Name: 사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 학습하세요 사포닌 투과 처리된 심장 섬유를 이용한 미토콘드리아 산화 인산화 평가 방법을. 고해상도 호흡 측정법으로 심장 생체에너지학 및 미토콘드리아 기능을 정밀 분석합니다.

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이 연구는 건강 연구와 게놈 캐나다의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. JS는 의료 연구, 심장과 캐나다의 행정 재단과 캐나다 당뇨병 협회 앨버타 헤리티지 재단의 급여 지원 수상 경력을 보유하고 있습니다. 실험실은 사포닌 - permeabilized 섬유 기술의 인수 중에 Oroboros 악기의 기술 지원을 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

사포닌 - permeabilized 심장 섬유 기술은 체외에서 mitochondrial OXPHOS 산소 소비의 생체내 평가 사이에 독특한 타협을 제공합니다. 이 기법의 장점은 보존되어 있습니다 셀룰러 아키텍처로 격리 mitochondria에 비해 생리 관련을 증가 등이 있습니다. 플라즈마 막이 저하되는 동안, mitochondria 12를 포함하여 세포 멤브레인 구조, 14, sarcoplasmic reticulum 14, 근육 섬 유지 및 cytoskeleton 1, 17 그대로 남아 있습니다. 또한, mitochondria 및 cytoskeleton 일, 17 사이의 상호 작용도 변형입니다. permeabilized 섬유의 Mitochondria가 증가 안정성을 보여줍니다. 설치류 섬유 준비는 최대 24 시간 18,2하는 안정성을 보여주 6h 인간 섬유 샘플...

<table><tbody><tr><td>100% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td> esencially fatty acid&amp;#8211;free 우혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>탄산칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis-(2-amin&amp;#8211;thylether)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>글루탐산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>락토바이오닉산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 6수화물 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>말산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>시안화칼륨</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>인산일수소칼륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>농도 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>숙신산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>킴와이프스</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>직선형 정밀 핀셋</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 정밀 핀셋</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>직선형 수술용 가위</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 메스 날</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m 시린지 필터</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 폴리스티렌 조직 배양 플레이트</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 교반기</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 마그네틱 바</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>전자저울</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton 마이크로 시린지</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton 마이크로 시린지</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;l Hamilton 마이크로 시린지</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 세척병</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 칭량 접시</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 respirometric 산화 인산화 평가

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

mitochondria가 에너지 대사, 산화 스트레스, apoptosis, 노화, mitochondrial encephalomyopathies 및 약물 독성에 관련된으로 mitochondrial 기능의 조사는 심장 생리학의 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 이것을 감안할 때, 심장 mitochondrial 기능을 측정하는 기술 수​​요에 있습니다. mitochondrial 기능을 측정하는 통합 접근 방식을 채택 한 기술은 respirometric 산화 인산화 (OXPHOS) 분석입니다. respirometric OXPHOS 평가의 원칙은 클락 전극을 이용하여 산소 농도를 측정 중심이다. permeabilized 섬유 번들 폐쇄 챔버 감소에 산소, 산소 농도를 소모로. 선택된 기판 - 억제 - uncoupler 적정 프로토콜을 사용하여, 전자는 mitochondrial 기능의 평가를 허용, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에 제공됩니다. , mitochondrial 함수의 respirometric 분석하기 전에 기계적 및 화학적 준비 기술은 근육 섬유의 sarcolemma을 permeabilize로 활용하고 있습니다. 화학 permeabilization는 세포 구조를 유지하면서 선택적으로 세포막을 구멍에 사포닌 고용합니다. 본 논문은 철저히 mitochondrial OXPHOS을 평가하기 위해 산소 소비 측정에 대한 사포닌 피부 심장 섬유 준비에 관련된 단계를 설명합니다. 또한, 조언뿐만 아니라 특정 기판 문제 해결, 전자 수송 사슬의 특정 사이트에서 mitochondria 기능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 저해제와 uncouplers이 제공됩니다. 중요한 것은 설명 프로토콜은 쉽게 다양한 동물 모델과 인간의 샘플의 심장과 골격 조직에 적용할 수 있습니다.

respirometric 산화 인산화 분석과 함께 사포닌 - permeabilized 섬유 준비 mitochondrial 기능의 통합 평가를 제공합니다. 생리학 및 병리 학적 상태에서 Mitochondrial 호흡은 mitochondrial 상호 작용, 형태학 및 생화학 등 다양한 규제의 영향을 반영하실 수 있습니다.

사포닌 - permeabilized 심장 섬유에 Respirometric 산화 인산화 평가

미토콘드리아는 에너지 대사에 관여하므로, 미토콘드리아 기능의 조사는 심장 생리학의 중요한 매개변수를 나타냅니다.

