의식 랫에서 인슈린 과다 - Euglycemic 클램프

본 절차의 전반적인 목적은 의식이 있고 구속되지 않은 쥐의 인슐린 민감도를 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 왼쪽 경동맥에 카테터를 삽입합니다. 그다음, 최적의 결과를 얻기 위해 오른쪽 경정맥에 카테터를 삽입합니다.

5일간의 수술 후 회복 기간 동안 개통성을 유지하기 위해 카테터를 매일 세척합니다. 최종적으로 고인슐린혈증-정상혈당 클램프(hyperinsulinemic euglycemic clamp)를 통해 전신 포도당 주입률을 확인할 수 있습니다. 이 기법의 주요 장점은 높은 생리적 인슐린 농도에서 전신 포도당 처리율을 직접 측정할 수 있다는 점입니다.

동맥 및 정맥 카테터는 수술 절차 전에 미리 준비해야 합니다. 카테터의 끝은 뭉툭해야 하며, 헤파린 처리된 생리식염수를 채워야 합니다. 또한 에탄올로 멸균하고, 동맥 및 정맥 카테터의 경우 한쪽 끝에서 각각 2.7 또는 3.2 cm 지점에 고정 밴드를 단단히 부착해야 합니다. 본 절차에서는 약 300 g의 성체 수컷 Sprague Dawley 랫드를 사용합니다.

동물의 시작 체중을 기록하고, 이 체중을 기준으로 수술 후 체중 증가를 모니터링하십시오. 무균 수술 구역에서 작업을 수행합니다. 쥐를 마취 상자에 넣어 3% isof fluorine으로 마취시키십시오.

동물을 수술 구역 밖으로 옮기고, 목과 어깨 주변의 털을 제거하여 절개 부위를 준비합니다. 제모가 완료되면, 약 2% isof fluorine으로 마취 상태를 유지하기 위해 동물의 코에 노즈 콘(nose cone)을 씌웁니다. 동물을 수술대 위에 고정합니다.

발 또는 눈의 반사 반응 여부를 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 절개 부위를 70% ethanol로 세척한 후, Betadine으로 문질러 닦고 다시 70% ethanol로 세척합니다. 실험의 첫 번째 단계는 흉골 상단 10 millimeter 지점에 작은 수직 중앙 절개를 만드는 것입니다.

곡선형 미세 해부 핀셋을 사용하여 조직을 둔탁하게 박리하여 왼쪽 흉골유돌근을 노출시킵니다. 이 근육을 젖혀 왼쪽 경동맥의 약 1cm 구간을 드러냅니다. 미세 해부 핀셋을 경동맥 아래에 배치하여 혈관을 고정한 상태에서 결합 조직을 조심스럽게 떼어냅니다.

동맥이나 신경 어느 쪽에도 손상을 주지 않고 동맥으로부터 미주신경을 분리하는 것이 중요합니다. 멸균된 4-0 실크 봉합사를 사용하여 머리 쪽 끝을 결찰하십시오. 톱니 모양의 미세 박리 포셉으로 혈관을 고정하십시오.

결찰된 부위를 천자합니다. 21 gauge ven eject 멀티 샘플 루어 어댑터로 마무리합니다. 카테터에서 스테인리스 스틸 플러그를 제거하고, 멸균된 카테터 도입기를 사용하여 동맥으로 안내하여 삽입합니다.

포셉을 사용하여 카테터가 고정되었는지 확인합니다. 미세 해부용 포셉을 놓고 동맥을 클램핑한 후, 비드(bead)까지 카테터를 계속 삽입합니다. 이 시점에서 카테터의 팁은 대동맥궁에 위치해야 합니다.

비드 아래쪽에 두 개의 봉합사를, 위쪽에 한 개의 봉합사를 고정하고, 10 units/mL 헤파린 생리식염수로 라인을 세척합니다. 카테터의 샘플링 가능 여부를 확인하기 위해 카테터의 외부 끝단을 스테인리스 스틸 플러그로 다시 막습니다. 다음으로 조직을 둔성 박리하여 우측 외경정맥을 노출시킨 후, 정맥을 조심스럽게 분리하고 두정맥을 결찰합니다.

실크 봉합사로 마무리합니다. 21 gauge 정맥 천자침으로 정맥을 찌릅니다. multis 샘플 루어 어댑터를 분리합니다.

