E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

안녕하세요, Krete Lab의 William Tis입니다. 오늘은 저와 동료들이 E 15 마우스 배아의 자궁 내 주사법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Laura Elias입니다.

오늘은 뇌실 내 주입 및 전기천공법을 위해 미세주입 피펫을 준비하고 적재하는 방법을 보여드리겠습니다. 제 이름은 David Castaneda이며, 오늘은 생쥐 배아의 in vivo in utero 주입 과정을 돕겠습니다. 우리는 발달 중인 생쥐 배아의 외측 뇌실에 플라스미드 DNA를 주입할 것입니다.

우리는 배아의 CE 피질을 표적으로 하여, 추후 발달 과정에서 뉴런이 될 글리아 세포에서 서로 다른 분자들이 발현되도록 합니다. 이러한 자궁 내 주사를 수행할 때 사용해야 할 몇 가지 중요한 도구들이 있으며, 지금부터 보여드리겠습니다. 우리는 프리어(freer)와 몇 개의 애딘 핀셋(addin forceps)을 사용합니다.

하나는 톱니 모양의 한 쌍이고, 다른 하나는 끝부분에 작은 이빨이 있는 한 쌍입니다. 지혈鉗(hemostats) 한 쌍을 사용합니다. 이것은 가위입니다.

그런 다음 이 두 종류의 스테이플러를 사용합니다. 큰 것은 쥐(rats)에게 사용하며, 작은 것은 생쥐(mice)에게 사용합니다.

7번 스테이플을 사용하며, 여기서는 9번 스테이플을 사용하고 있으며 이는 단순히 스프링 하중 방식입니다. 수술을 돕기 위해 여기에서 사용하는 장비 중 일부로는, 더블 헤드가 장착된 단순한 광섬유 광원을 사용합니다. 온도를 유지하기 위해 따뜻한 물이 순환되는 가열 패드를 사용합니다.

작업대에는 BTX 사의 전기천공 시스템을 사용합니다. 배아의 크기에 따라 선택하여 사용할 수 있도록 몇 가지 다른 크기의 패들을 구비하고 있습니다. 파란색 면이 양극(+)입니다.

마우스의 경우 isoflurane 기화기를 사용합니다. 이를 통해 모체와 배아의 생존율이 높아지는 것을 확인하였습니다. 또한, 이를 통해 동물을 매우 빠르고 통제된 방식으로 의식 상태에서 넣고 뺄 수 있습니다.

따라서 저희는 이 방법이 매우 유용하다는 것을 알게 되었습니다. 이제 주입용 피펫의 끝을 비스듬하게 깎아(bevel) 보겠습니다. 이는 DNA를 로딩할 수 있을 만큼 피펫의 개구부를 충분히 크게 만드는 동시에, 주입 시 배아에 손상을 주지 않도록 매우 날카롭게 만들기 위해 매우 중요합니다.

또한 주입 시 배아에 손상을 입히면 치사율이 훨씬 높아지게 됩니다. 이는 바람직하지 않은 결과이므로, 이 수술 과정에서 매우 중요한 단계라고 할 수 있습니다.

먼저 회전하고 있는 베벨링 스톤 위에 물을 약간 붓습니다. 그런 다음 스틱 하나를 가져와서, 방금 뽑아낸 피펫을 테이프로 이 스틱에 고정합니다.

마이크로 매니퓰레이터 중 하나를 사용하여 피펫을 베벨 위에 고정하고 베벨 처리가 가능하게 하겠습니다. 이를 배치하고 현미경을 사용하여 피펫 팁을 관찰합니다. 베벨 위의 물속에 피펫을 바로 내려놓아 약간의 압력이 가해지도록 합니다.

여기서 팁이 스톤에 밀착되는 것을 보실 수 있습니다. 최소 15분 정도 베벨링이 되도록 둡니다. 저는 보통 1시간 정도 그대로 둡니다.

때로는 정말 매우 날카로워지기도 하지만, 피펫의 베벨(bevel)을 얼마나 길게 만드느냐는 전적으로 사람마다 다릅니다. 자, 여기 보시면 위쪽에 아직 베벨 처리를 하지 않고 당긴 피펫이 있습니다. 날카롭기는 하지만, DNA를 로딩할 수 있는 개구부가 없는 상태입니다.

