Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting

안녕하세요, 저는 Steve입니다. 저는 UC Irvine 병리학과 Flanagan 박사님 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 maxis nuclear factor를 사용하여 인간 신경 전구 세포를 형질전환하는 방법을 보여드리겠습니다.

먼저 시작하려면 많은 수의 세포가 필요합니다. 본 프로토콜은 매우 높은 세포 밀도를 요구하므로, 최소한 컨플루언트(confluent) 상태의 T 25 플라스크 하나, 즉 최소 100만 개의 세포가 필요합니다. 우선, 세포 해리 버퍼(cell dissociation buffer)를 사용하여 표면에서 세포를 떼어낸 후 세포 수를 측정하겠습니다.

해당 절차에 대해서는 저의 패키징 프로토콜을 참조하십시오. 제가 형질전환 실험에 Amaxa를 선호하는 이유는 Amaxa가 특정 세포 유형, 제 경우에는 신경 줄기세포를 위한 맞춤형 형질전환 프로토콜을 개발하기 때문이며, 이는 매우 효과적입니다.

매우 높은 transfection 효율과 세포 생존율을 나타냅니다. 이제 시작해 보겠습니다. transfection을 수행할 준비가 되었습니다.

따라서 이번 transfection을 준비하기 위해, 조직 배양 접시를 fibrin으로 미리 코팅하여 하룻밤 동안 두었습니다. 그 후, 성장 배지를 접시에 넣었습니다. 현재 접시는 세포를 접종하기 위해 인큐베이터 안에 보관 중입니다.

또한, 모든 시약과 DNA 벡터, 형질전환 용액을 모두 준비했습니다. 이들은 모두 이곳 얼음 위에 대기 중입니다. 이제 형질전환을 시작할 준비가 되었습니다.

이것은 M max nuclear factor이며, 후드에 넣기 전에 70% ethanol로 소독한 다음 페이퍼 타월로 닦아내겠습니다. 총 4 million cells가 되도록 세포 수를 측정하여 분주해 두었습니다. 이제 transfection을 시작할 준비가 되었습니다.

먼저 세포가 들어있는 배지를 제거하겠습니다. 여기에 세포 펠렛이 준비되어 있으며, 배지를 흡입하여 제거하겠습니다. 트랜스펙션 배지 내에 단백질 등이 포함되어 있으면 트랜스펙션 프로토콜에 영향을 줄 수 있으므로, 가능한 한 많은 양의 배지를 제거하도록 하겠습니다.

거의 모든 배지를 제거했으므로, 이제 이 세포 펠릿을 100 µL의 특수하게 조제된 마우스 신경 줄기세포 핵 인자 솔루션에 재부유시키겠습니다. Mxa에서 마우스 신경 줄기세포 형질전환을 위한 형질전환 솔루션을 판매하고 있는데, 인간 신경 줄기세포용은 없지만 마우스 세포용을 사용하는 것이 매우 효과적이라는 것을 확인했습니다. 따라서 이 마우스 신경 줄기세포 핵 인자 솔루션을 100 µL 추가하겠습니다.

그리고 세포 펠렛을 그 안에 매우 잘 재현탁하여 세포 덩어리가 남지 않도록 하겠습니다. 이를 통해 거의 균질한 세포 현탁액을 만들 것입니다. 따라서 피펫팅을 약 10회 정도 반복하겠습니다.

이제 혼합물이 상당히 균질하게 섞인 것으로 보이므로, 이를 1.5 mL 오픈 도어프 튜브(open dorf tube)로 옮기겠습니다. P 1000 피펫을 사용하여 용액을 모두 옮기도록 하겠습니다. 이제 마우스용 신규 transfection 용액에 4x10⁶개의 세포가 재현탁되었으며, 여기에 벡터 5 µL를 추가하겠습니다.

지금까지 계속해서 얼음 위에 보관해 왔습니다. 이제 먼저 5 µL를 취하여 세포 현탁액에 첨가하겠습니다.

이제 약 50 µL로 설정된 P 200 피펫을 사용하여 세포와 벡터를 매우 충분히 혼합하겠습니다. 따라서 피펫팅을 10회 반복하여 섞어주겠습니다. 이제 준비가 되었습니다.

이제 트랜스펙션을 진행하겠습니다. 먼저 새 큐벳을 열고, Amaxa에서 제공하는 전용 피펫을 준비하겠습니다.

이제 캡을 제거하고 혼합물을 조심스럽게 끌어올리겠습니다. 그리고 피펫을 튜브 안으로 끝까지 넣고 용액을 천천히 분사하겠습니다. 이제 max nuclear factor를 켜고, 값을 330 33으로 설정한 후 엔터를 누르겠습니다.

그런 다음 vete를 vete 홀더에 넣고 휠을 회전시키면 형질전환 준비가 완료됩니다. 하지만 그전에, 형질전환된 세포에 즉시 첨가할 수 있도록 따뜻한 배지를 미리 준비해 두겠습니다. 형질전환 직후에 vete에 따뜻한 배지를 첨가하면 세포 생존율을 높이는 데 도움이 됩니다.

따라서 P 1000 파이펫을 준비하겠습니다. 또한, 세포를 즉시 배지로 옮길 수 있도록 현재 인큐베이터에 보관 중인 배지가 담긴 플레이트를 가져오겠습니다. 이제 다시 엔터를 누르면 완료됩니다.

성공적인 형질전환의 경우, 보시는 바와 같이 매우 두꺼운 거품 층이 형성되어 성공적인 형질전환이 이루어졌음을 나타냅니다. 이제 vete에 500 µL의 예열된 배지를 추가하겠습니다. 세포에 필요한 배지를 더 추가한 후, 동일한 MX 피펫을 사용하여 vete에서 세포를 꺼내겠습니다.

따라서 현재 세포들이 매우 스트레스를 받은 상태입니다. 그러므로 세포들을 따뜻한 배지가 더 담긴 곳으로 직접 옮기겠습니다. 마지막 단계로, 모든 세포가 완전히 옮겨졌는지 확인하기 위해 미리 데워둔 배지로 Q vete를 더 헹군 다음, 이를 동일한 L 웰에 넣고 즉시 플레이트를 인큐베이터에 넣겠습니다.

이 이미지에서는 핵 인자로 트랜스펙션된 후 그리드 커버슬립에 도말된 인간 신경 전구 세포를 볼 수 있습니다. 트랜스펙션 2일 후에도 GFP 발현을 통해 약 50%의 트랜스펙션 효율을 확인할 수 있습니다. 오늘 저는 Xis 핵 인자를 사용하여 인간 신경 전구 세포를 트랜스펙션하는 방법을 보여드렸습니다.

성공적인 transfection이 되기를 바랍니다.