카테터에서 스테인리스 스틸 플러그를 제거하고 멸균 카테터 도입기를 사용하여 비드까지 삽입합니다. 비드 아래에 두 개의 봉합사를, 위에 한 개의 봉합사를 고정합니다. 그런 다음 10 units/mL 헤파린 아이스 식염수로 라인을 세척합니다.

카테터의 샘플링 가능 여부를 확인하려면, 14 gauge 둔침(blunt needle)을 사용하여 카테터의 외부 끝단을 스테인리스 스틸 플러그로 다시 막고 피부 아래로 터널을 만든 후, 양쪽 견갑골 사이의 등 부위에 절개를 가합니다. 그다음, 카테터가 쥐의 등 쪽으로 나오도록 바늘을 통해 통과시킵니다. 각 카테터의 약 4 cm 정도가 외부로 노출되어야 합니다.

Tigon S 50 HL 의료용 튜브를 0.5 centimeters 길이로 자른 후, 외부로 노출된 두 카테터 주위에 배치합니다. 정맥용은 파란색 테이프로, 동맥용은 빨간색 테이프로 고정합니다. 카테터의 개통성을 확인하기 위해 다시 테스트하고, 혈전 형성을 방지하기 위해 150 units per milliliter 헤파린 식염수로 플러싱 및 충전합니다.

3-0 silk 봉합사를 사용하여 모든 절개 부위를 봉합합니다. 먹이를 쉽게 섭취할 수 있도록 미리 데워진 깨끗한 케이지에 쥐를 복와위로 배치합니다. 쥐가 완전히 보행 능력을 회복하고 의식을 되찾으면, 원래의 케이지로 돌려보냅니다.

쥐가 3~5일 동안 회복하도록 하며, 매일 감염, 통증 및 체중 변화를 모니터링하십시오. 연구 전 기간 동안 카테터의 개통성을 유지하는 것이 중요합니다. 수술 후 매일 150 units/mL 헤파린 식염수를 1mL 슬립 팁 시린지에 채우고 22 gauge 둔단 바늘로 캡을 씌우십시오.

뭉툭한 바늘을 23게이지 스테인리스강 튜브 커플러가 반대쪽 끝에 연결된 20cm 길이의 PE 50 튜브에 삽입합니다. 라인에서 모든 기포를 반드시 제거하십시오. 지혈鉗(hemostats)를 사용하여 쥐의 체외로 인출된 동맥 라인을 플러그 바로 아래 부분에서 잠급니다.

다른 지혈鉗子(hemostat) 한 쌍을 사용하여 스틸 카테터 플러그를 제거합니다. 시린지와 연결된 튜빙 커플러를 동맥 라인에 삽입하고, 외부로 노출된 동맥 카테터를 막고 있던 지혈鉗子를 풉니다. 그다음, 카테터 내의 동맥혈을 시린지로 흡인합니다.

카테터로 흡입이 잘 되지 않는 경우, 팁의 고착을 풀기 위해 소량의 용액을 카테터를 통해 매우 조심스럽게 밀어 넣어야 할 수도 있습니다. 이렇게 하면 카테터가 통과된 것으로 간주합니다. 혈액이 시린지에 도달하면 1 mL 시린지 근처의 P 50 튜브를 잠그고 시린지를 폐기하십시오.

신선한 헤파린 얼음 식염수가 채워진 새 시린지로 교체하십시오. 튜브의 클램프를 풀고, 새 시린지를 수직으로 세운 상태에서 시린지를 톡톡 쳐서 공기 방울이 라인에서 멀어지도록 위쪽으로 제거하십시오. 카테터 라인에서 혈액이 사라지고 깨끗해질 때까지 헤파린화 식염수를 주입하십시오.

튜브 커플러 바로 아래의 동맥 라인을 클램프로 조입니다. 동맥 카테터 라인에서 시린지 커넥터를 제거하고 스테인리스 스틸 튜브 플러그로 교체합니다. 외부로 연결된 동맥 카테터를 막고 있던 지혈 겸자를 풉니다.

정맥 라인에 대해 이 절차를 반복하십시오. 정맥압이 낮기 때문에 샘플링이 불가능할 수 있습니다. 일반적으로 헤파린 식염수를 최소한의 저항으로 주입할 수 있다면, 카테터가 정맥 내에 적절히 위치했을 가능성이 높습니다.

