종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치 체외에서

본 절차의 전반적인 목표는 체외에서 종양 미세환경을 재현하고 화학요법 약물 테스트에 사용할 수 있는 미세유체 소자의 제작 및 작동 방법을 시연하는 것입니다. 이것이 미세유체 소자입니다. 이 소자는 체외에서의 간편한 화학요법 약물 테스트와 같은 다음과 같은 분야에서 유용하게 활용될 수 있습니다.

이 장치는 3차원 종양 조직 테스트에 대해 일관되고 정확한 결과를 제공하며, 생체 내 종양을 매우 정확하게 재현합니다. 종양은 3D 미세환경에서 존재하므로, 이러한 환경에서 테스트할 수 있는 능력은 매우 중요합니다. 실험 절차의 첫 번째 단계는 장치를 조립하는 것으로, 소프트 리소그래피를 이용한 미세유체 칩 제작, 입구 및 출구의 구멍 펀칭, 유리 슬라이드 접합, 그리고 유입 및 유출을 위한 튜빙 연결 과정이 포함됩니다.

다음으로, 현적법(hanging drop method)을 사용하여 장치에 사용할 균일한 다세포 종양 스페로이드를 생성합니다. 그 후 스페로이드를 장치에 도입하고, 이어서 세포사멸 유도제, 검출제 및 화학요법 약물을 주입합니다. 마지막으로 타임랩스 현미경 관찰을 수행한 뒤, 화학요법 약물의 침투 능력을 정량화하기 위해 약물 확산 계수를 수학적으로 추정합니다.

최종적으로, 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 장치 내의 조직 성장, 조직 내 이질적 미세환경의 형성, 그리고 조직으로의 약물 확산을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 고형암 내로 항암제가 제한적으로 침투하는 것은 치료 실패의 중요한 원인이 됩니다. 현재 대부분의 항암제 테스트 모델은 고형암의 3차원적 특성을 모방하지 못하고 있습니다.

당사는 지속적으로 관류되는 3차원 종양 조직으로 구성된 미세유체 장치를 개발했습니다. 이 모델은 고형암으로의 약물 전달과 전신 제거 과정을 더욱 정확하게 나타냅니다. 다세포 종양 스페로이드는 3차원 종양 조직의 잘 확립된 모델입니다.

본 절차에서는 마이크로플루이딕 장치에 사용할 스페로이드를 제작하기 위해 행잉 드롭(hanging drop)법을 사용합니다. 이 방법은 짧은 시간 내에 일관된 크기의 스페로이드를 형성할 수 있게 합니다. 3차원 조직에서 항암제를 인비트로(in vitro) 테스트하는 것은 세포 단층 배양과 비교하여 더욱 효율적인 방식으로 약물을 스크리닝하는 데 도움이 될 수 있습니다.

실리콘 엘라스토머의 PDMS와 경화제를 9:1 중량비로 혼합합니다. 그다음, 이 혼합물을 마스터 위에 부어 4 mm 두께의 층을 형성하고 탈기합니다. 기포를 제거하기 위해 60 °C에서 5시간 동안 경화시킵니다.

경화된 PDMS를 몰드에서 떼어내어 엘라스토머 위에 유로 구조가 형성된 스탬프를 얻습니다. 그 다음, 드릴에 장착된 1.5 mm 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구가 될 구멍을 뚫습니다. 남아 있는 모든 파편을 제거합니다.

스탬프의 패턴 면과 깨끗한 유리 슬라이드를 8분 동안 산소 플라스마 처리합니다. 산소 플라스마 식각기 내에서 처리된 두 표면을 즉시 접촉시켜 접합을 형성합니다. 접합된 어셈블리를 슬라이드 워머 위에서 60°C로 최소 5시간 동안 유지합니다.

결합력을 강화하기 위해 내경 0.032 inches의 PTFE 튜빙을 미세유체 장치의 입구와 출구에 연결합니다. 바브형 암컷 루어 락 커넥터에 연결된 수컷 루어 락 커넥터 인터페이스를 사용하며, 이러한 특정 커넥터들은 파손 없이 쉽게 통과할 수 있도록 사용됩니다. 마지막으로, 차단 밸브와 Y 커넥터를 사용하여 유체 흐름 어셈블리를 구성하고 장치를 현미경에 장착합니다. 장치를 장착한 후, 튜빙을 적절한 입구와 출구에 연결하여 유체 흐름 설정을 완료합니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, 이러한 구성은 스페로이드를 장치 내에 쉽게 다용도로 패킹하거나, 장치 내로 배지 흐름을 생성하여 패킹할 수 있게 합니다. 패킹 유입 밸브 VPN과 패킹 유출 밸브 VP out을 엽니다. 그러면 종양 OID가 유입구를 통해 통과하여 배양 챔버로 흘러 들어갈 수 있으며, 이 챔버 내의 포스트가 배지 흐름 속에서 종양을 제자리에 고정시킵니다.

