종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치 체외에서

이 절차의 전반적인 목표는 체외에서 종양 미세환경을 재현하고 화학요법 약물 테스트에 사용할 수 있는 미세유체 장치의 제조 및 작동을 시연하는 것입니다. 이것은 미세유체 장치입니다. 이 장치는 다음과 같은 분야에서 유용 할 수 있으며, 시험관 내에서 화학 요법 약물에 대한 쉬운 테스트를

3차원 종양 조직을 테스트하기 위한 일관되고 정확한 결과를 제공하며, 이 장치는 생체 내 종양을 매우 정확하게 표현합니다. 미시환경 종양은 3D 미시환경에 존재하며 그 중 하나에서 테스트할 수 있는 능력은 중요합니다. 절차의 첫 번째 단계는 소프트 리소그래피를 사용하여 미세유체 칩을 제작하고, 입구와 출구에 구멍을 뚫고, 유리 슬라이드에 접착하고, 흐름 입구와 출구를 위한 튜브를 연결하는 장치를 조립하는 것입니다.

다음으로, 균일한 다세포 종양 스테로이드를 생성하여 행잉 드롭(hanging drop) 방법을 사용하여 장치에 사용합니다. 그런 다음 스페로이드를 장치에 도입한 다음 세포사멸을 수행하여 제제 및 화학 요법 약물을 검출합니다. 마지막으로, 타임 랩스 현미경 검사가 수행된 후 약물 확산 계수의 수학적 추정을 수행하여 화학 요법제의 침투 능력을 정량화합니다.

궁극적으로, 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 조직 내 이질적인 미세환경의 장치 형성 및 조직으로의 약물 확산에서 조직 성장을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 고형 종양에 대한 항암제의 제한된 침투가 실패의 중요한 원인입니다. 대부분의 최신 암 약물 검사 모델은 고형 종양의 3차원 특성을 모방하지 않습니다.

우리는 지속적으로 관류되는 3차원 종양 조직으로 구성된 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 모델은 고형 종양에 대한 약물 전달과 전신 제거를 보다 정확하게 나타냅니다. 다세포 종양 스테로이드는 3차원 종양 조직의 잘 정립된 모델입니다.

이 절차에서는, 행잉 드롭 방법은 미세유체 장치에 사용하기 위한 스테로이드를 만드는 데 사용됩니다. 이 방법은 단기간에 일관된 스테로이드를 형성 할 수 있습니다. 화학요법 약물을 in vitro에서 3차원 조직으로 테스트하면 세포의 단층보다 더 효율적인 방식으로 약물을 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다.

PDMS와 실리콘 엘라스토머의 경화제를 9:1 중량 비율로 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물을 마스터에 부어 4mm 두께의 눈부심 드가를 형성합니다. 기포를 제거하려면 섭씨 60도에서 5시간 동안 경화됩니다.

금형에서 경화된 PDMS를 벗겨내어 엘라스토머에 흐름 특징의 스탬프를 얻습니다. 그런 다음 드릴에 장착된 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구의 펀치 구멍을 누릅니다. 이물질을 모두 꺼냅니다.

스탬프의 앞면과 깨끗한 유리 슬라이드를 8분 동안 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 산소 플라즈마 에칭기에서 처리된 표면을 즉시 접촉시켜 그들 사이에 결합을 형성하십시오. 슬라이드 워머에서 어셈블리를 섭씨 60도로 최소 5시간 동안 유지하십시오.

결합을 강화하려면 0.032인치 ID PTFE 튜브를 미세 유체 장치의 입구와 출구에 연결합니다. 미늘이 있는 암 루어 잠금 커넥터에 부착된 수 루어 잠금 커넥터의 인터페이스를 사용하여 이러한 특정 커넥터를 사용하여 깨지지 않고 쉽게 통과할 수 있습니다. 마지막으로 차단 밸브와 Y 커넥터를 사용하여 흐름 어셈블리를 설정하고 장치를 현미경에 장착합니다.장치를 장착한 후 튜브를 적절한 입구와 출구에 연결하여 흐름 설정을 완료합니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 이 구성을 사용하면 스페로이드를 장치에 포장하거나 장치를 통해 패킹할 매체의 흐름을 생성할 수 있습니다. 패킹 입구 밸브 VPN과 패킹 출구 밸브 VP를 열어 종양을 제거합니다. 그런 다음 OID는 입구를 통과하여 배양 챔버로 흘러 들어갈 수 있으며, 이 챔버의 포스트는 종양을 제자리에 고정하여 배지를 유동시킬 수 있습니다.

