Name: Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 미세패턴 표면을 이용한 암세포와 히알루론산 상호작용 분석 방법을. 카보디이미드 화학 및 마이크로콘택트 프린팅 기술로 암세포 부착, 이동, 성장을 시각화하여 종양 미세환경 역학을 연구합니다.

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저자는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 통해 재료 연구 과학 및 엔지니어링 센터의 일환으로 후원 존스 홉킨스에​​서 표면 분석 연구실의 사용을 인정합니다. LED가 IGERT 트레이와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구원입니다. 이 연구는 부분적으로 NIH 부여 U54CA143868에 의해 지원되었다.

1. Micropatterned 스탬프 제작 표준 석판술 <ol><li> 에탄올과 함께 새로운 실리콘 웨이퍼를 씻어 공기의 흐름과 건조. 웨이퍼를 처리하고 전체 과정에서 표면 결함을 방지하기 위해 집게를 사용하십시오. </li><li> coater를 한 바퀴 돌리고 SU - 2025 부정적인 포토 레지스트와 웨이퍼 표면을 커버하기 위해 웨이퍼를 전송합니다. 포토 레지스트와 웨이퍼의 적어도 80 %를 커버. 3000rpm에서 30 초 뒤에 600rpm에서 10 초 스핀 코트. 포토 레지스트의 photosensitivity으로 인해,이 시점에서 객실 조명을 끄십시오. </li><li> 3 분 95 ° C에서 "부드러운 빵을"에 대한 뜨거운 접시에 코팅된 실리콘 웨이퍼를 포토 레지스트 전송합니다. 핫 플레이트에서 제거하고 1 시간 냉각 수 있습니다. </li><li> 포토 레지스트 덮인 실리콘 웨이퍼 위에 원하는 패턴으로 미리 가공 마스크를 놓고 20 초 동안 자외선 (UV) 조사 (350-450 nm의)에 노출. </li><li> 110 "하드 베이킹"에 철판 ° 육분 위해 C로 전송 실리콘 웨이퍼. </li><li> 불을 켜고 철판에서 웨이퍼를 제거합니다. 독특한 패턴이 시점에서 볼 수 있습니다. </li><li> SU - 8 포토 레지스트 개발로 실리콘 웨이퍼를 주의깊게 린스. 개발자 솔루션 3 rinses 후 에탄올로 린스. 모든 백색 잔류물이 있으면, 포토 레지스트 개발 솔루션과 헹굼 반복하거나 잠수함 웨이퍼를 개발자 솔루션 2 분 헹구세요 에탄올로 다시 진행합니다. 물, 공기 건조와 함께 씻으십시오. </li><li> 믹스 polydimethylsiloxane (PDMS) 10시 1분 무게 비율에 엘라스토머 솔루션과 치료 요원. 공기 방울을 제거하는 5 분간 900rpm에서 원심 분리기. </li><li> 장소는 배양 접시에있는 웨이퍼 패턴과 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 잔. 몇 분 현재 거품, desicator의 장소와 진공이있다면 거품이 사라까지. </li><li> 보완 탄성 스탬프를 형성 실내 온도 (RT)에서 하룻밤 치료. PDMS는 완전히 30 분 60 ° C에서 오븐에서 개최 12시간 후 치유되지 않을 경우. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 제거합니다. 원하는 크기로 도장을 절단하는 레이저 에지를 사용하십시오. 15 분간 에탄올에 Sonicate. 웨이퍼 새로운 탄성 우표를 만드는 여러 번 이용하실 수 있습니다. </li></ol> 2. HA의 Micropatterning <ol><li> 플라즈마 깨끗한 유리는 5 분 동안 슬라이드. 5 분 챔버와 진공로 모든 슬라이드를 놓습니다. 다음 챔버를 입력 산소의 낮은 흐름을 허용합니다. 5 분에 플라즈마 청소기를 돌립니다. 포셉를 사용하여 배양 접시에있는 플라즈마 청소기와 장소에서 제거합니다. </li><li> 플라즈마 세정 동안 15 분 동안 에탄올의 PDMS 스탬프를 sonicate. </li><li> 15 ML의 원심 분리기 튜브의 95% V / V 에탄올 3 - aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)의 신선한 3퍼센트 V / V 솔루션을 준비합니다. silanol를 형성 RT에서 5 분간 반응하도록 허용합니다. </li><li> 플레이스 PDMS의 스핀 coater 척의 패턴까지 우표와 커버 APTMS 솔루션으로 표면을 패턴. 30 초 동안 3500rpm에서 Spincoat. , PDMS 스탬프만을 면을 도장 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 패턴 측면의 한쪽 끝을 아래로 향하게 설정 스탬프를하고 1 분 유리 표면과 접촉 완전히되도록 부드럽게 PDMS를 눌러 글라이드 : 플라즈마에 전송 APTMS 솔루션은 유리 표면을 청소. </li><li> PDMS는 부드럽게 도장 제거하고, 패턴 유리 슬라이드 30 분 RT에서 품어 수 있습니다. 에탄올과 공기 건조와 패턴 표면을 씻어. Sonicate PDMS 초과 APTMS을 제거하는 15 분 동안 도장. </li><li> 115에서 1 시간 동안 오븐이나 뜨거운 접시에 열 표면 ° C. 