패킹 밸브를 닫고 유입 밸브 VF in과 유출 밸브 VF out을 열어 균일한 PHE 형성을 시작합니다. 배양 후드 내에서 현탁 방울법(hanging drop method)을 사용하여 trypsin-ice cell을 처리합니다. 원심분리기에서 처리된 trypsin 세포를 회수합니다.

표 1을 참조하여 스톡 용액을 원하는 농도로 희석합니다. 다음으로, 48웰 플레이트의 커버를 제거하고 이를 뒤집어 놓습니다. 멸균 후드 내에서 플레이트의 각 웰에 멸균수 1 mL를 채웁니다.

습도를 유지하기 위해, 커버의 각 원형 영역에 희석된 세포 용액 20 µL 한 방울씩을 떨어뜨립니다. 마이크로 파이펫을 사용하여 커버를 조심스럽게 뒤집어 플레이트 위에 올리며, 이때 방울이 웰의 가장자리에 닿지 않도록 주의합니다. 플레이트를 37 °C에서 배양합니다.

사용된 특정 세포에 따른 배양 시간은 표 1을 참조하십시오. 각 행잉 드롭(hanging drop) 내에서 스테로이드가 형성됩니다. 우선 유입구를 통해 70% ethanol로 장치를 세척하여 멸균합니다. 이어서 PBS와 H-E-P-E-S 완충 세포 배양 배지로 각각 세척하십시오.

배지 시린지를 남겨두고 튜빙에 연결하십시오. 다음으로, 스테로이드를 2~3회 시린지 탭 시린지로 흡입하십시오. 기포를 제거하려면 시린지를 장치의 패킹 입구에 연결하십시오.

입구 밸브 VPN을 열고 출구 밸브 VP out을 닫은 후 VF out을 닫습니다. 패킹 시린지를 바늘이 아래를 향하도록 수직으로 세워 잡습니다. 스테로이드가 시린지 바닥의 바늘 루어 락 커넥터로 가라앉는 것을 확인합니다.

패킹 시린지의 플런저를 밀어 PHE가 튜빙으로 들어가 장치 내부로 흐르는 것을 확인하십시오. 이때는 패킹 배출 밸브만 열려 있습니다. 스테로이드가 장치의 챔버로 들어가 후면의 포스트에 의해 고정됩니다. 챔버 내부에 진입하면 S 스페로이드는 챔버의 모양에 맞게 변형되어 직사각형 기하학적 구조를 갖게 됩니다.

유입 밸브 VPN과 유출 밸브 VP out을 닫고, 시린지 펌프에 유량 시린지 SF를 장착하십시오. 이 펌프는 syringe pump pro 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터로 작동됩니다. 유입 밸브 VFN과 유출 밸브 VF out을 엽니다. 장치 내로 3 µL/min의 속도로 배지를 흘려주기 시작하십시오.

스페로이드를 24시간 동안 배양한 후, 세포 사멸 검출 시약을 투입합니다. 세포 사멸 검출 또는 치료 시약을 투입하기 전에, 영양분 구배와 미세환경이 형성될 수 있도록 스페로이드를 최대 24시간 동안 평형 상태로 유지하십시오. 그 다음 밸브 VFN을 닫습니다.

시린지 펌프를 정지시킵니다. 펌프에서 시린지를 제거하고 0.25 µL/mL의 CASP glow red active Caspase three marker가 포함된 배지가 들어 있는 시린지로 교체합니다. 해당 용액 0.7 mL를 장치에 수동으로 흘려보내 장치를 세척합니다.

그런 다음 주사기를 펌프에 장착합니다. 흐름을 다시 시작하고 밸브 VFN을 엽니다. 5~8시간에 걸쳐 cask glove red active cph phase three가 조직으로 확산되며, 세포 사멸 부위에서 더 밝게 형광을 발합니다. 이 농도의 apoptosis detecting agent는 이후 모든 유동 용액에 유지됩니다.

apoptosis 검출제를 투여한 5~8시간 후에 Doxorubicin을 투여합니다. 이 처리제는 세척 과정을 통해 시스템에서 제거됩니다. 화학요법제를 추가하려면, apoptosis 검출 절차에 따라 10 µM doxorubicin hydrochloride를 투여하십시오.