이제 하단 피펫의 끝을 비스듬하게 깎아 각진 개구부가 만들어진 것을 확인할 수 있습니다. 이를 통해 DNA를 로딩할 수 있으며, 끝부분은 여전히 날카롭게 유지되어 조직 손상 없이 주입이 가능합니다. 이제 주입 피펫에 DNA를 채우겠습니다. DNA 주입 시 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharides)가 함께 주입되지 않도록 DNA를 엔도톡신 프리(endotoxin free) 상태로 준비하는 것이 중요합니다.

이제 DNA를 준비하고, 여기 파라필름(Parafilm)을 준비하겠습니다. 파라필름을 펼친 뒤, DNA를 수집하여 파라필름 위에 작은 점 형태로 찍어줍니다. 저는 보통 1.5~1.7 µg/µL 농도로 사용하는 DNA를 10 µL씩 취해 사용합니다.

이 fast green 염료를 약 1 µL 사용하겠습니다. 이것은 주입 위치를 파악하고 뇌실에 성공적으로 주입되었는지 확인하기 위한 용도입니다. 이제 이 fast green 염료를 DNA와 혼합하겠습니다.

그런 다음 주입 전극을 준비하고, 플런저를 뒤로 당겨 피펫을 채웁니다. 여기서 피펫의 베벨(beveled) 처리가 올바르게 되어 있고 개구부가 충분히 크다면, DNI가 꽤 쉽게 충전되는 것을 볼 수 있습니다. 때로는 올바른 충전을 돕기 위해 플런저를 앞뒤로 몇 번 움직여야 할 때가 있습니다.

그런 다음 이와 같이 피펫을 충전할 수 있습니다. 이제 DNA가 피펫에 완전히 충전되었으며 주입 준비가 되었습니다. 좋습니다, 이제 알코올과 요오드로 동물을 세척하겠습니다. 하지만 그전에 먼저 발가락 집기(toe pinch)를 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인하겠습니다. 상태가 양호해 보입니다.

이제 시작하겠습니다. 쥐 실험에서와 마찬가지로, 우선 에탄올로 시작하여 이 과정을 세 번 반복하겠습니다. 네, 요오드입니다.

감염 위험을 최소화하기 위해, William이 소독 솜을 펴서 손가락이 닿지 않은 부분으로 동물을 닦아내는 점에 유의하십시오. 이는 해당 부위의 청결도를 극대화하기 위함입니다. 둘째로, 복부 표면에 세균이 퍼지는 것을 방지하기 위해 단 한 번만 닦아냅니다.

좋습니다. 이제 주변을 간단히 정리하고 수술용 장갑을 착용하겠습니다. 네. 알겠습니다. 이제 마우스의 복부를 절개하여 자궁각을 적출하겠습니다. 먼저 피부를 살짝 집어 올리는 것부터 시작하겠습니다.

동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 집게 자극을 다시 한번 실시하겠습니다. 좋습니다. 이제 피부를 집어 살짝 들어 올려 주름을 만들면 절단하기가 더 수월합니다. 다시 한번 말씀드리지만, 혈관을 피하기 위해 동물의 정중선을 따라 절개해야 합니다.

보통 그런 식으로 피부를 절개하여 분리한 다음 근육을 노출시킵니다. 그렇게 하고 나면 근육의 정중선이 매우 뚜렷하게 보입니다.

근육 부위를 약간 잡아 절개하겠습니다. 이 정도 절개 크기가 적당하며, 이보다 더 크게 절개하지는 않겠습니다. 그다음 프리어를 사용하여 근육과 피부를 들어 올려 옆으로 젖힙니다. 그리고 내부를 매우 조심스럽게 탐색하여 두 배아 사이에 프리어를 위치시킨 후, 배아가 손상되지 않도록 조심스럽게 끌어내겠습니다.

때로는 다른 때보다 더 쉽게 될 때가 있습니다. 됐네요. 이렇게 그냥 부드럽게 끌어당기고, 다 통과시키고 나면 살짝 밀어서 꺼낼 수 있습니다.

배아를 절대 꼬집지 않는 것이 중요하며, 단순히 방향을 안내하거나 살짝 밀어주는 정도로만 다루어야 합니다. 또한, 배아를 꺼낸 후에는 항상 충분히 젖은 상태를 유지하여 건조해지지 않도록 주의해야 합니다.

