Name: Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 젤라틴 자이모그래피를 사용하여 기능성 MMP 활성을 검출하는 방법을. 이 실험은 전기영동과 밀도 분석을 통해 세포 배양 상청액이나 체액에서 MMP 활성을 정량화합니다.

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우리는 세포 배양 supernatants에서 MMPs의 농도를 증가 단백질 concentrators의 사용을 제안에 대한 박사 S. 레슬러를 (분자 및 세포 생물학의학과 의학의 베일러 대학) 감사드립니다. 이 프로젝트는 부인이 클리포드 엘더 화이트 그레이엄 둘러 싸인 연구 기금과 CB에 대한 NIH / NIAMS (AR059838)에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. 로딩과 젤 실행 <ol><li> 모든 샘플은 효소의 기능을 유지하기 위해 충분히 준비하고 수집 후 즉시 사용하거나 -80에서 냉동 보관해야 ° C. 샘플 감소 대리인이 없어야합니다 (예 : β - 메르 캅 토 에탄올) 또는 겔로드하기 전에 삶은 수 있습니다. </li><li> 카세트 안에 젤이 들어있는 주머니를 열고, 탈이온수와 카세트를 씻어. <ul><li> 카세트의 바닥과 젤 상단에서 빗에서 보호 테이프를 제거합니다. </li><li> 실행 버퍼 (탈이온수에 1X로 희석)와 우물을 세 번 씻어. </li><li> 미니 셀, 카세트의 작은 면이 안쪽에 직면 있도록에 젤를 놓습니다. 젤 장력 웨지와 장소에 잠금. 미니 셀은 병렬로 하나 또는 두 개의 젤을 실행할 수 있습니다. </li><li> 웰스 해발 1X 실행 버퍼 맨 (내부) 챔버를 기입 어떤 누출이 있는지 확인합니다. 누출의 경우에는 버퍼를 제거하고 젤 조정. </li><li> 1X 실행 버퍼와 하부 챔버 입력합니다. </li></ul></li><li> 물론 하나의 단백질 분자 마커 10 μL를로드합니다. <ul><li> 겔 - 로딩 팁 (각 샘플 사이의 변경)를 사용하여 젤의 우물로 겔 로딩 버퍼 및 샘플과 부하의 동일한 금액을 섞는다. 이러한 웰스는 20 μL 총와 로드할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 미니 셀에 뚜껑을 놓고 전원 공급 장치에 전극 코드를 연결합니다. 에있는 전원 공급 장치 스위치 90 분 동안 지속적인 125 V에서 실행으로 설정합니다. 현재 순환을 나타내는 하단 챔버의 철사에 작은 거품의 형성을 확인합니다. </li><li> 첫 번째 젤을 실행하는 경우, 지표로 읽어 버퍼에 포함된 bromophenol 파란색을 사용하여 마이 그 레이션 매 15 분 진행 상황을 모니터링합니다. 표시기 염료가 젤 하단에 도달할 때까지 겔 실행하자. </li></ol> 2. 젤 Renaturing 및 개발 <ol><li> 각 젤 들어, 탈이온수 모두에 1X renaturing 버퍼와 버퍼를 denaturing 200 ML 100 ML을 준비합니다. </li><li> bromophenol 푸른 추적 염료는 젤 하단에 도달하면, 전원 공급 장치를 끄고 미니 셀을 열고, 그리고 젤을 제거하십시오. 겔 나이프 (또는 무게 주걱)를 사용하여 카세트의 두 측면을 분리합니다. 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리를 잘라. </li><li> 조심스럽게 100 ML renaturing 버퍼와 함께 용기에 카세트와 장소에서 젤을 제거하십시오. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> renaturing 버퍼를 제거하고 젤로 버퍼를 개발 100 ML를 추가합니다. 부드러운 교반과 실온에서 30 분 알을 품다. </li><li> 개발 버퍼를 제거하고 겔을 개발하여 버퍼의 100 ML 더 추가합니다. 37 (16~18시간) 밤새 품어 ° C. </li><li> 개발 버퍼를 제거하고 실온에서 부드럽게 교반 하에서 탈이온수로 세 번 (5 분 각각) 헹굼. </li><li> 그들은 겔 얼룩 후 작거나 보이지 않는가 될로서 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장하는 젤 스캔. </li><li> 겔에 SimplyBlue Safestain 20 ML을 추가하여 겔 스테인. 