의식 랫에서 인슈린 과다 - Euglycemic 클램프

이 절차의 전반적인 목표는 의식이 있고 구속되지 않은 쥐의 인슐린 민감도를 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 왼쪽 경동맥에 카테터를 삽입합니다. 그다음, 최적의 결과를 보장하기 위해 오른쪽 경정맥에 카테터를 삽입합니다.

수술 후 5일간의 회복 기간 동안 개통성을 유지하기 위해 매일 카테터를 세척합니다. 최종적으로, 전신 포도당 주입률을 나타내는 고인슐린혈증-정상혈당 클램프(hyperinsulinemic euglycemic clamp)를 통해 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 생리학적 인슐린 수준에서 전신 포도당 처리율을 직접 측정할 수 있다는 것입니다.

동맥 및 정맥 카테터는 수술 절차 전에 미리 준비해야 합니다. 카테터의 끝은 뭉툭해야 하며 헤파린 식염수로 채워져 있어야 하고, 에탄올로 멸균해야 합니다. 고정용 비드는 동맥 카테터의 경우 한쪽 끝에서 2.7 cm, 정맥 카테터의 경우 3.2 cm 떨어진 지점에 단단히 부착되어 있어야 합니다. 본 절차에서는 약 300 g의 성체 수컷 Sprague-Dawley 랫트를 사용합니다.

동물의 시작 체중을 기록하고, 이 체중을 이용하여 수술 후 체중 증가량을 모니터링하십시오. 무균 수술 구역에서 작업을 수행합니다. 쥐를 마취 상자에 넣어 3% isof fluorine으로 마취시킵니다.

동물을 수술 구역 밖으로 옮기고 목과 어깨 주변의 털을 제거하여 절개 부위를 준비합니다. 제모가 끝나면, 약 2% isof fluorine으로 마취 상태를 유지하기 위해 동물의 코에 노즈콘을 씌웁니다. 동물을 수술대에 고정합니다.

발 또는 안구 반사가 있는지 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 절개 부위를 70% ethanol로 세척한 후, Betadine으로 문질러 닦고 다시 70% ethanol로 세척합니다. 절차의 첫 번째 단계는 흉골 상단 10 millimeter 지점에 작은 수직 정중선 절개를 만드는 것입니다.

곡선형 미세 해부용 핀셋을 사용하여 조직을 둔성 박리하여 왼쪽 흉골 유양근을 노출시킵니다. 이 근육을 젖혀 왼쪽 경동맥의 약 1cm 구간이 드러나게 합니다. 결합 조직을 조심스럽게 떼어내는 동안 경동맥이 움직이지 않도록 미세 해부용 핀셋을 경동맥 아래에 위치시킵니다.

동맥이나 신경 모두에 손상을 주지 않으면서 미주신경을 동맥으로부터 분리하는 것이 중요합니다. 멸균된 4-0 실크 봉합사를 사용하여 두측 끝단을 결찰하십시오. 톱니 모양의 미세 박리 포셉으로 혈관을 고정하십시오.

결찰 부위를 천자합니다. 21게이지 정맥 주입용 다중 샘플 루어 어댑터(ven eject multis sample lure adapter)를 사용하십시오. 카테터에서 스테인리스 스틸 플러그를 제거하고, 멸균 카테터 도입기를 사용하여 동맥 내로 삽입합니다.

포셉을 사용하여 카테터가 고정되었는지 확인합니다. 미세 해부용 포셉을 놓아 동맥을 클램핑하고, 비드(bead)가 닿을 때까지 카테터를 계속 삽입합니다. 이 시점에서 카테터의 끝은 대동맥궁에 위치해야 합니다.

비드 아래쪽에 두 개의 봉합사를, 위쪽에 한 개의 봉합사를 고정하고, 10 units/mL 헤파린 식염수로 라인을 세척합니다. 카테터의 샘플링 가능 여부를 확인하기 위해 카테터의 외부 끝을 스테인리스강 플러그로 다시 막습니다. 다음으로 조직을 둔성 박리하여 우측 외경정맥을 노출시키고, 정맥을 조심스럽게 분리한 뒤 두정정맥을 결찰합니다.

실크 봉합사로 마무리합니다. 21게이지 정맥 바늘로 정맥을 천자합니다. 멀티 샘플 루어 어댑터를 배출합니다.