그리고 다시 프라이어를 사용하여 여기를 탐색해 보겠습니다. 됐습니다. 아주 좋네요.

따라서 난소를 확인하지 않으면 하나가 내부에 남기 쉽기 때문에, 저는 항상 모든 조직이 완전히 제거되었는지 확인하고자 합니다. 그래서 다시 한번 매우 조심스럽게 조직을 끌어내며, 끝부분에 있는 난소를 찾아서 확인합니다. 이 동물에서 난소는 작은 붉은 조직 덩어리처럼 보입니다.

그런 다음 배아를 뒤집어 반대편을 확인하면 배아가 보이는 것을 알 수 있습니다. 따라서 배아가 계속 수분에 노출되도록 유지하십시오. 이제 준비가 되었습니다. 한 가지 강조하고 싶은 점은 배아를 매우 조심스럽게 잡아야 하며, 반드시 배아만 잡아야 한다는 것입니다.

혈관이 있는 부위를 잡지 마십시오. 혈관은 매우 쉽게 손상될 수 있으며, 이로 인해 동물에게 출혈이 발생하여 생존율이 급격히 떨어질 수 있기 때문입니다. 따라서 가장 먼저 해야 할 일은 DNA를 주입하려는 배아에서 머리 위치를 확인하는 것입니다. 이를 위해 동물을 조심스럽게 회전시키며 각 복측 부위를 관찰합니다.

따라서 이 특정 예시에서는 머리가 제 오른쪽에 있고 꼬리가 제 왼쪽에 가까이 있습니다. 정중선은 이 위치에 있으며, 윌리엄이 제가 주입할 수 있도록 배아를 적절한 방식으로 배치할 것입니다. 쥐의 경우와 마찬가지로, 저는 항상 머리가 모체의 오른쪽을 향하고 저를 마주 보도록 배치합니다.

이제 시작하겠습니다. 좋습니다, 왼쪽에 있는 바닥 폴이 보이실 겁니다. 약간만 이동하면 정확히 중앙선이 보입니다. 데이비드가 보기 좋은 위치에 있도록 조금 회전시켜 보겠습니다.

이제 좌심실에 주입을 진행하겠습니다. 여기서 좌심실이 DNA로 완전히 채워진 것을 확인할 수 있습니다. 일부 염료가 우심실뿐만 아니라 여기 제3심실과 제4심실까지 퍼진 것을 볼 수 있습니다.

이는 주입이 잘 되었음을 나타내는 좋은 지표입니다. 이제 세포 내로 DNA를 전기천공법으로 도입하겠습니다. 여기서 중요한 고려 사항은 어느 전극이 양극인지 파악하는 것입니다.

여기 파란색 손잡이가 달린 것이 양극이며, 이쪽을 DNA 전기천공법을 적용하려는 부위에 배치해야 합니다. 따라서 대부분의 DNA를 좌심실에 주입했으므로, 이와 같이 양극을 왼쪽에 배치하고 5회의 펄스를 가하면 됩니다. 전극과 자궁 사이의 접촉이 원활하고 전기 펄스가 적절하게 전달될 수 있도록 전극을 PBS에 완전히 적시는 것이 중요합니다.

이제 탐색이 완료되었으므로, 뿔을 다시 안으로 넣도록 하겠습니다. 방법은 뿔을 한쪽으로 아주 조심스럽게 밀어낸 뒤, 손을 넣어 근육과 피부를 잡고 아주 부드럽게 다시 안으로 밀어 넣는 것입니다. 좋습니다.

방광에 주의하십시오. 반대쪽은 제가 하겠습니다. 그런 다음 가볍게 흔들어 내부에서 잘 자리 잡게 합니다.

포셉을 사용하여 부드럽게 펴줍니다. 그런 다음 3 mL의 항생제-항진균제로 세척하겠습니다. 봉합을 시작하기 전에 토 핀치(toe pinch)를 통해 완전히 마취되었는지 확인하겠습니다.

괜찮아 보이네요. Henry Shine 6번 외과용 봉합사를 사용하겠습니다.

저는 블록 스티치(block stitches)를 선호합니다. 고정력이 더 좋다고 생각하기 때문입니다. 우선 바늘을 통과시킨 다음, 실을 끌어당겨 세 번 감고, 끝부분을 잡아 끌어당기는 것으로 시작하겠습니다.

