순환 Uniaxial 스트레인을 사용하여 줄기 세포의 기계적 자극

안녕하세요, 저는 Song Li입니다. UC Berkeley 생명공학과(Department of Bio Engineering)의 부교수입니다. 그리고 저는 Kyle Kapinsky이며, 마찬가지로 UC Berkeley 생명공학과의 박사 과정 후보생입니다.

오늘은 주기적 단축 변형(cyclic UNI axial strain)을 이용한 줄기세포의 기계적 자극 프로토콜을 소개하겠습니다. 저희 연구실의 연구는 세포 및 조직 공학, 특히 심혈관계에 집중하고 있습니다. 줄기세포의 기계 생물학적 특성에는 몇 가지 잠재적인 응용 분야가 있기 때문에 저희는 이에 관심을 두고 있습니다.

첫째로, 배아 발달과 같은 발달 과정에 기계적 요인이 미치는 영향을 이해하고자 합니다. 둘째로, in vitro 또는 장 내 반응에서 줄기세포 분화를 제어하는 것에 관심이 있습니다. 셋째로, 예를 들어 이식 후와 같이 in vivo에서 줄기세포가 심혈관 기계적 요인에 어떻게 반응하는지에 대해 연구하고자 합니다.

이 모든 사항을 조사하기 위해, 저희는 탄성 막 위에 세포를 파종한 후 정해진 시간, 변형률 및 변형률 속도에 따라 이 막을 축 방향으로 신장시킬 수 있도록 맞춤 설계된 바이오리액터를 사용합니다. 이제 이 프로토콜을 설정하는 데 필요한 모든 과정을 단계별로 안내해 드리겠습니다. 실험실용 세제나 일반 세제를 사용하여 막의 양면에 비누를 묻히고 충분히 문질러 닦아내십시오. 이는 막 위에 남아 있을 수 있는 파편이나 세포 성장에 방해가 될 수 있는 모든 이물질을 제거하기 위함입니다.

그리고 이것을 수작업으로 진행합니다. 양쪽 모두 충분히 세척되었다고 판단되면, 다시 한번 물로 헹굽니다. 그 후, 완전히 멸균되었는지 확인하고 미세 입자들을 모두 제거하고자 합니다.

이제 이 멤브레인을 70% alcohol이 담긴 비커에 넣겠습니다. 멤브레인이 완전히 잠기도록 넣어줍니다. 그다음 비커 전체를 초음파 세척기에 넣고 10분 동안 초음파 처리합니다.

이제 마이크로패턴 멤브레인을 사각 디쉬에 담았으므로, 패턴 면이 실제로 위를 향하고 있는지 확인하고자 합니다. 알코올이 담긴 분무기로 이 멤브레인의 윗면을 분사하겠습니다. 그러면 액체가 흘러내리면서 홈들이 보일 것입니다.

따라서 패턴 면이 위를 향하고 있으며 올바른 방향으로 놓였음을 확인할 수 있습니다. 이제 밤새 진행하는 UV 단계를 마쳤으며, 챔버와 챔버용 프레임, 그리고 멤브레인 자체가 모두 후드 안에 있으며 밤새 UV 조사를 받은 상태입니다. 이것이 우리의 최종 멸균 단계입니다.

이제 모든 멤브레인을 플라즈마 처리하려고 합니다. 한 번에 하나 또는 두 개의 멤브레인을 꺼내 멸균 접시에 담아 플라즈마 장비로 옮기겠습니다. 이제 진공 압력이 해제되었으므로 챔버를 제거할 수 있습니다. 다시 말씀드리지만, 이 과정이 완전히 멸균 상태는 아니며, 나중에 다시 처리할 예정입니다.

플라스마가 유지될 수 있도록 비교적 빠르게 작업해야 하며, 이때 포셉을 사용하십시오. 다시 한번 강조하지만, 이 과정은 매우 중요합니다. 멤브레인을 떨어뜨리거나 방향이 바뀌지 않도록 주의하십시오.

현재 상단 표면만 플라즈마 처리되었으므로, 플라즈마 처리된 면이 위로 향하게 하여 상대적으로 멸균된 접시에 다시 넣고, 뚜껑을 닫은 후 후드로 운반하겠습니다. 이제 멤브레인의 플라즈마 처리가 완료되었으므로, 다시 후드로 가져와 2% gelatin(w/v)으로 처리하겠습니다.