에탄올로 씻어 건조 공기. </li><li> [메톡시 (polyethyleneoxy) 프로필] 톨루엔에 trimethoxysilane - 신선한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 실란 20% V / V 2 솔루션을 준비합니다. 이 패턴을 둘러싼 않은 지역 접착제 역할을합니다. </li><li> 75에서 45 분 동안 PEG - 실란 솔루션 유리 페트리 접시와 부화 전송 패턴 유리 슬라이드 뜨거운 접시에 ° C. 톨루엔, 물, 공기와 건조와 린스. </li><li> 생물 학적 안전 캐비닛에 UV 살균 방사선을 사용하여 1 시간 소독. 불임을 유지하기 위해이 시점에서 생물 학적 안전 캐비넷에서 진행합니다. </li><li> 수성 멸균 HA 솔루션을 준비합니다. 1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide (EDC)의 10mM N - hydroxysuccinimide의 5mM 50μg / ML 플루오레신 - 분류 HA </li><li> 무균 조건에서 패턴 유리 기판에 HA 솔루션을 적용하고 빛으로부터 보호. 패턴 기판은 16-24시간 위해 그대로해야합니다. </li><li> HA 솔루션을 기음과 씻어 인산염 버퍼 호수 (PBS), 1 시간 동안 PBS에서 (BSA) 1% 소 혈청 알부민과 표면을 커버. 표면은 이제 세포 배양을위한 준비가되었습니다. </li></ol> 3. HA Micropatterned 표면에 세포 배양 <ol><li> 확장 MDA - MB - 231 제조 업체의 지시에 따라 인간의 유방암 세포 LS174T 대장암 암종 세포. </li><li> 0.4과 1x10 사이의 밀도와 암 세포의 씨앗 단세포 suspensions <sup18.75 cm>2 유리 면적 당 및 HA에&gt; 6 암세포는 표면 고정화. 5 % CO 2 관리 대기 속에서 humidified 인큐베이터 (37 ° C)에서 알을 품다. 세포 접착은 24 시간 이내에 발생해야하며 거꾸로 가벼운 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다 </sup18.75></li><li> 세포 배양 표면은 표준 보육 조건 5 일 이내에 유지 수 있습니다. 매일 미디어를 변경합니다. 세포 형태학 및 성장은 거꾸로 광 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다. 추가 셀룰러 assays은 HA의 표면에 반응을 분석하기 위해 적용할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : covalently APTMS 패턴 유리 슬라이드에 HA를 무력화하는 데 사용 carbodiimide 화학은 그림 1A에 표시됩니다. EDC는 아민 반응 중간체를 형성하기 위해 HA 카르 복실 그룹과 반응 길이가 0 인 crosslinking 에이전트입니다. 이 중간은 가수 분해에 감염될이므로, NHS는 carbodiimide 반응 효율을 높이는 추가됩니다. HA 솔루션은 APTMS micropatterns, HA 중급 ATPMS의 기본 아민 간의 안정적인 아미드 결합 형태와 상호 작용으로. HA 패턴 표면의 예입니다 (1B - C 그림) 표시됩니다 HA의 패턴 고정을 입증 형광 현미경과 ImageJ 형광 강도 분석을 사용하여 시각. HA micropatterned의 표면 expgenous HA와 암 세포의 상호 작용 연구를 활성화합니다. 두 MDA - MB - 231 인간의 모유와 LS174t 인간의 결장암 세포 라인은 우선적으로 HA micropatterned 영역 (그림 2)을 준수. 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 고해상도 이미지는 HA 고정화 표면 (그림 3)과 교양 세포의 상호 작용을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 HA micropatterned 표면 HA 기능성 표면의 발전을 설명하는 (A) 도식, 플루오레신의 (B) 형광 이미지 (녹색) 표시 HA micropatterned 표면. (C) 3D 픽셀 분포지도 이산 HA 패턴을 보여주 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다. 스케일 바 = 100μm. Elsevier의 허가를 9 수정. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> HA micropatterned 표면에 그림 2. 암 세포 접착. 콜론 (A)과 유방 모두 (B) 암종 우선적으로 문화 24 시간과 HA 패치에 준수. Elsevier의 허가를 9 수정. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> HA와 그림 3. 암 세포 상호 작용. (A) 결장암 세포 낮은 배율 (왼쪽)와 높은 배율 (오른쪽, 왼쪽에있는 사각형)에서 표시 HA 표면에 (A) 교양의 전자 현미경 이미지를 검색 및 유방암 세포 (B)에서 그림 HA 표면에 교양 낮은 배율 (왼쪽)와 높은 배율 (오른쪽, 왼쪽에있는 사각형).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

