Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

암의 침습과 진행에는 세포 표현형의 변화가 수반되며, 이는 종양 미세환경 내의 성장 인자, 사이토카인 및 세포외 기질 구성 요소에 의해 복합적으로 조절됩니다. 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 세포 표면 수용체인 CD44와의 상호작용을 통해 침습 성장과 혈관 신생을 촉진함으로써 종양 진행을 돕는 것으로 알려진 기질 세포외 기질 구성 요소 중 하나입니다. CD44는 종양 세포의 성장, 생존 및 이동을 촉진하는 신호 전달 사건을 유도하여 전이성 확산을 증가시킵니다. 본 연구에서는 외인성 HA 상에서 암세포의 접착, 이동 및 성장을 연구하고자 합니다.

표준 포토리소그래피를 사용하여 마이크로 패턴 엘라스토머 스탬프를 제작하며, 이를 이용해 유리 기판 위에 아미노실란 분자의 패턴 배열을 생성합니다. 다음으로 카보디이미드 화학 반응을 수행하여 마이크로 패턴 아미노실란에 HA를 공유 결합으로 부착합니다. 이렇게 HA 마이크로 패턴을 생성한 후, 배양된 암세포를 HA 마이크로 패턴 위에 도말하면 외인성 히알루론산과 암세포의 상호작용을 광학 현미경, 주사 전자 현미경 또는 면역형광 현미경과 같은 고해상도 이미징 기술을 통해 시각화할 수 있습니다.

본 비디오 논문에서 제시하는 마이크로 패턴 HA 표면 제작 방법은 암 진행 과정에서 외인성 히알루론산의 역할을 더욱 명확히 규명하는 것과 같이 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. HA를 유리 슬라이드에 임프린팅하는 데 사용할 마이크로 패턴 Polymethyl Zane 또는 PDMS 스탬프를 제작합니다. 우선 핀셋으로 새 실리콘 웨이퍼를 집어 드는 것으로 시작하십시오.

그런 다음 실험실 싱크대 위로 옮깁니다. 세척병을 사용하여 웨이퍼를 에탄올로 헹구고 공기 흐름으로 건조시킵니다. 실내 조명을 끕니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 웨이퍼를 스핀 코터로 옮기고, 트랜스퍼 피펫을 사용하여 웨이퍼 표면의 최소 80%를 SU 2025 음성 감광액으로 덮습니다. 600 RPM에서 10초 동안 스핀 코팅한 후, 3000 RPM에서 30초 동안 추가로 코팅합니다. 감광액이 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트로 옮겨 95 °C에서 3분 동안 소프트 베이크합니다. 이후 핫플레이트에서 제거하여 1분 동안 식힙니다.

원하는 패턴이 새겨진 프리패브리케이트 마스크를 포토레지스트가 도포된 웨이퍼 위에 놓은 다음, 20초 동안 UV 조사를 수행합니다. 이어서 웨이퍼를 핫플레이트로 옮겨 110 °C에서 6분 동안 하드 베이크를 진행합니다.

조명을 켜고 핫플레이트에서 웨이퍼를 꺼냅니다. 이때 전이 피펫을 사용하여 뚜렷한 패턴이 보이는지 확인해야 합니다. 현상액으로 세 번 헹군 후, SU-8 포토레지스트 현상액으로 웨이퍼를 조심스럽게 헹구고, 이어서 에탄올로 헹굽니다.

흰색 잔여물이 남아 있는 경우, 포토레지스트 현상액으로 헹구는 과정을 반복하거나 웨이퍼를 현상액에 2분 동안 담근 후 다시 에탄올로 헹구고, 물로 세척한 뒤 대형 웨이퍼 보트에서 공기 흐름으로 건조하십시오. PDMS 엘라스토머 용액과 경화제를 10:1 무게 비율로 혼합하며, 여기에 표시된 웨이퍼의 경우 22g이면 충분합니다. 혼합물을 원심분리 튜브에 붓고 900 RPM에서 5분 동안 회전시킵니다.