용액이 패턴을 따라 계속 흘러나오는 것을 볼 수 있습니다. 또한 플라즈마 처리가 되었기 때문에 매우 친수성입니다. 따라서 용액이 뭉치지 않고 넓게 퍼지게 되며, 만약 실수로 멤브레인을 뒤집었다면 용액이 뭉치게 되어 잘못된 면을 사용하고 있다는 것을 알 수 있을 것입니다.

용액이 고르게 퍼지도록 하십시오. 모든 멤브레인에 이 과정을 수행한 후, 후드를 닫고 UV 램프를 30분 동안 켭니다. 이 시점에서 멤브레인은 표면에 젤라틴이 도포된 상태로 30분 동안 UV 처리가 되었으며, 이는 젤라틴이 표면에 흡수되기에 충분한 시간입니다.

이제 멸균 PBS로 멤브레인을 두 번 세척하겠습니다. 보통 사각 디쉬에 약 10 mL의 PBS를 붓고 손으로 가볍게 흔들어 세척하며, 이때 멤브레인 표면을 직접 만지지 않도록 주의한 다음 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이 과정을 한 번 더 반복하겠습니다. 두 번째 세척 후에는 멤브레인을 PBS에 담가두는데, 이는 멤브레인에 윤활 작용을 하여 챔버에 조립하기 쉽게 만들기 위해서입니다. 멤브레인을 건조한 상태로 두면 찢어지거나 손상될 가능성이 더 커집니다.

두 번째 세척 단계입니다. 다시 한번 흡입하여 멤브레인에서 모든 젤라틴이 제거되었는지 확인합니다. 그 후 멤브레인을 약 10 milliliters의 멸균 PBS에 담가 둡니다.

두 개 이상의 멤브레인을 사용하는 경우에는 각 멤브레인에 대해 이 과정을 반복하십시오. 그 후 조립 준비가 완료됩니다. 프레임 중 하나를 집으십시오. 이는 실제로는 두 개의 조각으로 구성되어 있으나, 보통 미리 조립되어 있습니다.

한 부분은 여기 있는 T자형 피스이며, 다른 부분은 멤브레인 자체를 고정할 프레임의 일부입니다. 따라서 프레임의 두 번째 피스는 이와 같은 모양을 하고 있습니다. 그리고 여기에는 홈이 파여 있는 것을 확인하실 수 있습니다.

그곳이 가스켓을 삽입하여 멤브레인을 고정하는 위치입니다. 두 번째 조각에는 또 다른 가스켓을 위한 두 번째 홈이 있어 멤브레인의 양쪽을 모두 고정할 수 있습니다. 따라서 이 조각을 집어 프레임 위에 이렇게 놓은 다음, 프레임을 뒤집고 오토클레이브 나사 하나를 집으십시오.

상단에 나사를 삽입하십시오. 먼저 손으로 약간 조인 후, 육각 렌치를 사용하여 완전히 조여 줍니다. 이제 프레임 조립이 완료되었으며, 제 손이 멤브레인이라고 가정했을 때 멤브레인은 이 방향으로 하단에 부착됩니다. 즉, 패턴이 형성되었거나 플라스마 처리 및 젤라틴 처리가 된 면이 아래로 향하게 해야 함을 의미합니다.

그 부분이 위를 향하게 하고 싶습니다. 만약 실수로 뒤집어서 젤라틴 면이 아래로 가게 되면 실험에 큰 문제가 생길 것입니다. 따라서 조립할 때 패턴 면이 이쪽 위를 향하게 하되, 실제 조립은 거꾸로 진행하겠습니다.

따라서 멤브레인을 꺼낼 때, 패턴 면이 아래로 향하게 해야 합니다. 멤브레인 하나를 꺼내는데, 현재는 패턴 면이 위를 향하고 있음에 유의하십시오. 이를 PBS에서 꺼내어 다음과 같이 프레임 위에 놓습니다.