허가 전재 비디오 도식 그림, 저작권 빌리 - VCH Verlag GmbH를 &amp; 주식 KGaA. 디킨슨 LE, Kusuma S, Gerecht S.은 biomaterials를 사용하여 배아 줄기 세포의 분화의 틈새를 재구성. Macromol. Biosci. 2010; 10월 21일. [인쇄 앞서 Epub].

제시 HA의 micropatterning 방법은 외인성 HA와 세포 상호 작용의 연구를 수 있습니다. HA는 암 진행 1 핵심적인 역할을하는 것으로 알려져 있지만 2 차원 패턴 HA 표면에 암 세포의 상호 작용을 조사 제한된 연구가있다. 외인성 HA의 micropatterns에 대한 제어 연구는 암 세포 부착, 성장, 및 마이 그 레이션의 고해상도 시각화를 허용하고 암이 더 기초를 명료하게하다 수 있습니다. carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄를 결합함으로써, 우리는 암 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 별개의 HA 패턴과 표면을 개발했습니다. 이 방법을 포함하여 세포 배양 및 분석 기술을 지속적으로 패턴 표면 호환 가능하지만, immunofluorescent 얼룩에 국한되지, 전자 현미경, 억제, 마이 그 레이션 등을 스캔 또한, photolithographic 기술을 특정 응용 ...

<table><tbody><tr><td>SU-2025 포토레지스트</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 현상액</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 표지 히알루론산 (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>DI water 10ml로 재구성</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 유방암 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t 결장암 세포</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterned 표면은 암세포와 hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

암 침공과 진행은 종양 microenvironment 내에서 성장 요인 / 크린 시토킨 및 세포외 매트릭스 (ECM) 구성 요소에 의해 복잡한 규제하에있는 운동성이있는 세포 표현형을 포함합니다. Hyaluronic 산 (HA)은 강화 침략, 성장 및 angiogenesis 1 종양 진행을 촉진하는 것으로 알려져 하나 stromal ECM 구성 요소입니다. HA의 상호 작용은 세포 표면 수용체 CD44는 따라서 전이성 확산 2-3 증가, 종양 세포 성장, 생존 및 마이 그 레이션을 촉진 이벤트를 신호 유도와 함께. HA는 D - glucuronic 산성 및 DN - acetylglucosamine의 단위를 반복 구성된 음이온, nonsulfated glycosaminoglycan입니다. 반복 disaccharide 단위의 카르 복실와 수산기 그룹의 존재로 인해 고유의 HA는 주로 친수성과 photoreative 고정 4-5에 대한 황산 그룹을 소개 화학 수정 의무가 있습니다. 표면에 HA의 immobilizations 관련된 이전 연구는 6-7 표면에 세포 부착을 제어하기 위해 HA의 bioresistant 행동과 그 sulfated 파생을 활용한다. 이러한 연구의 세포 접착에 우선적으로 비 HA 패턴 영역에서 발생합니다. 외인성 HA와 세포 상호 작용을 분석하기 위해, 우리는 제어 연구 및 HA와 암 세포의 상호 작용 고해상도 시각화를 활성화 패턴 기능화 표면을 개발했습니다. 우리는 유리 표면에 HA의 이산 패턴 영역을 정의하는 microcontact 인쇄 (uCP)을 활용. HA를 무력화하기 위해 carbodiimide 링크 화학을 적용 &quot;tethering&quot;접근 방식은 8 사용되었다. 유리 표면 microcontact aminosilane로 인쇄되었으며 패턴 배열에 HA 고정을 활성화 EDC와 NHS의 최적 비율의 HA 솔루션과 반응. MCP와 carbodiimide 화학을 포함하는 것은 체외 애플 리케이션에 적합한 표면을 생성, 정의 지역 HA의 고정을 활성화. 두 결장암 세포와 유방암 세포는 암시 HA micropatterned 표면과 상호 작용. 암 세포 접착은 48 시간의 확산과 함께 24 시간 이내에 발생했습니다. HA micropatterned 표면을 사용하여, 우리는 그 암 세포 접착은 HA 수용체 CD44을 통해 발생 보여주었다. 또한, HA 패턴의 표면 전자 현미경 (SEM)과 암 세포 접착 라고나할까요 허용된 고해상도 이미징을 검사 및 외인성 HA에 대한 암 세포의 운동성을 분석 HA 패턴에 대한 확산과 호환되었습니다.