패킹 밸브를 닫고 흐름 입구 밸브 VF를 열고 흐름 출구 밸브 VF를 열어 균일한 PHE의 형성을 시작합니다. 행잉 드롭 방법을 사용하여 배양 후드 아래에서 트립신 얼음 세포를 사용합니다. 원심분리기에서 생성된 트립신 세포를 채취합니다.

원액을 표 1을 참조하여 원하는 농도로 희석한다. 그런 다음 48웰 플레이트의 덮개를 제거하고 거꾸로 놓습니다. 멸균 된 후드에 접시의 각 웰에 1 밀리미터의 멸균 된 물을 채 웁니다.

습도를 유지하려면 덮개의 각 원형 영역에 20마이크로리터의 희석 세포 용액 방울을 놓습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 덮개를 조심스럽게 뒤집고 플레이트 위에 놓고 방울이 우물의 가장자리에 닿지 않도록합니다. 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다.

사용된 특정 세포에 따라 배양의 기간에 대해서는 표 1을 참조하십시오, 스테로이드가 각 교수형 드롭에 형성됩니다. 먼저 흐름 유입구를 통해 70% 에탄올로 장치를 세척하여 장치를 살균합니다. 그 후 PBS를 각각 플러시한 다음 H-E-P-E-S 완충 세포 배양 배지를 세척합니다.

중간 주사기를 그대로 두고 튜브에 부착합니다. 다음으로, 주사기 탭 주사기에 2-3개의 스테로이드를 뽑습니다. 기포를 제거하려면 장치의 포장 입구에 주사기를 부착하십시오.

입구 밸브 VPN을 열고 VFN을 닫고 출구 밸브 VP를 열고 VF를 닫습니다. 바늘이 아래를 향하도록 포장 주사기를 수직으로 잡습니다. 스테로이드가 주사기 바닥에 바늘의 루어 잠금 커넥터에 가라앉는 것을 지켜보십시오.

패킹 주사기의 플런저를 누르고 패킹 배출 밸브만 열려 있기 때문에 PHE가 튜브에 들어가 장치로 흘러 들어가는 것을 지켜보십시오. 스테로이드는 장치의 챔버로 들어가 뒤쪽의 기둥에 의해 유지됩니다. 챔버 내부에서 S 스페로이드는 챔버의 모양을 따르고 직사각형 형상을 얻습니다.

입구 밸브 VPN을 닫고 출구 밸브 VP를 주사기 펌프에 흐름 주사기 SF를 장착합니다. 이 펌프는 주사기 펌프 프로 오픈 입구 밸브 VFN 및 출구 밸브 VF 출력을 사용하는 컴퓨터에 의해 실행됩니다. 분당 3 마이크로 리터로 장치로의 매체 흐름을 시작합니다.

24시간 동안 스페로이드를 배양한 후 세포사멸 검출제를 도입합니다. 세포사멸, 검출 또는 치료제를 도입하기 전에 최대 24시간 동안 스페로이드의 평형을 유지하여 영양 구배와 미세환경을 확립합니다. 그런 다음 밸브 VFN을 차단합니다.

주사기 펌프를 멈춥니다. 펌프에서 주사기를 제거하고 밀당 0.25마이크로리터의 CASP 글로우 레드 액티브 Caspase 3 마커가 있는 매체가 들어 있는 주사기로 교체합니다. 장치를 통해 0.7ml를 수동으로 세척하여 용액으로 장치를 세척하십시오.

그런 다음 펌프에 주사기를 장착합니다. 흐름을 다시 시작하고 밸브 VFN을 엽니다. 5-8시간의 기간 동안 캐스크 글러브 레드 액티브 cph 단계 3은 조직으로 확산되고 apoptotic 영역에서 더 밝게 형광을 발합니다. 이 농도의 apoptosis 검출 제제는 모든 후속 Flow 용액에서 유지됩니다.