카테터에서 스테인리스 스틸 플러그를 제거하고, 멸균 카테터 삽입기를 사용하여 비드까지 삽입합니다. 비드 아래에 두 개의 봉합사를, 비드 위에 한 개의 봉합사를 고정합니다. 그런 다음 10 units/mL 헤파린 얼음 식염수로 라인을 세척합니다.

카테터의 샘플링 가능 여부를 확인하려면, 14 gauge 둔침(blunt needle)을 사용하여 피부 아래로 터널을 만들고 견갑골 사이의 등 부위를 절개한 뒤, 스테인리스 스틸 플러그로 카테터의 외부 끝단을 다시 막습니다. 다음으로, 카테터가 쥐의 등 쪽으로 나올 수 있도록 바늘을 통해 통과시킵니다. 각 카테터가 약 4 cm 정도 보이게 해야 합니다.

Tigon S 50 HL 의료용 튜브를 0.5 centimeters 길이로 자른 후, 외부로 노출된 두 카테터 주변에 배치합니다. 정맥용은 파란색 테이프로, 동맥용은 빨간색 테이프로 고정합니다. 카테터의 개통성을 확인하기 위해 다시 테스트한 다음, 혈전 형성을 방지하기 위해 150 units per milliliter 헤파린 식염수로 플러싱 및 충전합니다.

모든 절개 부위를 3-0 실크 봉합사로 봉합합니다. 쥐를 먹이를 쉽게 섭취할 수 있도록 미리 데워진 깨끗한 케이지의 복와위 상태로 둡니다. 쥐가 완전히 보행 능력을 회복하고 기민해지면 원래의 케이지로 돌려보냅니다.

쥐가 3~5일 동안 회복하도록 하며, 감염, 통증 및 체중 변화를 매일 모니터링합니다. 연구 전반에 걸쳐 카테터의 개통성을 유지하는 것이 중요합니다. 수술 후 매일, 1 mL 슬립 팁 주사기에 150 units/mL 헤파린 식염수를 채우고 22 gauge 둔탁한 바늘로 캡을 씌웁니다.

뭉툭한 바늘을 23 gauge 스테인리스 스틸 튜빙 커플러가 다른 쪽 끝에 달린 20 centimeters의 PE 50 튜빙에 삽입합니다. 라인에서 모든 기포를 반드시 제거하십시오. 지혈鉗(hemostats)를 사용하여 쥐로부터 외부로 연결된 동맥 라인을 플러그 바로 아래 지점에서 집어 고정합니다.

다른 지혈집게를 사용하여 스틸 카테터 플러그를 제거합니다. 시린지가 연결된 튜빙 커플러를 동맥관에 삽입하고, 외부로 노출된 동맥 카테터를 막고 있던 지혈집게를 풉니다. 다음으로, 카테터 내의 동맥혈을 시린지로 흡인합니다.

카테터로 흡입이 잘 되지 않는 경우, 카테터 끝단에 걸린 물질을 제거하기 위해 소량의 용액을 카테터를 통해 매우 부드럽게 밀어 넣어야 할 수도 있습니다. 이렇게 하면 카테터가 소통된 것으로 간주합니다. 혈액이 시린지 클램프에 도달하면 1 mL 시린지 근처의 P 50 튜빙을 잠그고 시린지를 폐기하십시오.

신선한 헤파린 얼음 식염수가 채워진 새 주사기로 교체하십시오. 튜브의 클램프를 풀고, 새 주사기를 수직으로 세운 상태에서 주사기를 톡톡 쳐서 기포를 위쪽으로 제거하여 라인에서 멀어지게 하십시오. 카테터 라인이 깨끗해지고 혈액이 없어질 때까지 헤파린 식염수를 주입하십시오.

튜빙 커플러 바로 아래의 동맥 라인을 클램프로 차단합니다. 동맥 카테터 라인에서 시린지 커넥터를 제거하고 스테인리스 스틸 튜빙 플러그로 교체합니다. 외부로 노출된 동맥 카테터를 폐쇄하고 있던 지혈 집게를 풉니다.

정맥 라인에 대해 이 절차를 반복하십시오. 정맥압이 낮아 샘플 채취가 불가능할 수 있습니다. 일반적으로 헤파린 식염수가 최소한의 저항으로 주입될 수 있다면, 카테터가 정맥 내에 적절하게 위치했을 가능성이 높습니다.

