근해 거미를 바이알 안으로 밀어 넣고 즉시 마개를 막으십시오. 거미를 마취시키기 위해 5~10 PSI의 이산화탄소 가스를 바이알에 10분 동안 주입하십시오. 거미가 마취 상태일 때 5분 이내에 복부와 두흉부의 초기 박리를 수행해야 합니다.마취된 거미를 작은 해부 접시에 넣습니다. 두흉부와 복부를 연결하는 좁은 자루 모양의 기부를 절단하여 복부를 분리합니다. 두흉부에는 거미의 독니가 포함되어 있으므로 적절하게 폐기해야 합니다.페트리 접시에 놓인 두흉부를 조심스럽게 꺼내어 하룻밤 동안 냉동시킵니다. 폐기하기 전, 복부에서 액체가 나오는 부위를 확인하여 다리 세포 클리핑으로 인해 거미 복부에 생긴 구멍의 위치를 찾습니다. 해부용 핀 하나를 사용하여 핀을 구멍을 통해 복부에 삽입함으로써 복부를 해부 트레이에 고정하며, 이때 거미의 받침대 부분이 해부자와 가장 멀리 떨어지고 스핀트 부분이 해부자와 가장 가깝게 위치하도록 방향을 잡습니다.미세 가위 한 쌍을 사용하여 pedes cell 클리핑의 구멍에서 시작하여 외골격의 양측을 통해 등쪽에 도달할 때까지 측면으로 절개합니다. 핀셋을 사용하여 전방 외골격 분절을 뒤로 젖히고 이 위치에 두 번째 핀을 꽂습니다. 다음으로, 초기 측면 절개 방향에서 90도 각도로 해부 트레이를 돌립니다.스핀트(spints)에 도달할 때까지 절개를 계속합니다. 절개선은 처음의 외측 절개선에 대해 수직 또는 수직 방향이 됩니다. 스핀트는 모래시계 모양 아래에 위치하며 원형의 외관을 가집니다.수직 절개를 할 때 스핀트를 절단하지 마십시오. 복부를 해부용 완충 용액에 담그십시오. 처음 만든 측면 절개 부위부터 시작하여 남은 외골격을 벗겨내십시오.이 과정이 완료되면, 흰색에서 노란색을 띠는 지방 조직이 핀셋을 통해 명확하게 보여야 합니다. 지방층의 대부분이 제거되어 견사선(silk glands)이 뚜렷하게 보일 때까지 지방을 조심스럽게 떼어내십시오. 알이 있다면 이를 제거해야 합니다.이 시점에서 다음과 같은 순서로 샘을 해부하십시오. 관형, 주요 채찍형, 응집 소형, 그리고 서양배형 순입니다. 각 샘에 대해 해부 순서대로 설명하겠습니다.관상 형태의 선(gland)은 다른 모든 선의 위에 위치하며, 복강 내에 풍부하게 분포하는 세 쌍의 매우 긴 원통형 관을 가지고 있습니다. 이 선들을 나머지 선들로부터 조심스럽게 떼어내십시오. 관을 통해 spinner reds에 부착된 상태를 유지하면서, 선들이 자유롭게 뜰 수 있게 하십시오.다음으로, 배(pear)에서도 발견되는 두 개의 주요 앰풀샘(ampule glands)을 조심스럽게 떼어냅니다. 이 샘들은 크고 초승달 모양이며, 길고 구불구불한 원위부 꼬리와 너비가 좁아지는 근위부 도관을 가지고 있습니다. 거미의 방저(spints)에 가까워지면 주요 앰풀샘을 제거하여 멸균된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.제거한 샘을 얼음에 놓으십시오. 다음으로, 편모 형성 샘을 제거합니다. 편모 형성 샘은 배 모양으로도 존재합니다.이는 제거 후 얼음에 놓은 spints를 향해 뻗어 내려가는 작은 원통형 지그재그 관이 있는 다엽 구조 주변에 위치합니다. 이어서, 부엽(minor alet)은 형태학적으로 주엽(major alet)과 매우 유사하지만 크기가 훨씬 작습니다. 쌍으로 존재하는 응집샘(aggregate gland)은 크고 다엽 구조이며, 크고 불규칙한 엽을 가진 매우 큰 배설관을 가지고 있습니다.정형태(sino formm) 선은 다수 존재하며 짧고 작은 손가락 모양의 돌기처럼 보입니다. 서양배형(piriform) 선은 복부에서 가장 작은 선이며, 여러 개의 조밀한 원통형 도관을 가지고 있어 부채 모양과 비슷하며, 많은 작은 배설관이 공기관(spiracles)까지 뻗어 있습니다. 이제 관형(tubular formm) 선만이 자유롭게 떠 있는 상태이므로, 핀셋으로 도관을 집어 공기관 부근의 배출 지점에서 떨어져 나갈 때까지 조심스럽게 당겨 제거합니다. 해부 후, 해부한 모든 선이 담긴 튜브를 액체 질소에 넣어 급속 냉동시킨 후 -80 °C에서 보관합니다.또는, 해부 과정 중 샘을 각각 분리한 직후 즉시 냉동할 수 있습니다. 이 그림은 샘에서 총 RNA를 분리한 후, 정량적 실시간 PCR 분석을 통해 피형샘을 제외한 서로 다른 실크 생성 샘에서의 실크 유전자 TUSP one mRNA 수준을 분리하여 보여줍니다. 관상샘에 TUSP one mRNA가 가장 많이 함유되어 있습니다.이 그림은 관상형 pheromone gland에서 추출한 단백질의 전형적인 아미노산 조성 프로파일을 보여줍니다. 파란색은 극성 곁사슬 그룹을 가진 아미노산을 나타내며, 빨간색은 비극성 곁사슬 그룹을 가진 아미노산 잔기를 나타냅니다. 이 그림은 insolution triptych 이후 piriform gland에서 얻은 단백질 추출물의 질량 분석 결과입니다.여기서 digestion here times two는 스펙트럼 강도의 2배 확대를 나타냅니다. 기호 pound로 표시된 스펙트럼 펩타이드 이온 질량은 개발 후 실크 피브로인 PYSP 1에서 유래한 펩타이드를 나타냅니다. 이 기술은 soak biology 분야 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.이 방법은 침지 섬유 생성, 실크 섬유 조립 및 압출에 관여하는 화학적 및 분자적 과정을 탐구하는 데 사용되었습니다. 이 기술을 정확하게 수행하면 1시간 30분에서 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 거미의 송곳니를 제거할 때까지 두 겹의 장갑을 착용하는 것이 중요합니다.이 방법의 끝에, 실크 생성샘을 사용하여 RNA와 단백질을 추출할 수 있습니다. 이러한 물질들은 정량적 실시간 PCR 및 질량 분석법과 같은 후속 응용 분석에 사용될 수 있습니다. 이러한 연구를 통해 수집된 정보는 실크 조립 및 실크 압출 경로를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.이 영상을 시청하신 후에는 암컷 검은과부거미로부터 서로 다른 7가지의 실 생산 샘을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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