독소루비신(Doxorubicin)은 세포사멸(apoptosis) 검출제의 도입 후 5-8시간 후에 도입됩니다. 이 처리는 세척에 의해 시스템에서 제거됩니다. 화학요법제를 추가하려면 세포사멸 검출 절차에 따라 10마이크로몰 독소루비신 염산염을 도입합니다.

그런 다음 치료 주사기를 0.7ml의 배지가 있는 주사기로 교체합니다. 정해진 기간 동안 치료제의 흐름을 계속하십시오. 그런 다음 밸브 VFN을 차단하고 주사기 펌프를 끕니다.

주사기 펌프에서 치료용 주사기를 제거하고 0.7ml의 배지가 있는 주사기로 교체합니다. 24-36시간 동안 새로운 배지의 흐름을 허용하면서 현미경으로 조직을 지속적으로 모니터링합니다. 타임 랩스 현미경 검사를 위한 전체 수집 프로세스는 IP 실험실에서 맞춤형 스크립트를 사용하여 자동화되었으며, 30분마다 10배 배율로 PAX Foid의 투과광 및 형광 이미지를 획득했습니다.약물 확산 계수의 수학적 추정을 위해 첫 번째 단계는 이미지 J.Select를 사용하여 문서 형광의 평균 선형 강도 프로파일을 생성하는 것입니다. 또는 챔버 내 조직을 포함하는 ROI.

플롯 프로파일 명령을 사용하여 평균 농도의 프로파일을 유동 채널로부터의 거리 함수로 생성합니다. 최대 3개의 다른 시점에 대해 반복합니다. 다음으로, 얻어진 강도 프로파일에서 평균 배경 형광 강도를 빼고 해당 최대 강도를 사용하여 각 프로파일을 정규화하여 X와 T의 함수로 C를 얻습니다. 여기서 C는 독소루비신의 정규화 된 농도이며, C의 값은 0에서 1 사이로 변합니다.

다음 단계는 종양 조직 문서 내 문서의 유효 확산 계수를 평가하는 것입니다. 확산은 다음 방정식으로 나타낼 수 있으며, 여기서 ERFC는 상보 오류 함수입니다. X는 채널에서 조직으로의 거리이고 T는 독소루비신이 도입된 후의 시간입니다.

고려되는 각 시점에서 다음 반복 체계를 사용합니다. D.각 위치에서 방정식의 오른쪽을 계산하기 위한 값을 추측합니다. X.두 변 사이의 제곱 오차의 합을 계산하고 D를 수정하여 잔차 평균을 최소화합니다.

조직에서 독소루비신의 평균 유효 확산 계수를 추정하기 위해 각 시점에서 얻은 D의 최적 값. 미세유체 장치는 3차원 종양 조직의 성장을 위해 1mm x 0.3mm x 0.15mm 광학적으로 접근 가능한 배양실을 제공했습니다. 행잉 드롭(hanging drop) 방법을 사용하면 여러 세포주에서 일정한 크기와 모양의 종양 PHE를 빠르게 형성할 수 있었습니다.

PHE는 최대 3일 동안 장치에서 성공적으로 성장했습니다. 챔버의 성장은 미세환경의 재현 가능한 변형과 관련이 있었습니다. phe 내에서 세포사멸은 유동 채널에 가까운 세포에서 덜 발생하고 조직 깊숙이 더 높고 더 깊게 발생했습니다.

이 장치는 독소루비신과 종양 조직의 확산 계수를 추정하는 데 사용되었습니다. 실험적으로 관찰된 값은 이 절차를 시도하는 동안 인간 유방암에서 이전에 보고된 값과 일치했습니다. PHE는 세포 배양 외부에서 수행해야 하기 때문에 PHE를 장치에 주입할 때 멸균 상태를 유지하는 데 각별히 주의하는 것이 중요합니다.

후드는 주사기와 튜브 끝에 에탄올을 넉넉하게 분사하여 무균 상태를 보장합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 종양에 대한 약물의 제한된 침투의 역할을 이해하게 될 것입니다. 우리는 3차원 종양 조직에 대한 약물의 전달 및 전신 제거를 모방하고 침투를 정량화하는 기술을 입증했습니다.

침투력이 약한 약물을 제거하면 암 약물 개발 과정을 크게 간소화할 수 있습니다.