절차를 시작하기 전에 동물의 무게를 측정하고, 용액을 준비하며, 클램프 장치를 조립해야 합니다. 동물의 무게 측정과 카테터 개통성 확인이 완료되면, 움직임을 제한하되 완전히 구속하지 않는 깔개가 깔린 작은 용기에 동물을 넣습니다. 본 연구에 사용된 쥐는 최소 5시간 동안 금식했으며, 수술 후 체중 증가 요건을 충족했습니다. 쥐의 체중은 여기서 필요한 인슐린의 양을 결정합니다.

kg당 분당 4 mU를 분당 2 µL의 속도로 투여합니다. 50% dextrose 용액을 준비하고, 두 용액 모두 약 2시간 동안 충분히 사용할 수 있는 양인지 확인하십시오. 여기서는 3 mL 주사기를 사용합니다. 이제 클램프 장치를 조립할 준비가 되었습니다.

여기에 보이는 것과 같이 라인과 주입 펌프를 설치하십시오. 포도당 및 인슐린 주사기를 주사기 펌프에 장착하십시오. 라인을 클램프로 잠그고, 실험 시작 전 쥐가 30분 동안 안정을 취하도록 하십시오.

절차를 시작하려면, 기저 인슐린 및 헤마토크릿 샘플을 채취하십시오. 헤마토크릿 샘플링은 실험 전반에 걸쳐 혈액량이 유지되는지 확인하기 위한 것입니다. 일반적으로 헤마토크릿 수치는 초기 값의 10% 이상 감소해서는 안 됩니다. 기저 포도당 샘플을 채취하고 클램핑할 포도당 수치를 결정하십시오.

여기서는 혈당 수치를 5 mM로 유지하는 클램프(clamp)법을 사용합니다. 혈액 샘플을 채취할 때마다 혈전 형성을 방지하기 위해 10 units/mL의 헤파린 식염수를 소량 사용하여 동맥 라인을 세척합니다. 유지할 포도당 수치가 결정되면 인슐린 용액의 주입을 시작합니다.

5~10분 간격으로 혈당을 기록하고, 정상 상태(steady state)에 도달할 때까지 필요에 따라 포도당 주입 속도를 조절하십시오. 이 과정은 일반적으로 시행착오를 통해 이루어지며, 30분에서 2시간 이상 소요될 수 있습니다. 혈당 수준을 유지하는 데 필요한 포도당 양은 실험 프로토콜에 따라 다릅니다.

클램핑된 것으로 간주되기 위해서는 세 번의 연속적인 측정값이 정의된 범위 내에 있어야 합니다. 세 번의 측정값이 서로 약 1 mM 이내일 때, 포도당 수치가 정상 상태 기록에 도달한 것으로 간주합니다. 30분 동안 혈당 수치를 유지하는 데 필요한 포도당 주입률이며, 이 시간 동안 최소한의 추가 혈액 샘플을 얻을 수 있습니다.

클램프 절차가 완료되면 두 번째 혈장 인슐린 헤마토크릿 샘플을 수집해야 합니다. 동물은 추가 테스트에 사용하거나 안락사시킨 후 추가 분석을 위해 조직을 수집할 수 있습니다. 동물에 따라 카테터 라인이 정확하게 삽입되었다면 5~7일 동안 개방 상태를 유지할 수 있습니다.

클램프 기법을 통해 정상 상태의 인슐린 민감도를 측정할 수 있습니다. 인슐린 및 포도당 농도뿐만 아니라 포도당 주입률과 헤마토크릿 수치를 기록하는 것이 필수적입니다. 30분 동안 포도당 농도가 서로 1 mM 이내로 유지될 때 정상 상태에 도달한 것으로 간주합니다.

포도당 주입률은 혈당 수준을 유지하는 데 필요한 외인성 포도당의 양을 나타내며, 가능한 한 단일 평균 시점이 아닌 시간에 따른 변화 그래프로 표시해야 합니다. 공복 및 클램핑 상태의 인슐린 수치를 모두 보고해야 합니다. 이러한 측정값은 인슐린이 성공적으로 투여되었음을 확인해주며, 처치 그룹 간의 인슐린 반응 차이를 감지할 수 있게 합니다. 베이스라인에서 헤마토크릿 수치를 측정하고 실험 절차 후에 다시 측정함으로써, 실험 과정 동안 수치가 베이스라인 대비 5% 이상 감소하지 않았음을 확인합니다.

전신 및 조직 특이적 포도당 이용도를 평가하기 위해 동위원소 추적자 투여와 같은 다른 방법들이 사용될 수 있습니다.