외인성 hyaluronic의 산성 (HA)과 암 세포의 상호 작용의 고해상도 분석이 가능합니다 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 패턴의 표면은 carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄 결합하여 가공하고 있습니다.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

암의 침습과 진행은 운동성 세포 표현형을 수반하며, 이는 성장 인자/사이토카인 및 세포외 기질에 의한 복잡한 조절을 받습니다...

암의 침습과 진행에는 세포 표현형의 변화가 수반되며, 이는 종양 미세환경 내의 성장 인자, 사이토카인 및 세포외 기질 구성 요소에 의해 복합적으로 조절됩니다. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 세포 표면 수용체인 CD44와의 상호작용을 통해 침습 성장과 혈관 신생을 촉진함으로써 종양 진행을 돕는 것으로 알려진 기질 세포외 기질 구성 요소 중 하나입니다. CD44는 종양 세포의 성장, 생존 및 이동을 촉진하는 신호 전달 사건을 유도하여 전이성 확산을 증가시킵니다. 본 연구에서는 외인성 HA 상에서 암세포의 접착, 이동 및 성장을 연구하고자 합니다.표준 포토리소그래피를 사용하여 마이크로 패턴 엘라스토머 스탬프를 제작하며, 이를 이용해 유리 기판 위에 아미노실란 분자의 패턴 배열을 생성합니다. 다음으로 카보디이미드 화학 반응을 수행하여 마이크로 패턴 아미노실란에 HA를 공유 결합으로 부착합니다. 이렇게 HA 마이크로 패턴을 생성한 후, 배양된 암세포를 HA 마이크로 패턴 위에 도말하면 외인성 히알루론산과 암세포의 상호작용을 광학 현미경, 주사 전자 현미경 또는 면역형광 현미경과 같은 고해상도 이미징 기술을 통해 시각화할 수 있습니다.본 비디오 논문에서 제시하는 마이크로 패턴 HA 표면 제작 방법은 암 진행 과정에서 외인성 히알루론산의 역할을 더욱 명확히 규명하는 것과 같이 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. HA를 유리 슬라이드에 임프린팅하는 데 사용할 마이크로 패턴 Polymethyl Zane 또는 PDMS 스탬프를 제작합니다. 우선 핀셋으로 새 실리콘 웨이퍼를 집어 드는 것으로 시작하십시오.그런 다음 실험실 싱크대 위로 옮깁니다. 세척병을 사용하여 웨이퍼를 에탄올로 헹구고 공기 흐름으로 건조시킵니다. 실내 조명을 끕니다.그런 다음 핀셋을 사용하여 웨이퍼를 스핀 코터로 옮기고, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 웨이퍼 표면의 최소 80%를 SU 2025 음성 감광액으로 덮습니다. 600 RPM에서 10초 동안 스핀 코팅한 후, 3000 RPM에서 30초 동안 추가로 코팅합니다. 감광액이 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트로 옮겨 95 °C에서 3분 동안 소프트 베이크합니다. 이후 핫플레이트에서 제거하여 1분 동안 식힙니다.원하는 패턴이 새겨진 프리패브리케이트 마스크를 포토레지스트가 도포된 웨이퍼 위에 놓은 다음, 20초 동안 UV 조사를 수행합니다. 이어서 웨이퍼를 핫플레이트로 옮겨 110 °C에서 6분 동안 하드 베이크를 진행합니다.조명을 켜고 핫플레이트에서 웨이퍼를 꺼냅니다. 이때 전이 피펫을 사용하여 뚜렷한 패턴이 보이는지 확인해야 합니다. 현상액으로 세 번 헹군 후, SU-8 포토레지스트 현상액으로 웨이퍼를 조심스럽게 헹구고, 이어서 에탄올로 헹굽니다.흰색 잔여물이 남아 있는 경우, 포토레지스트 현상액으로 헹구는 과정을 반복하거나 웨이퍼를 현상액에 2분 동안 담근 후 다시 에탄올로 헹구고, 물로 세척한 뒤 대형 웨이퍼 보트에서 공기 흐름으로 건조하십시오. PDMS 엘라스토머 용액과 경화제를 10:1 무게 비율로 혼합하며, 여기에 표시된 웨이퍼의 경우 22g이면 충분합니다. 혼합물을 원심분리 튜브에 붓고 900 RPM에서 5분 동안 회전시킵니다.기포를 제거하기 위해, 패턴이 형성된 웨이퍼를 적절한 크기의 페트리 접시에 넣습니다. 웨이퍼가 완전히 덮이도록 약 0.25인치 두께로 PDMS 용액을 충분히 붓습니다. 