본 절차의 전반적인 목적은 편광 측정(polarographic measurements)을 위해 사포닌 투과(Saponin perme) 심근 섬유를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 마우스에서 심장을 적출함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 최대 6~8개의 섬유가 느슨하게 연결된 심근 섬유 다발을 기계적으로 준비하는 것입니다.다음으로, 사포닌(saponin)을 사용하여 심장 다발을 화학적으로 투과화합니다. 그 후, 심장 다발을 세척하여 남아 있는 사포닌과 대사물을 제거합니다. 최종적으로, 폴라리그래피(polari graphic) 측정을 통해 미토콘드리아 산화적 인산화에 대한 통찰을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 캘거리 대학교 생화학 및 분자생물학과 Jane Sheer 박사님 연구실의 Curtis Huey입니다. 오늘은 사포닌 투과 심근 섬유(saponin perme cardiac fibers)를 준비하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 인시튜(in situ) 미토콘드리아 산화적 인산화를 평가합니다.그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 해양 생물의 심장을 적출하여 얼음 위에 놓인 RP 용액이 담긴 페트리 접시에 넣으십시오. 해부 현미경을 사용하여 결합 조직이나 지방을 조심스럽게 제거하십시오.심장을 중격(septum)을 따라 절반으로 자른 후, 좌심실의 심내막 표면에서 10~25 mg(습중량)의 조직을 절제합니다. 심근의 기계적 손상을 최소화하기 위해 절개 방향이 섬유 방향과 일치하도록 합니다. 분리한 조직 소시료를 얼음 위에 놓인 RP 용액이 담긴 별도의 페트리 접시에 넣습니다.심장을 섬유 방향을 따라 직경 1~1.5 mm의 세로 조각으로 자릅니다. 매우 주의하며 날카로운 핀셋과 메스를 사용하여 조각을 2~4 mm 길이로 짧게 자릅니다. 섬유 다발을 기계적으로 분리합니다.최종 섬유 다발은 작은 접촉 부위로 연결된 최대 6~8개의 섬유를 포함해야 하며, 습중량 기준 1~3 mg 사이여야 합니다. 육안으로 보았을 때, 심장 조직은 원래의 붉은색에서 옅은 분홍색으로 변해야 합니다. 12웰 플레이트를 얼음에 올려 심장 섬유 다발 준비를 시작하십시오.칼슘 오염을 최소화하기 위해 웰을 RP 용액으로 헹굽니다. 50 µg/mL의 사포닌이 포함된 얼음처럼 차가운 RP 용액 3 mL를 웰 중 하나에 넣습니다. 그런 다음 기계적으로 준비된 섬유 다발을 해당 웰로 옮깁니다.섬유 다발을 얼음 위에서 가볍게 교반하며 20분 동안 배양합니다. 새로운 웰을 mirror five 용액으로 헹군 후, 얼음처럼 차가운 mirror five 10 milliliters를 새로운 웰에 피펫으로 분주합니다. 심장 다발을 해당 웰로 옮기고 얼음 위에서 가볍게 교반하며 10분 동안 배양합니다.배양 후, mirror five를 사용하여 반복합니다. 신선한 mirror five로 2~3회 세척합니다. 매회 심장 다발을 10 milliliters의 ice cold mirror five로 옮깁니다.반복적인 세척 단계는 호흡 분석 직전에 섬유 다발에서 saponin A-T-P-A-D-P 및 남아 있는 기질을 완전히 제거하기 위한 것입니다. 핀셋을 사용하여 개별 섬유 다발을 흡수성 표면에 대고 5초 동안 유지하거나 모든 수분이 제거될 때까지 눌러 젖은 상태의 무게를 측정합니다. 다른 흡수성 표면을 사용하여 핀셋에 묻은 과도한 액체를 제거합니다.저울의 영점을 잡고 질량 측정을 위해 플라스틱 웨잉 디쉬(wabo) 위에 섬유 다발을 올립니다. 심장 섬유 다발을 얼음처럼 차가운 near five가 들어있는 새 웰로 옮깁니다. 이제 섬유 다발을 사용하여 산소 소비량 평가를 수행할 준비가 되었습니다.다음의 검증 적정은 2챔버 적정 주입 XI 그래프를 사용하여 수행됩니다. 이러한 실험은 호흡 바로메트리 연구의 실험 및 진단 목적에 따라 개별 프로토콜로 수행하거나 적정 프로토콜에 포함시켜 수행할 수 있습니다. 여기서 사용된 ERO GRA 2K는 산소 농도를 측정할 수 있습니다.장치는 DAT lab 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 연결되어 있어, 실험 전 과정 동안 산소 농도의 변화를 실시간 산소 소비량 측정값으로 보고할 수 있습니다. 미러링 심근 섬유를 XI 이식 챔버에 넣기 전, 폴라로그래픽 산소 센서(POS)가 들어 있는 챔버 하우징에 mirror five 2.1 milliliters를 첨가합니다. 챔버를 닫으면 XI 이식 챔버 내에 mirror five 2 milliliters가 유지됩니다.Mirror five가 37 °C에서 공기 포화 및 평형 상태에 도달할 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 평형이 이루어지면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅 교반봉으로 교반되는 XI graft chamber 내의 mirror five에 심장 섬유 시료를 넣습니다.