현재 양쪽 모두 거의 동일한 상태입니다. 손가락으로 멤브레인의 가장자리를 만지는 것은 괜찮지만, 반대쪽 면은 닿지 않도록 주의하십시오. 이제 이 방향으로 뒤집었으므로, 조립을 더 쉽게 하기 위해 패턴 면이 아래를 향하게 했습니다. 가스켓 두 개를 집어 PBS에 넣으십시오.

저는 보통 이를 앞뒤로 굴려줍니다. 이렇게 가스켓 전체를 적시면, PBS로 멤브레인을 윤활시킨 것과 마찬가지로 가스켓이 윤활됩니다. 건조한 멤브레인에 건조한 가스켓을 사용하면, 무언가가 말려 들어갈 가능성이 훨씬 높아집니다.

시작 방법은 한쪽을 다른 쪽보다 약간 더 길게 당기는 것입니다. 가스켓을 삽입할 때, 이 쪽에 가스켓을 넣으면 멤브레인이 이 방향으로 당겨져 반대쪽이 약간 짧아지기 때문입니다. 따라서 이곳을 약간 짧게 잡고 시작하십시오. 가스켓 하나를 가져와 양쪽이 거의 균등하도록 가로로 놓습니다.

균일한 압력을 가하며 아래로 누르십시오. 엄지손가락이나 엄지 끝부분을 사용하되, 이 시점에서는 손톱을 사용하지 마십시오. 손톱으로 인해 막을 실수로 찌르거나 찢을 가능성이 높기 때문입니다. 저는 삽입 후 포셉의 뒷면을 사용하여 아래로 누릅니다. 이때 너무 세게 누르거나 미끄러져 막에 닿지 않도록 주의하십시오. 이 단계에서 막을 실수로 자르거나 찢게 되면 새 막을 사용하여 처음부터 다시 시작해야 합니다.

이제 한쪽은 삽입되었지만, 반대쪽은 여전히 헐거운 상태입니다. 따라서 방향을 돌려 다른 가스켓을 집어 젖은 상태인지 확인한 후 이전과 동일하게 위에 배치합니다. 그런 다음 저는 보통 포셉을 사용하여 막을 잡고 약간 늘려주는데, 막이 너무 헐거우면 느슨한 부분이 많이 생겨 세포를 관찰하는 것이 불가능하기 때문입니다.

따라서 너무 팽팽하여 늘어나지 않으면서도 적당히 팽팽한 상태여야 합니다. 미리 늘어나 있으면 막 자체가 이미 긴장된 상태이므로 실험에 영향을 줄 수 있으며, 가스켓을 눌러 내릴 때 약간의 장력이 더해지면서 막이 찢어질 수 있습니다. 현재 상태로는 충분히 팽팽해 보입니다.

한쪽 면이 약간 느슨할 수 있지만, 잠시 후에 수정하겠습니다. 다시 한번, 고른 압력을 가하여 엄지손가락 끝이나 손끝으로 꾹 눌러주십시오. 이제 한쪽 면이 상당히 팽팽해진 것을 확인하실 수 있습니다.

반대편 끝까지 일직선으로 되어 있습니다. 막에 약간의 느슨함이 있어 그 부분이 약간 말려 올라갑니다. 따라서 이전과 마찬가지로 가스켓 전체를 따라 천천히 그리고 균일하게 이쪽 면을 끝까지 눌러주겠습니다.

그러면 느슨한 부분이 대부분 제거된 것을 볼 수 있습니다. 이제 프레임과 멤브레인의 뒷면에 대해 30분간 UV 조사를 마쳤으므로, 모든 멤브레인을 뒤집어 앞면에도 UV 조사를 하여 모든 부분이 완전히 멸균되도록 하겠습니다. 그리고 이 시점에서 특정 챔버를 신장(stretch) 군 또는 대조군(control)으로 지정하겠습니다.

보시는 바와 같이, 저는 이미 챔버를 대조군 신장(control stretch), 대조군 신장(control stretch)으로 라벨링 해두었습니다. 신장 챔버에는 나사 하나가 더 필요합니다. 따라서 신장 챔버용 추가 나사를 여기 덮개 안쪽 윗부분에 놓아두었습니다.

프레임을 들어 올려 뒤집으십시오. 만약 신장 챔버(stretch chamber)라면 나사 몇 개를 교체해야 합니다. 대조군 챔버(control chamber)인 경우에는 모든 설정을 그대로 유지하면 됩니다.