절차를 시작하기 전, 동물의 체중을 측정하고 용액을 준비하며 클램프 장치를 조립해야 합니다. 동물의 체중을 측정하고 카테터의 개통성을 확인한 후, 움직임을 제한하되 완전히 구속하지 않는 베딩이 깔린 작은 용기에 동물을 넣습니다. 본 연구에 사용된 쥐는 최소 5시간 동안 금식하였으며, 수술 후 체중 증가 요건을 충족한 개체들입니다. 쥐의 체중에 따라 여기에 필요한 인슐린의 양이 결정됩니다.

kg당 분당 4 mU를 분당 2 µL의 속도로 투여합니다. 50% dextrose 용액을 준비하고, 두 용액 모두 약 2시간 동안 지속될 수 있는 충분한 양이 있는지 확인하십시오. 여기서는 3 mL 주사기가 사용됩니다. 이제 클램프 장치를 조립할 준비가 되었습니다.

여기에 표시된 것과 같이 라인과 주입 펌프를 설정하십시오. 포도당과 인슐린 시린지를 시린지 펌프에 장착하십시오. 라인을 클램프로 고정하고 실험을 시작하기 전 30분 동안 쥐가 안정을 취하게 하십시오.

절차를 시작하기 위해, 기저 인슐린 및 헤마토크릿 샘플을 채취합니다. 헤마토크릿 샘플링은 실험 전반에 걸쳐 혈액량이 유지되는지 확인하기 위해 수행합니다. 일반적으로 헤마토크릿 수치는 초기 값의 10% 이상 감소해서는 안 됩니다. 기저 포도당 샘플을 채취하고 클램핑할 포도당 수치를 결정합니다.

여기서는 혈당 수치를 5 mM로 일정하게 유지(clamp)합니다. 혈액 샘플을 채취할 때마다 혈전 형성을 방지하기 위해 10 units/mL 헤파린 생리식염수를 소량 사용하여 동맥 라인을 세척하십시오. 유지할 포도당 수치가 결정되면 인슐린 용액의 주입을 시작하십시오.

5~10분 간격으로 혈당을 측정하고, 정상 상태(steady state)에 도달할 때까지 필요에 따라 포도당 주입 속도를 조절합니다. 이 과정은 일반적으로 시행착오를 통해 이루어지며, 30분에서 2시간 이상까지 소요될 수 있습니다. 혈당 수치를 유지하는 데 필요한 포도당의 양은 실험 프로토콜에 따라 다릅니다.

클램프 상태로 간주되기 위해서는 3회의 연속적인 측정값이 정의된 범위 내에 있어야 합니다. 3회의 측정값이 서로 약 1 mM 이내인 경우, 포도당 수치가 정상 상태 기록에 도달했음을 의미합니다. 30분 동안 혈당을 유지하는 데 필요한 포도당 주입률을 측정하며, 이 시간 동안 최소한의 추가 혈액 샘플을 얻을 수 있습니다.

클램프 절차가 완료되면 두 번째 혈장 인슐린 헤마토크릿 샘플을 수집해야 합니다. 동물은 추가 테스트에 사용하거나, 추가 분석을 위해 조직을 수집한 후 안락사시킬 수 있습니다. 적절하게 수행된 경우, 동물의 카테터 라인은 5~7일 동안 개방 상태를 유지할 수 있습니다.

클램프법을 통해 정상 상태의 인슐린 민감도를 측정할 수 있습니다. 인슐린 및 포도당 농도는 물론, 포도당 주입률과 헤마토크리트 수치를 기록하는 것이 필수적입니다. 30분 동안 포도당 농도 차이가 1 mM 이내로 유지될 때 정상 상태에 도달한 것으로 간주합니다.

포도당 주입률은 혈당 수치를 유지하는 데 필요한 외인성 포도당 수준을 나타내며, 가능한 경우 단일 평균 시점이 아닌 시간에 따른 변화 그래프로 나타내어야 합니다. 공복 및 클램프 상태의 인슐린 수준을 모두 보고해야 합니다. 이러한 측정값은 인슐린이 성공적으로 전달되었음을 확인하며, 처리군 간의 인슐린 반응 차이를 감지할 수 있게 합니다. 기저 상태에서 헤마토크릿 수준을 측정하고 실험 절차 후에 다시 측정함으로써, 실험 과정 동안 해당 수치가 기저치의 5% 이상으로 감소하지 않았음을 보장합니다.

전신 및 조직 특이적 포도당 이용도를 평가하기 위해 동위원소 추적자 투여와 같은 다른 방법들이 사용될 수 있습니다.