산소가 충전된 시린지를 사용하여 GRAT 챔버의 산소 농도를 250에서 550 micromolar 사이로 높입니다. 10 microliter Hamilton 시린지를 사용하여 산소 농도가 안정화될 때까지 5에서 10분간 대기합니다. 최종 농도가 10 millimolar가 되도록 2 molar glutamate 10 microliters를 챔버에 첨가합니다.그런 다음 별도의 Hamilton 시린지를 사용하여 800 mM malate 5 µL를 첨가하여 챔버 내 최종 농도가 2 mM이 되게 합니다. 이 적정 단계는 기저 complex one 지원 호흡을 결정하는 데 사용됩니다. 산소 플럭스는 적정 후 약 5분 이내에 안정화되어야 하며, 이를 통해 산소 소비량인 state two 산소 소비량을 결정할 수 있습니다.2~5분 동안 안정적인 산소 소비가 일어난 후 DP가 없는 경우, 25 µL Hamilton 마이크로 시린지를 사용하여 500 mM A DP 20 µL를 첨가하여 최종 포화 농도를 5 mM로 맞춥니다. 이 농도는 90% 이상의 포화도에 도달하도록 하여 최대 상태를 결정하는 데 사용됩니다. 셋째, 복합체 I을 통한 미토콘드리아 호흡을 위해 2~5분 동안 추가로 안정적인 산소 소비를 유지합니다.그 다음 10 µL Hamilton 마이크로 시린지를 사용하여 4 mM cytochrome C 5 µL를 첨가하여 최종 농도를 10 µM로 맞춥니다. 이 시점의 산소 농도는 외막 미토콘드리아 막의 무결성에 대한 품질 관리 분석을 수행하는 데 사용됩니다. 산소 소비가 2~5분 동안 더 안정적으로 유지된 후, TP synthase를 억제하기 위해 4 mg/mL ACIN 1 µL를 첨가합니다.이 적정 단계는 미토콘드리아 내막의 온전성을 검증하는 데 사용됩니다. respirometric oxphos 평가 후, 건조 중량 측정 또는 미토콘드리아 마커 결정을 위해 샘플을 제거하십시오. 그런 다음 XI Grat의 유리 챔버에서 mirror five를 제거하십시오.챔버를 증류수로 최소 3회 세척하십시오. 이어서 100% ethanol로 최소 3회 더 세척하십시오. 이는 oligomycin과 같은 ethanol 가용성 억제제를 제거하기 위함입니다.이어서 70% ethanol로 두 번 더 세척합니다. 그 다음 70% ethanol을 추가하고 XI 이식 챔버를 30분 동안 담가 멸균합니다. 마지막으로 POS가 포함된 챔버를 2중 증류수로 최소 5회 세척합니다. 적절하게 준비된 미러링 심근 섬유의 산소 소비량은 제시된 품질 관리 프로토콜에 따라 평가하며, 호흡 조절 비율(RCR)은 투과성 섬유 표본에서 산소 소비와 산화적 인산화 사이의 결합 정도를 나타냅니다.RCR은 상태 2 대비 상태 3의 호흡률, 또는 상태 4 대비 상태 3의 호흡률을 의미하며, 잘 결합된 투과성 외막이 보존된 심장 조직 준비물에서는 3에서 6 사이의 RCR 값이 나타납니다. cytochrome C 적정은 조직 준비가 적절하게 이루어졌는지를 검증하는 데 사용됩니다. Cytochrome C는 미토콘드리아 내막의 막간 공간에 위치하는 단백질입니다.미토콘드리아의 외막이 온전할 때, 내인성 cytochrome C는 막 사이 공간에 머무르며 외인성 cytochrome C의 적정은 호흡에 거의 영향을 미치지 않습니다. 반대로, 미토콘드리아 외막이 손상되면 내인성 cytochrome C가 막 사이 공간에서 방출되어 외인성 cytochrome C를 추가하기 전까지 호흡을 억제하게 되며, 이를 통해 병리적 또는 실험적 스트레스 요인이 미토콘드리아 외막의 온전성에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. CIN의 첨가는 DP에 기여하지 않는 산소 소비량인 누출 호흡(leak respiration)의 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 인산화 대조군 또는 야생형 섬유는 CIN 첨가에 민감하게 반응하여 산소 유속이 유의하게 감소해야 합니다.낮은 RCR과 올리고마이신(oligo mycin)에 대한 감수성 저하로 인해 산소 유속이 상대적으로 높게 나타나는 것은 준비 과정 중 미토콘드리아 내막에 손상이 발생했음을 나타냅니다. 본 실험에서 보이는 것처럼 기질 억제제 언커플링 적정(uncoupling titrations)에 반응이 없는 것은 RP 및 mirror five 용액 내에서 sasin 및 skinning 처리된 근섬유 다발의 배양 기간이 너무 길었음을 시사할 수 있습니다. 향후 실험에서는 동물 희생부터 산소 소비 측정까지의 시간을 최소화해야 합니다.지금까지 극좌표 그래픽 측정(polar graphic measurements)을 위한 심장 섬유 다발 준비 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때 심장 섬유의 기계적 분리 과정에서 각별한 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하시기 바랍니다. 이상으로 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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