그리고 이 바가 앞뒤로 움직일 때, 막 자체가 늘어나는 것이 아니라 바와 함께 움직이기만 합니다. 막을 신장시키려면, 프레임의 두 번째 부분을 챔버 바닥에 고정하여 움직이지 않게 해야 합니다. 그렇게 하면 프레임의 이 부분만 앞뒤로 움직이게 됩니다.

이를 위해 추가 나사를 가져와 프레임 부품의 나사 구멍에 끼웁니다. 육각 렌치를 사용하여 나사를 조입니다. 폴리스티렌 챔버는 다소 약하므로 너무 세게 조이지 마십시오. 챔버에 균열이 생기지 않도록 주의하며, 프레임 부품이 움직이지 않을 정도로만 적당히 조여 줍니다.

첫 번째 나사를 고정한 후, 프레임의 두 조각을 연결하고 있던 이 나사를 풉니다. 이때 나사가 멤브레인 위로 떨어지지 않도록 주의하십시오. 나사가 떨어지면 멤브레인 위에 접종한 젤라틴의 일부가 손상될 수 있기 때문입니다. 나사를 충분히 푼 다음, 육각 렌치를 내려놓고 포셉으로 나사를 잡아 두 번째 나사 구멍에 넣습니다. 그런 다음 다시 육각 렌치를 사용하여 두 번째 나사를 조입니다.

프레임 조각을 두 개의 나사로 고정하고 나면, 이제 신장 실험을 위한 챔버 설정이 완료됩니다. 신장 장치를 통해 이 바가 앞뒤로 움직이면, 막 자체가 실제로 신장되는 것을 볼 수 있습니다. 저는 막에 아무런 문제가 없는지 확인하기 위해 이 과정을 실제로 몇 번 반복하는 것을 선호합니다.

만약 어떤 이유로 균열이 생겨 막이 찢어졌다면, 실험을 시작하기 전에 이를 확인하고 다른 막으로 교체할 수 있습니다. 따라서 이것을 옆으로 치우고 다음 것을 준비하는데, 이 경우에는 대조군 챔버(control chamber)로 표시되어 있습니다. 대조군 챔버의 경우 그냥 뒤집어 주기만 하면 됩니다.

이제 기기에 넣으면 신축 없이 앞뒤로 움직이게 됩니다. 그다음 준비된 챔버와 막의 개수에 맞춰 이 과정을 반복하십시오. 각각의 스트레처 컨트롤을 확인한 후, 후드를 닫고 막의 상단 면을 30분 동안 UV 조사하십시오.

모든 챔버와 프레임 상단 및 멤브레인을 30분 동안 UV 처리하였습니다. 이제 모든 구성 요소가 멸균되었고 조립이 완료되어 세포를 파종할 준비가 되었습니다. 이번 실험에서는 10 cm 디쉬에서 배양한 중간엽 줄기세포를 파종하겠습니다.

따라서 각 막의 경우, 특히 이번 사례와 같이 패턴 막을 사용하는 경우에는 패턴이 있는 사각형 영역에 세포를 접종할 수 있습니다. 저는 패턴이 있는 해당 영역에만 접종하고자 합니다. 패턴이 없는 막을 사용하는 경우에도 액체가 가장자리에 너무 가깝게 닿지 않도록 대략 동일한 영역에 접종해야 합니다.

액체가 가장자리에 너무 가까우면 밖으로 넘쳐흐를 수 있으며, 이 경우 세포가 제대로 안착되기 전에 사멸할 수 있습니다. 세포를 안착시키는 해당 영역에는 적절한 양의 세포를 배치해야 합니다. 따라서 저는 실험 시 해당 영역이 상당히 밀집된(confluent) 상태가 되도록 합니다.

따라서 10 cm 디쉬를 사용하는 경우, 해당 영역에 약 3분의 1 정도의 합류도(confluent)를 갖도록 합니다. 중간엽 줄기세포의 경우, 이는 약 250,000개의 세포에 해당합니다. 사용하시는 세포 유형에 따라 이 수치는 달라질 수 있습니다.