그 다음 처리 시린지를 0.7 milliliters의 배지가 담긴 시린지로 교체하십시오. 정해진 시간 동안 치료제 주입을 계속합니다. 이후 밸브 VFN을 잠그고 시린지 펌프의 전원을 끕니다.

시린지 펌프에서 처리용 시린지를 제거하고 0.7 milliliters의 배지가 담긴 시린지로 교체하십시오. 현미경으로 조직을 지속적으로 관찰하면서 24~36시간 동안 신선한 배지를 흘려줍니다. 타임랩스 현미경의 전체 획득 과정은 IP lab의 맞춤형 스크립트를 사용하여 자동화하였으며, 30분마다 10 x 배율로 PAX Foid의 투과광 및 형광 이미지를 획득하였습니다. 약물 확산 계수의 수학적 추정을 위한 첫 번째 단계는 Image J를 사용하여 약물 형광의 평균 선형 강도 프로필을 생성하는 것입니다. 챔버 내의 조직을 포함하는 직사각형 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.

plot profile 명령어를 사용하여 유동 채널로부터의 거리에 따른 평균 강도의 프로파일을 생성하십시오. 최대 3개의 서로 다른 시간 지점에 대해 이 과정을 반복하십시오. 다음으로, 얻어진 강도 프로파일에서 평균 배경 형광 강도를 뺀 후, 각 프로파일을 해당 최대 강도로 정규화하여 X와 T의 함수로서 C를 구하십시오. 여기서 C는 doxorubicin의 정규화된 농도이며, C의 값은 0에서 1 사이에서 변합니다.

다음 단계는 종양 조직 내 doxorubicin의 유효 확산 계수를 평가하는 것입니다. 확산은 다음 방정식으로 나타낼 수 있으며, 여기서 ERFC는 상보 오차 함수입니다. X는 채널로부터 조직 내부로 들어간 거리이며, T는 doxorubicin 투여 후의 시간입니다.

고려되는 각 시간 지점에서 다음과 같은 반복 체계를 사용하십시오. D 값을 추측합니다. 각 위치에서 방정식의 우변을 계산합니다. X.양변 사이의 제곱 오차 합계를 계산하고, 잔차 평균을 최소화하도록 D를 수정합니다.

조직 내 doxorubicin의 평균 유효 확산 계수를 추정하기 위해 각 시점에서 얻은 D의 최적값입니다. 미세유체 장치는 3차원 종양 조직 성장을 위해 1 mm × 0.3 mm × 0.15 mm 크기의 광학적 접근이 가능한 배양 챔버를 제공했습니다. hanging drop법을 통해 여러 세포주로부터 크기와 모양이 일정한 종양 PHE를 신속하게 형성할 수 있었습니다.

PHE를 해당 장치에서 최대 3일 동안 성공적으로 배양하였습니다. 챔버 내에서의 성장은 미세환경의 재현 가능한 변형과 연관이 있었습니다. PHE 내부에서 세포 사멸은 유로와 인접한 세포에서 더 적게 발생했으며, 조직의 더 높은 곳과 깊은 곳에서 더 많이 발생했습니다.

이 장치는 독소루비신과 종양 조직의 확산 계수를 추정하는 데 사용되었습니다. 실험적으로 얻은 값은 이전에 보고된 인간 유방암의 값과 일치했습니다. 이 절차를 수행할 때, PHE를 장치로 흘려보내는 과정은 세포 배양 외부에서 수행되어야 하므로 무균 상태를 유지하는 데 각별히 주의하는 것이 중요합니다.

멸균 상태를 보장하기 위해 후드 내의 스프레이 시린지와 튜빙 끝부분에 에탄올을 충분히 뿌려줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 종양 내로의 제한적인 약물 침투가 갖는 역할에 대해 이해하게 될 것입니다. 본 영상에서는 3차원 종양 조직에서 약물의 전달 및 전신 소실을 모사하고 그 침투 정도를 정량화하는 기술을 시연하였습니다.

투과성이 낮은 약물을 제거함으로써 암 치료제 개발 과정을 상당히 효율화할 수 있을 것입니다.