기포를 제거하기 위해, 패턴이 형성된 웨이퍼를 적절한 크기의 페트리 접시에 넣습니다. 웨이퍼가 완전히 덮이도록 약 0.25인치 두께로 PDMS 용액을 충분히 붓습니다. 웨이퍼 표면에 기포가 있는 경우, 기포가 사라질 때까지 진공 데시케이터에 넣습니다.

상온에서 하룻밤 동안 경화시켜 상보적인 엘라스토머 스탬프를 형성합니다. 12시간 후에도 PDMS가 완전히 경화되지 않은 경우, 웨이퍼를 60 °C 오븐에 30분 동안 넣습니다. 웨이퍼에서 PDMS를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 스탬프를 원하는 크기로 자릅니다. 에탄올이 담긴 유리 비커에 스탬프를 넣고, 가급적 플라스틱 홀더에 고정한 상태에서 15분 동안 초음파 처리합니다. 웨이퍼는 여러 번 사용하여 새로운 엘라스토머 스탬프를 제작함으로써 유리 표면의 지정된 패치에 ha를 공유 결합으로 고정하는 데 사용할 수 있습니다.

동봉된 텍스트의 지침에 따라 플라즈마 세척기를 사용하여 사용할 모든 슬라이드를 세척하는 것으로 시작하십시오. 유리 슬라이드가 세척되면, 핀셋을 사용하여 플라즈마 세척기에서 슬라이드를 꺼내십시오. 슬라이드를 플라스틱 페트리 접시에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관하십시오.

다음으로, HA를 결합시키기 위해 유리 슬라이드에 스탬핑할 아미노 실란 용액을 15 mL 폴리스티렌 원심분리 튜브에 준비합니다. 95% v/v 에탄올을 사용하여 3% v/v의 3-aminopropyltrimethoxysilane(APTMS) 용액을 총 부피 5 mL가 되도록 신선하게 제조한 후, 실온에서 5분 동안 반응시킵니다.

이 기간 동안, A-P-T-M-S는 가수분해를 통해 시올(ciol)로 전환됩니다. 다음으로, 측면만 잡고 PDMS 스탬프의 패턴 면이 위로 향하게 하여 스핀 코터 척 위에 놓습니다. 전이 피펫을 사용하여 패턴 표면을 A-P-T-M-S로 덮어줍니다.

그 다음, 스탬프 표면에 A-P-T-M-S를 도포하고 3,500 RPM에서 30초 동안 스핀 코팅합니다. 스핀 코팅기에서 PDMS 스탬프를 꺼낸 후, 패턴 면이 아래를 향하도록 뒤집어 PDMS 스탬프의 한쪽 끝을 유리 슬라이드 중앙에 맞추어 놓고, 전체 스탬프가 유리 슬라이드에 밀착되도록 1분 동안 가볍게 누릅니다. 이어서 PDMS 스탬프를 조심스럽게 제거하고, A-P-T-M-S 패턴이 형성된 유리 슬라이드를 실온 상태로 둡니다.

30분 후, 패턴 표면을 에탄올로 헹구고 공기 흐름으로 건조합니다. 과잉의 A-P-T-M-S를 제거하기 위해 PDMS 스탬프를 15분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 슬라이드를 115 °C의 핫플레이트에 1시간 동안 놓아 표면을 가열하고 과잉 수분을 제거합니다.

에탄올로 헹군 뒤 핀셋을 사용하여 공기 중에서 건조하십시오. 패턴 슬라이드를 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 전이 피펫을 사용하여 유리 슬라이드 전체를 갓 제조한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG cline 용액으로 완전히 덮으며, 이는 패턴 주변의 비접착 영역 역할을 합니다.

75 °C에서 45분 동안 배양한 후, 과량의 PEG 식염수를 따라 버립니다. 그다음 핀셋으로 유리 슬라이드를 잡고, 패턴이 형성된 유리 슬라이드 표면을 톨루엔으로 헹군 다음 다시 물로 헹구고 공기 흐름으로 건조시킵니다. 슬라이드를 습윤 슬라이드 보관함에 넣습니다.