세포를 플레이트에서 분리하여 적절한 부피로 재현탁하였습니다. 이제 각 멤브레인에 1 mL의 세포 용액을 분주하겠습니다. 이 경우, 용액 1 mL당 약 250,000개의 중간엽 줄기세포가 포함되어 있습니다.

따라서 저는 P 1000을 사용하며, 용액 상태를 확인합니다. 피펫으로 몇 번 상하로 섞어준 뒤 1 mL를 취하고, 정확히 해당 영역에만 분주되도록 합니다. 따라서 매우 천천히, 패턴 영역 위에 작은 방울 형태로 분주합니다.

그리고 이것이 일정한 패턴이기 때문에, 실제로 홈을 감지하여 이 방향으로 작은 타원형을 만드는 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 완전한 원형이 아니며, 이 경우에는 더 타원형에 가깝습니다.

그런 다음 이 영역 전체를 살피되, 아직은 가장자리에 너무 가까이 가지 않습니다. 너무 멀리 가서 피펫의 용액을 모두 소진하는 것을 방지하기 위해서입니다. 그 후 피펫을 사용하여 용액을 가장자리 근처까지 실제로 넓게 펴 바르며, 경계선을 넘지 않도록 주의합니다.

통과하지 않은 영역에 세포가 남지 않도록 해야 하며, 사용자에게 가장 가까운 가장자리 부분을 처리하는 것이 다소 어렵습니다. 따라서 보통은 이를 조심스럽게 회전시키며 마지막 가장자리까지 처리합니다. 이렇게 하면 세포가 상당히 고르게 퍼질 것입니다.

이제 모든 세포가 안착되었습니다. 하지만 세포가 밖으로 쏟아지지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 손을 위로 지나가게 하거나 너무 빠르게 움직이지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 그것을 다시 원래 위치로 옮깁니다. 그리고 이 부분을 덮고 세포가 위에 안착하도록 하려 합니다. 이를 덮기 위해 이 뚜껑을 사용하며, 뚜껑에는 실제로 두 개의 서로 다른 구멍이 있습니다.

이쪽에는 더 깊은 구멍이 있고, 반대쪽에는 가스가 들어올 수 있도록 더 얕은 구멍이 있습니다. 더 깊은 구멍이 여기 T자형 부품과 일직선으로 맞도록 확인해야 합니다. 그렇지 않고 얕은 구멍을 사용하면 너무 빡빡해질 것입니다.

이런 방식으로 배치하여 챔버 전체를 덮어줍니다. 그 다음 나머지 모든 챔버에 대해 동일한 과정을 반복하고, 세포가 바닥으로 가라앉아 막에 부착되기 시작할 수 있도록 후드 내에서 30분 동안 그대로 둡니다. 그 후, 모든 챔버를 테이프로 밀봉하여 후드나 배양기로 옮겨, 세포가 막에 완전히 부착될 때까지 1시간 더 둡니다.

이제 세포를 멤브레인 위에 30분 동안 두는 과정을 마쳤습니다. 이제 세포를 인큐베이터 내부의 37°C, 5% CO2 조건에 노출시키고자 합니다. 따라서 후드에서 인큐베이터로 옮겨야 합니다.

이를 위해 챔버를 어느 방향으로도 기울이지 않도록 매우 세심하게 주의해야 하며, 그렇지 않으면 세포 용액이 흘러내릴 수 있습니다. 그렇게 되면 기본적으로 모든 과정을 처음부터 다시 시작해야 합니다. 이제 세포를 챔버에 넣고 인큐베이터에서 1시간 동안 배양했으므로, 세포가 표면에 단단히 부착되었습니다.

이제 챔버를 인큐베이터에서 다시 꺼내어, 이전과 마찬가지로 매우 주의 깊게 운반하여 후드 안으로 다시 넣었습니다. 이 과정에서 멤브레인 위의 배지가 쏟아지지 않도록 주의해야 합니다. 이제 스트레치 챔버에 배지 20 mL를 첨가해야 합니다.

이 경우에는 오염에 다소 취약하기 때문에 오염을 완벽하게 방지하도록 설계된 특수 조합의 배지를 사용합니다. DM에 10% FBS, 1% penicillin, streptomycin을 첨가하고, 진균 오염을 방지하기 위해 1%의 fungi zone을 추가로 사용합니다. 배지 20 mL를 취해 스트레치 챔버에 조심스럽게 첨가하겠습니다.