웨이퍼 표면에 기포가 있는 경우, 기포가 사라질 때까지 진공 데시케이터에 넣습니다.상온에서 하룻밤 동안 경화시켜 상보적인 엘라스토머 스탬프를 형성합니다. 12시간 후에도 PDMS가 완전히 경화되지 않은 경우, 웨이퍼를 60 °C 오븐에 30분 동안 넣습니다. 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 면도날을 사용하여 스탬프를 원하는 크기로 자릅니다. 에탄올이 담긴 유리 비커에 스탬프를 넣고, 가급적 플라스틱 홀더에 고정한 상태에서 15분 동안 초음파 처리합니다. 웨이퍼는 여러 번 사용하여 새로운 엘라스토머 스탬프를 제작함으로써 유리 표면의 지정된 패치에 ha를 공유 결합으로 고정하는 데 사용할 수 있습니다.동봉된 텍스트의 지침에 따라 플라즈마 세척기를 사용하여 사용할 모든 슬라이드를 세척하는 것으로 시작하십시오. 유리 슬라이드가 세척되면, 핀셋을 사용하여 플라즈마 세척기에서 슬라이드를 꺼내십시오. 슬라이드를 플라스틱 페트리 접시에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관하십시오.다음으로, HA를 결합시키기 위해 유리 슬라이드에 스탬핑할 아미노 실란 용액을 15 mL 폴리스티렌 원심분리 튜브에 준비합니다. 95% v/v 에탄올을 사용하여 3% v/v의 3-aminopropyltrimethoxysilane(APTMS) 용액을 총 부피 5 mL가 되도록 신선하게 제조한 후, 실온에서 5분 동안 반응시킵니다.이 기간 동안, A-P-T-M-S는 가수분해를 통해 시올(ciol)로 전환됩니다. 다음으로, 측면만 잡고 PDMS 스탬프의 패턴 면이 위로 향하게 하여 스핀 코터 척 위에 놓습니다. 전이 피펫을 사용하여 패턴 표면을 A-P-T-M-S로 덮어줍니다.그 다음, 스탬프 표면에 A-P-T-M-S를 도포하고 3,500 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 스핀 코팅기에서 PDMS 스탬프를 꺼낸 후, 패턴 면이 아래를 향하도록 뒤집어 PDMS 스탬프의 한쪽 끝을 유리 슬라이드 중앙에 맞추어 놓고, 전체 스탬프가 유리 슬라이드에 밀착되도록 1분 동안 가볍게 누릅니다. 이어서 PDMS 스탬프를 조심스럽게 제거하고, A-P-T-M-S 패턴이 형성된 유리 슬라이드를 실온 상태로 둡니다.30분 후, 패턴 표면을 에탄올로 헹구고 공기 흐름으로 건조합니다. 과잉의 A-P-T-M-S를 제거하기 위해 PDMS 스탬프를 15분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 슬라이드를 115 °C의 핫플레이트에 1시간 동안 놓아 표면을 가열하고 과잉 수분을 제거합니다.에탄올로 헹군 뒤 핀셋을 사용하여 공기 중에서 건조하십시오. 패턴 슬라이드를 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 전이 피펫을 사용하여 유리 슬라이드 전체를 갓 제조한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG cline 용액으로 완전히 덮으며, 이는 패턴 주변의 비접착 영역 역할을 합니다.75 °C에서 45분 동안 배양한 후, 과량의 PEG 식염수를 따라 버립니다. 그다음 핀셋으로 유리 슬라이드를 잡고, 패턴이 형성된 유리 슬라이드 표면을 톨루엔으로 헹군 다음 다시 물로 헹구고 공기 흐름으로 건조시킵니다. 슬라이드를 습윤 슬라이드 보관함에 넣습니다.그런 다음 박스를 생물안전작업대(biological safety cabinet)에 넣고 UV 램프를 1시간 동안 켜서 살균 조사를 수행합니다. 이때부터는 생물안전작업대 내에서 작업을 진행하십시오. 후드 외부에서 무균 상태를 유지하기 위해, 10 millimolar 농도의 1 milliliter 멸균 HA 수용액을 준비합니다.5 mM의 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)와 50 µg/mL의 hydroxyCIN aide를 사용합니다. 멸균된 fluorescein 표지 HA EDC는 HA의 카르복실기와 반응하여 아민 반응성 중간체를 형성하는 제로 렝스(zero-length) 가교제입니다. 이 중간체는 가수분해되기 쉬우므로, 카르보다이드 반응 효율을 높이기 위해 NHS를 첨가합니다.