1, 2, 3, 남은 부분을 잘라냅니다. 이렇게 일정한 간격으로 계속 내려가며 팽팽하게 당겨줍니다. 그리고 절개 부위가 끝나는 지점보다 약간 더 나간 곳에서 다시 묶어줍니다.

이제 그 부분에 접근하겠습니다. 조직이나 피부를 약간 뒤로 당겨 줍니다. 그곳에 약간의 출혈이 있습니다.

괜찮을 것입니다. 가끔 발생하는 출혈에 대비해 소작기를 비치해 두고 있으며, 소작기는 출혈을 멈추는 데 효과적입니다.

이제 절개 부위를 지났습니다. 여기서 멈추겠습니다. 실을 끌어올려 루프를 만든 다음, 세 번 회전시키고, 루프를 잡아 아래로 당깁니다.

세 번 정도 회전시킨 후, 루프를 잡아 당겨 통과시키고, 나머지 여분은 제거합니다. 바늘은 손상성 폐기물 함에 버립니다. 그다음 스테이플러를 사용하겠습니다.

이 동물에는 7번 스테이플을 사용할 것입니다. 생쥐에는 7번을 사용하며, 쥐에는 9번을 사용합니다.

피부를 잡고 약간 들어 올린 다음, 클립을 집기 시작하십시오. 다시 클립을 잡습니다. 절개 부위를 약간 넘어서는 지점까지 일정한 간격으로 배치하면 됩니다.

전체 부위를 알코올 솜으로 닦아냅니다. 그다음 통증을 느끼지 않도록 buprenorphine을 주입하겠습니다. 그리고 앞으로 며칠 동안 그녀가 건강한 상태를 유지하고 통증이 없는지 계속해서 모니터링할 예정입니다.

이제 부프레노르핀(buprenorphine) 주사를 마쳤으므로, 실험동물이 깨어났을 때 편안함을 느낄 수 있도록 원래의 케이지에 다시 넣겠습니다. 그런 다음 인큐베이터에 넣고 완전히 깨어나고 몸이 마를 때까지 약 20분 정도 그대로 둡니다. 이제 플라스마 DNA의 in vivo in utero 전기천공법 수행 방법을 보여드리겠습니다. 우리는 어떤 분자든 주입할 수 있습니다.

DNA일 수도 있고 약물일 수도 있습니다. 성장 인자일 수도 있습니다. 이러한 분자들을 세포 내로 전달해야 하는데 수동 확산으로 통과하지 않는 경우, 전기천공법이 필요하며 이를 위해서는 분자가 전하를 띠고 있어야 합니다.

하지만 기본적으로 그 가능성은 무궁무진합니다. 세포 내로 유전자를 전달하기 위한 대체 벡터의 한 가지 예로 바이러스를 들 수 있습니다.

과거에 우리는 레트로바이러스를 사용하여 gls를 DNA로 표지함으로써, 이들이 어떻게 분열하여 뉴런이 되고 최종적으로 피질로 이동하는지 확인해 왔습니다. 세포를 바이러스로 표지하거나 전기천공법을 사용하거나, 혹은 뇌 발달에 영향을 미치는 약물이나 다른 분자들을 주입함으로써 이를 수행할 수 있습니다. 여러 가지 기법을 통해 이를 연구할 수 있는데, 그중 하나는 장기배양 뇌 절편 배양을 이용한 타임랩스 촬영입니다.

그런 다음 현미경을 사용하여 세포의 운명을 추적합니다. 여기 보시면 시간 0.0일 때, 측뇌실과 매우 가까운 세포 클러스터에서 시작하는 것을 알 수 있습니다.

시간이 흐름에 따라, 세포들이 뇌실 구역(ventricular zone) 밖으로 나와 피질판(cortical plate) 쪽으로 이동하기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 또한, 배아를 고정하고 면역조직화학 염색을 수행하여 다양한 분자의 분포를 연구하거나 이러한 서로 다른 세포들의 운명을 결정합니다. 또 다른 가능성으로는 전기생리학적 분석을 수행하는 방법이 있습니다.

라벨링된 세포를 식별한 후 전기적 특성을 연구합니다. 오늘 함께해 주셔서 감사합니다. 저희의 시연이 도움이 되었기를 바라며, 귀하의 실험이 성공적으로 진행되기를 기원합니다.

궁금한 점이 있으시면 언제든지 문의하시기 바랍니다. 행운을 빕니다.