배지가 멤브레인 자체에서 떨어지지 않고 챔버 끝부분에 추가되었음을 알 수 있으며, 이를 통해 배지가 먼저 멤브레인 아래로 들어간 다음 멤브레인 위로 올라가게 됩니다. 이때 세포가 완전히 교란되지 않도록 천천히 진행하십시오. 그런 다음 다시 덮개를 덮고 덮개를 단단히 고정합니다.

이 시점부터는 세포가 교란되거나 막에서 떨어져 나가는 것을 더 이상 걱정하지 않아도 됩니다. 따라서 조금 덜 주의 깊게 취급하셔도 좋습니다. 적절한 양의 균주를 선택해야 합니다.

이 장치의 작동 방식은 암(arm)이 부착된 회전 휠이 있으며, 휠 중심에 장착하는 기성 부품 인서트에 따라 이 암의 길이가 변경되는 방식입니다. 따라서 휠이 회전하면 암이 앞뒤로 움직이며, 이에 따라 플랫폼이 앞뒤로 이동하게 됩니다. 그리고 챔버들이 여기에 부착되어 있습니다.

따라서 이들 또한 마찬가지로 앞뒤로 움직이게 됩니다. 예를 들어 5% 변형률을 가하고자 할 때는 '5'라고 표시된 기제작 부품을 사용하는데, 이 부품은 암(arm)이 정확한 위치로 이동하도록 특정 길이로 미리 계산되어 있습니다. 이 부품을 휠 중앙에 삽입한 다음 암을 부착하고, 암이 단단히 고정되었는지 확인한 후 육각 렌치를 사용하여 최종적으로 조여 고정합니다.

모든 설정이 완료되어 제로 위치에 놓였고, 모든 것이 고정되었습니다. 이제 챔버를 넣을 준비가 되었습니다. 방금 옮겨온 챔버들이 이것입니다.

세포가 상단에 위치한 상태에서 조심스럽게 한 위치에 넣고 바가 제자리에 고정되었는지 확인하십시오. 바가 영점 위치에 고정되도록 이 방향으로 밀어 넣어야 합니다. 너무 끝까지 밀어 넣지 마십시오. 그렇지 않으면 멤브레인이 미리 스트레칭될 수 있습니다.

그런 다음, 움직이지 않도록 여기 있는 고정 장치로 고정합니다. 그리고 스위치를 켜서 작동시킵니다. 처음에 약간의 튀어오름이 있었음을 확인할 수 있습니다.

가끔 그런 일이 발생하여 멈추기도 하지만, 그 이후에는 보통 상당히 원활하게 작동하기 시작합니다. 이제 모든 바(bar)가 앞뒤로 움직이고 있으며, 초당 60주기입니다. 따라서 여기 하단에는 600으로 표시됩니다.

실제로 이 값은 60.0이어야 합니다. 또한, 원하신다면 주파수를 변경하실 수 있습니다. 시스템 내에서 세포에 기계적 자극을 가한 후, 일반적으로 약 2~5일 동안 유지하지만, 필요에 따라 기간을 더 짧게 또는 더 길게 설정할 수 있습니다.

정해진 종료 시점에 도달하면, 챔버를 꺼낸 후 해당 막 위의 세포를 사용하여 다양한 사항을 조사할 수 있습니다. 일반적으로 당사는 마이크로어레이, 2D 겔 전기영동을 포함한 다양한 기술을 사용합니다. 또한 PCR을 통해 유전자 발현을 확인하거나 웨스턴 블로팅을 통해 단백질 발현을 분석합니다.

단순히 세포를 용해하는 것 외에도, 막 위에서 직접 염색하여 특정 단백질의 면역형광을 관찰하거나, 막에서 세포를 분리한 후 염색하여 FACS 장비로 분석할 수도 있습니다. 이처럼 수행 가능한 작업과 관찰 대상이 매우 다양합니다. 또한, 서로 다른 종류의 마이크로 패턴 막이나 다양한 재료, 코팅 등을 사용하여 이 장치를 수정하고 싶을 경우, 장비의 다양한 변형 모델을 활용할 수 있습니다.