그런 다음 박스를 생물안전작업대(biological safety cabinet)에 넣고 UV 램프를 1시간 동안 켜서 살균 조사를 수행합니다. 이때부터는 생물안전작업대 내에서 작업을 진행하십시오. 후드 외부에서 무균 상태를 유지하기 위해, 10 millimolar 농도의 1 milliliter 멸균 HA 수용액을 준비합니다.

5 mM의 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)와 50 µg/mL의 hydroxyCIN aide를 사용합니다. 멸균된 fluorescein 표지 HA EDC는 HA의 카르복실기와 반응하여 아민 반응성 중간체를 형성하는 제로 렝스(zero-length) 가교제입니다. 이 중간체는 가수분해되기 쉬우므로, 카르보다이드 반응 효율을 높이기 위해 NHS를 첨가합니다.

다음으로, 패턴 영역이 모두 덮일 때까지 멸균된 HA 용액 200 µL를 패턴 처리된 유리에 분주합니다. 그런 다음 슬라이드 박스를 닫아 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다. HA 용액이 마이크로 패턴 처리된 A-P-T-M-S와 상호작용하여 HA 중간체와 A-P-T-M-S의 일차 아민 사이에 안정적인 MI 결합이 형성될 수 있도록, 패턴 기판을 후드 내에 16~24시간 동안 그대로 둡니다.

다음 날 APA 분리 피펫을 사용하여 HA 용액을 흡입하여 제거합니다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, PBS에 포함된 1% BSA로 표면을 1시간 동안 덮어줍니다. 이제 표면을 세포 배양에 사용할 수 있습니다.

HA 마이크로패턴 표면에서 배양하기 위해 HA 마이크로패턴 표면을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 유리 표면 18.75 cm²당 0.4~1 × 10⁶개의 암세포 밀도로, 1 mL의 세포 배양액에 암세포 단일 세포 현탁액을 분주하여 유리 슬라이드 표면을 덮습니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 가습 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 배지가 넘치지 않도록 주의하며, 세포 부착은 24시간 이내에 일어나며 도립 광학 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다.

세포 배양 표면은 최대 5일까지 유지할 수 있습니다. 표준 배양기 조건에서는 이틀마다 배지를 교체하십시오. 세포의 형태와 성장은 도립 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.

그런 다음, 여기에 제시된 예시와 같이 HA 표면에 대한 반응을 분석하기 위해 추가적인 세포 분석을 적용할 수 있습니다. 형광 현미경과 이미지를 사용하여 시각화한 HA 패턴 표면입니다. J 형광 강도 분석은 HA의 패턴 탈이동화를 입증합니다.

HA 마이크로 패턴 표면을 통해 외인성 HA와 암세포 간의 상호작용을 연구할 수 있습니다. 여기에서는 HA 마이크로 패턴 표면에서의 암세포 부착 양상을 보여줍니다. 대장암 및 유방암 세포 모두 24시간 배양 후 HA 패치에 우선적으로 부착되었습니다. 주사 전자 현미경을 이용한 고해상도 이미징을 통해 배양된 세포와 HA 고정 표면 간의 상호작용을 분석할 수 있습니다.

이 주사 전자 현미경 사진에서 대장암 세포와 HA의 상호작용을 확인할 수 있으며, 오른쪽에는 더 높은 배율의 이미지가 제시되어 있습니다. HA 표면에서 배양된 유방암 세포의 모습이 여기에 나타나 있으며, 마찬가지로 오른쪽에는 더 높은 배율의 이미지가 제시되어 있습니다. 이 분석은 HA 마이크로 패턴 상에서 암세포의 퍼짐을 촉진하는 접착 돌기가 존재함을 명확히 보여줍니다.

이 영상을 시청하고 나면, HA 마이크로 패턴 서비스를 준비하는 방법과 이를 암세포 반응 연구에 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.