Name: Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 학습하세요 인간 신경 줄기 세포의 효율적인 전기천공법 전사 방법을. Amaxa Nucleofector를 사용하여 높은 전사 효율과 세포 생존율을 달성하는 신경과학 연구의 핵심 기술입니다.

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저자는 어린이의 병원, hNSPC 문화를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.

참고 : Passaging 인간 신경 줄기 세포 문서 (참조 <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) 및 계산 인간 신경 줄기 세포 문서 ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / 색인 / Details.stp? ID = 262</a> hNSPCs을 resuspend하고 계산하는 방법을 알아보려면). 준비 <ol><li> transfection에 사용할 세포의 많은 (각 DNA를 수백만 세포 transfected 수)가있다는 것을 확인하십시오. </li><li> transfected 세포가 10 μg / ML 인간 fibronectin transfection 전날 밤 함께 씨앗을하게됩니다으로 코팅 조직 문화 요리. 오른쪽 transfection 프로토콜을 시작하기 전에, fibronectin을 제거 PBS로 접시를 씻어하고 접시에 장소 문화 미디어. 미디어를 따뜻하게하기 위해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. 또한, 37 미리 따뜻한 ° C.하는 보육 문화 미디어 1 ML을 배치 </li><li> transfected로 DNA (들), 그리고 얼음에 transfection 솔루션 (Amaxa에서), 장소. </li></ol> Transfection <ol><li> PBS (우리가 일반적으로 X 106 세포 transfection 회 ~ 5 사용)과 함께 세포의 정의된 번호를 씻으십시오. 펠렛 원심 분리 (5 분 1,000 RPM (~ 200xg))에 의해 세포, 가능한 한 많은 PBS로 제거하고, transfection 키트와 함께 제공되는 transfection 솔루션 100 μl의 세포 펠렛을 resuspend. 1.7 ML eppendorf 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 세포 현탁액에 DNA 5 μl를 (transfection마다 DNA의 ~ 50-10 μg) 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> Amaxa 미니 피펫을 사용하여 Amaxa의 transfection의 쿠베트에 세포 DNA 믹스를 전송할 수 있습니다. 당신이 다음 단계에 대한 사전 예열 문화 미디어 1 ML을 가지고 있는지 확인하십시오. 또한, 인큐베이터에서 문화 매체와 세포 접시를 제거하고 조직 문화 후드에 놓으십시오. </li><li> Nucleofector에 쿠베트를 놓고, 바퀴가 시계 방향으로 회전 및 프로그램 &quot;A - 033&quot;을 선택하십시오. 를 입력한 다음 Enter 키를 누릅니다. </li><li> 성공적인 transfection은 쿠베트의 솔루션 위에 거품이 매우 고밀도 레이어의 존재로 표시됩니다. 쿠베트에 500 μl 따뜻한 미디어를 추가하고 Amaxa 미니 피펫을 사용하여 미리 예열 미디어 함께 그릇에 transfected 세포를 전송합니다. 더 따뜻한 미디어 쿠​​베트을 씻어 같은 접시에 린스를 추가합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터의 세포와 접시를 놓습니다. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

이 프로토콜은 hNSPCs에 대해 상대적으로 신속하고 효율적인 transfection 절차를 설명합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 ~ 35 %의 초기 transfection 효율을 획득했습니다. 선택 에이전트가 안정 transfected 인구를 생성하는 데 사용되는 경우에는이 절차에 의해 transfected 세포 단기 연구 (transiently transfected 세포) 또는 장기적인 연구에 사용될 수 있습니다. 우리는 외인성 단백질을 표현하는 세포의 70 %를 ~하는 안정 transfected 세포를 생성합니다. transiently transfected hNSPCs, 우리는 ~ 7 일 동안 외인성 단백질의 지속적인 표현을 관찰했습니다.

<table><tbody><tr><td>Nucleofector 장비</td><td>도구</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>마우스 신경줄기세포 nucleofector 키트</td><td>시약</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

amaxa nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 transfecting

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

이러한 일반적으로 사용되는 양이온 지질 transfection의 시약과 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)로 기본 포유류의 신경 세포의 Transfection은 종종 가난한 세포 생존 능력과 낮은 transfection 효율 결과입니다. 이러한 유전자 총을 또는 microinjection 같은 관심의 유전자를, 도입의 다른 기계적 방식은 또한 가난한 세포 생존과 transfected 세포의 낮은 숫자로 제한됩니다. 기본 세포로 외인성 유전자를 도입 바이러스 구조를 사용하는 전략은 바이러스 벡터 및 잠재적인 안전 문제를 만드는 데 필요한 시간의 금액과 노동 모두에 의해 제약되었습니다. 우리는 여기서 특별히 신경 줄기 세포를 transfecting에 최적화된 전류 매개 변수 및 버퍼 솔루션으로 Amaxa의 Nucleofector 장치와 기술을 사용하여 hNSPCs을 transfecting위한 단계별 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 ~ 35 %의 초기 transfection 효율을 달성하고 안정적​​인 transfection 후 70 % ~했습니다. 프로토콜은 장치와 함께 Nucleofector electroporation 다음 해당 버퍼에 transfected하는 DNA와 hNSPCs 높은 숫자를 결합 알아볼 수 있습니다.

셀에 관심 유전자를 소개하면 생체내 년에 기능을 elucidating위한 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 Amaxa 만든 Nucleofector electroporation 장치를 사용하여 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 문화를 transfecting의 효율적인 방법을 설명합니다.

Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting

인간 신경줄기/전구세포(hNSPCs)와 같은 일차 포유류 신경세포에 일반적으로 사용되는 양이온성 지질 트랜스펙션을 통한...

안녕하세요, 저는 Steve입니다. 저는 UC Irvine 병리학과 Flanagan 박사님 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 maxis nuclear factor를 사용하여 인간 신경 전구 세포를 형질전환하는 방법을 보여드리겠습니다.먼저 시작하려면 많은 수의 세포가 필요합니다. 본 프로토콜은 매우 높은 세포 밀도를 요구하므로, 최소한 컨플루언트(confluent) 상태의 T 25 플라스크 하나, 즉 최소 100만 개의 세포가 필요합니다. 우선, 세포 해리 버퍼(cell dissociation buffer)를 사용하여 표면에서 세포를 떼어낸 후 세포 수를 측정하겠습니다.해당 절차에 대해서는 저의 패키징 프로토콜을 참조하십시오. 제가 형질전환 실험에 Amaxa를 선호하는 이유는 Amaxa가 특정 세포 유형, 제 경우에는 신경 줄기세포를 위한 맞춤형 형질전환 프로토콜을 개발하기 때문이며, 이는 매우 효과적입니다.매우 높은 transfection 효율과 세포 생존율을 나타냅니다. 이제 시작해 보겠습니다. transfection을 수행할 준비가 되었습니다.따라서 이번 transfection을 준비하기 위해, 조직 배양 접시를 fibrin으로 미리 코팅하여 하룻밤 동안 두었습니다. 그 후, 성장 배지를 접시에 넣었습니다. 현재 접시는 세포를 접종하기 위해 인큐베이터 안에 보관 중입니다.또한, 모든 시약과 DNA 벡터, 형질전환 용액을 모두 준비했습니다. 이들은 모두 이곳 얼음 위에 대기 중입니다. 이제 형질전환을 시작할 준비가 되었습니다.이것은 M max nuclear factor이며, 후드에 넣기 전에 70% ethanol로 소독한 다음 페이퍼 타월로 닦아내겠습니다. 총 4 million cells가 되도록 세포 수를 측정하여 분주해 두었습니다. 이제 transfection을 시작할 준비가 되었습니다.먼저 세포가 들어있는 배지를 제거하겠습니다. 여기에 세포 펠렛이 준비되어 있으며, 배지를 흡입하여 제거하겠습니다. 트랜스펙션 배지 내에 단백질 등이 포함되어 있으면 트랜스펙션 프로토콜에 영향을 줄 수 있으므로, 가능한 한 많은 양의 배지를 제거하도록 하겠습니다.거의 모든 배지를 제거했으므로, 이제 이 세포 펠릿을 100 µL의 특수하게 조제된 마우스 신경 줄기세포 핵 인자 솔루션에 재부유시키겠습니다. Mxa에서 마우스 신경 줄기세포 형질전환을 위한 형질전환 솔루션을 판매하고 있는데, 인간 신경 줄기세포용은 없지만 마우스

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자 변형의 최근 발전에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs)의 transfection은 변덕 과정 남아있다. 우리의 지식, 인간 유도 만능 줄기 세포를 (iPSCs) transfect하는 체계적이고 효율적인 방법은보고되지 않았습니다. 여기, 우리는 효율적으로 transfect과 인간 iPSCs를 nucleofect하는 강력한 프로토콜을 설명합니다.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

이 비디오는 TALEN을 사용하여 표적 자리에서 이중 가닥 절단을 생성하고 형광 단백질 유전자 통합을 위한 상동성 유도 복구를 유도하는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 정밀한 게놈 편집 기술을 설명합니다.

TALEN 매개 표적 유전자 통합: 형광 단백질 유전자를 hiPSC에 정밀하게 삽입하기 위해 엔지니어링된 염기서열 특이적 뉴클레아제 사용

이 비디오는 유전적으로 변형된 조혈전구세포를 신경세포 줄기세포로 직접 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다. 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell)에 의해 발현되는 전사 인자(transcription factor)는 연쇄 반응(cascade of molecular events)을 유발하여 변형을 촉진합니다. 추가 특이적 배지는 유도된 신경 줄기 세포를 선택하고 성장시키는 데 사용됩니다.

조혈전구세포(Hematopoietic Progenitor Cells)를 신경 줄기세포(Neural Stem Cells)로 직접 재프로그래밍(Direct Reprogramming of Hematopoietic Progenitor Cells into Neural Stem Cells)

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서 TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

여기에서는 화학적으로 재프로그래밍된 줄기세포를 엔지니어링하여 이러한 세포를 도파민성 전구세포로 분화하고, 파킨슨병의 마우스 모델에 이식하고, 이식된 세포의 성공적인 통합 및 기능적 효과를 확인하기 위해 행동 및 전기생리학적 결과를 평가함으로써 정확한 신경 조절을 달성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경퇴행성 질환 치료에서 재프로그래밍된 줄기세포 유래 전구세포의 화학유전학적 조절

학습하세요 인간 신경 줄기 세포의 효율적인 전기천공법 전사 방법을. Amaxa Nucleofector를 사용하여 높은 전사 효율과 세포 생존율을 달성하는 신경과학 연구의 핵심 기술입니다.

Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting

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