다음으로, 패턴 영역이 모두 덮일 때까지 멸균된 HA 용액 200 µL를 패턴 처리된 유리에 분주합니다. 그런 다음 슬라이드 박스를 닫아 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다. HA 용액이 마이크로 패턴 처리된 A-P-T-M-S와 상호작용하여 HA 중간체와 A-P-T-M-S의 일차 아민 사이에 안정적인 MI 결합이 형성될 수 있도록, 패턴 기판을 후드 내에 16~24시간 동안 그대로 둡니다.다음 날 APA 분리 피펫을 사용하여 HA 용액을 흡입하여 제거합니다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, PBS에 포함된 1% BSA로 표면을 1시간 동안 덮어줍니다. 이제 표면을 세포 배양에 사용할 수 있습니다.HA 마이크로패턴 표면에서 배양하기 위해 HA 마이크로패턴 표면을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 유리 표면 18.75 cm²당 0.4~1 × 10⁶개의 암세포 밀도로, 1 mL의 세포 배양액에 암세포 단일 세포 현탁액을 분주하여 유리 슬라이드 표면을 덮습니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 가습 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 배지가 넘치지 않도록 주의하며, 세포 부착은 24시간 이내에 일어나며 도립 광학 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다.세포 배양 표면은 최대 5일까지 유지할 수 있습니다. 표준 배양기 조건에서는 이틀마다 배지를 교체하십시오. 세포의 형태와 성장은 도립 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.그런 다음, 여기에 제시된 예시와 같이 HA 표면에 대한 반응을 분석하기 위해 추가적인 세포 분석을 적용할 수 있습니다. 형광 현미경과 이미지를 사용하여 시각화한 HA 패턴 표면입니다. J 형광 강도 분석은 HA의 패턴 탈이동화를 입증합니다.HA 마이크로 패턴 표면을 통해 외인성 HA와 암세포 간의 상호작용을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 HA 마이크로 패턴 표면에서의 암세포 부착 양상을 보여줍니다. 대장암 및 유방암 세포 모두 24시간 배양 후 HA 패치에 우선적으로 부착되었습니다. 주사 전자 현미경을 이용한 고해상도 이미징을 통해 배양된 세포와 HA 고정 표면 간의 상호작용을 분석할 수 있습니다.이 주사 전자 현미경 사진에서 대장암 세포와 HA의 상호작용을 확인할 수 있으며, 오른쪽에는 더 높은 배율의 이미지가 제시되어 있습니다. HA 표면에서 배양된 유방암 세포의 모습이 여기에 나타나 있으며, 마찬가지로 오른쪽에는 더 높은 배율의 이미지가 제시되어 있습니다. 이 분석은 HA 마이크로 패턴 상에서 암세포의 퍼짐을 촉진하는 접착 돌기가 존재함을 명확히 보여줍니다.이 영상을 시청하고 나면, HA 마이크로 패턴 서비스를 준비하는 방법과 이를 암세포 반응 연구에 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

보체 성분 C1q는 세포외 기질과 상호 작용할 수 있는 조직 미세환경에서 고도로 발현되는 염증성 분자이다. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산에 결합하여 세포 부착에 미치는 영향을 시험하는 방법을 설명한다.

세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 C1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

배우세요 미세패턴 표면을 이용한 암세포와 히알루론산 상호작용 분석 방법을. 카보디이미드 화학 및 마이크로콘택트 프린팅 기술로 암세포 부착, 이동, 성장을 시각화하여 종양 미세환경 역학을 연구합니다.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

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