부드러운 교반하에 실온에서 1 시간 품어. </li><li> SimplyBlue SafeStain 부드러운 선동에 따라 실내 온도에 한 시간 동안 100 ML 이상의 탈이온수에 드 얼룩 젤을 제거합니다. </li><li> 보다 나은 결과를 위해 부드러운 교반에 따라 상온에서 한 시간 이상 신선한 탈이온수과 부화로 바꿉니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 조심스럽게 플라스틱 시트 보호대에 물과 장소에서 젤을 제거하십시오. </li><li> 300 DPI 이상의 해상도로 젤을 검사합니다. TIFF 형식 (그림 1A)에서 이미지를 저장합니다. </li><li> ImageJ (또는 다른 유사한 소프트웨어)와 함께 밴드 농도를 측정. <ul><li> ImageJ (그림 1A)에서 TIFF 파일을 엽니다. </li><li> 선택하여 흑백의 시각화 '이미지를&gt; 입력&gt; 8 비트 "(그림 1B). </li><li> 적어도 두 번 이상은 (이 소프트웨어 요구 사항입니다)보다 넓은 사각형을 그리기, 처음 밴드를 대략적으로 사각형 선택 도구를 사용하십시오. </li><li> "1"을 누르거나 "분석&gt; 젤&gt; 선택 피르스트 레인 '과 밴드가 설명됩니다를 선택합니다. </li><li> 새로운 사각형이 나타납니다 다음 밴드로 이동하고 "분석&gt; 젤&gt; 선택 옆에있는 차선 '을 선택합니다. 모든 밴드는 (그림 1B)을 선택 때까지 반복합니다. </li><li> "3"을 누르거나 각 밴드 (그림 1C)에 대한 프로필 계획을 생성하기 위해 "분석&gt; 젤&gt; 플롯 차선"를 선택하십시오. </li><li> 관심의 정상은 완전히 밀폐된 공간되도록 기본 라인을 그릴 수있는 직선을 선택 (이미 자동으로 선택한다)를 사용합니다. </li><li> 지팡이 도구를 선택하고 그것을 선택 각각의 최대 내부를 클릭하십시오. </li><li> 선택한 각 피크에 대한 영역 테이블을 얻기 위해 "분석&gt; 젤&gt; 라벨 봉우리"를 선택하십시오. 이러한 데이터는 (F 같은 꾸몄다 수 있습니다igure의 1D) 또는이 선택한 밴드의 가치에 정상화 수 있습니다. 결과 통계적 중요성을 결정하기 위해 여러 복제 젤에서 값을 풀링 때 정상화가 특히 중요합니다. </li></ul></li></ol> 4. 대표 결과 우리는 MMP - 2 (그림 1A)의 다른 금액을 포함하는 다양한 세포 배양 supernatants와 함께 로드된 11 우물로 젤을 보여줍니다. 이 젤의 직접 관찰이 우물의 일부 사이 MMP - 2 농도에서 확실한 차이를 보여줍니다. 예를 들어, 우물 # 4와 5는 훨씬 더 MMP - 2 잘 # 11 또는 # 10 잘보다가 포함되어있다는 사실을 분명하다. 밴드의 객관적인 부량을 위해 우리는 잘 # 11 우물 # 4, 5 및 약 2 배 차이 MMP - 2 금액의 약 4 배 차이를 확인, ImageJ 소프트웨어 (그림 1B - D)와 densitometry를 사용했습니다 잘 # 10 우물 # 4와 5 사이에서 MMP - 2 정도입니다. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 젤라틴 zymography에 의해 MMP - 2의 감지. 젤라틴의 젤, 스캔한 이미지. 그럼 숫자가 젤 상단에 표시됩니다. B 같은 젤처럼 검정과 densitometry를 위해 흰색 표시됩니다. 각 밴드는 ImageJ에 사각형과 함께 선정되었다. C,에 표시된 겔에 대한 densitometry 프로파일의 두 가지 예로 A와 B (밴드 # 4와 # 11). 직선은 닫힌 영역을 만들려면 각 피크의 기지에 그립습니다. D, 밴드 # 1의 밀도에 A와 B 전 (왼쪽) 후 (오른쪽) 정상화에 표시된 젤에 대한 피크 영역의 플롯. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2.이 그림은 zymography가 세미 양적 기술로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리는 7 연속 우물의 시리얼 dilutions을 (1:1 dilutions의 단계)로드 및 프로 MMP - 2와 MMP - 2 모두에 대한 밴드의 밀도를 측정했습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2의 zymographic 분석을 수행하는 방법을 증명하고있다. 젤에 로드할 샘플의 양은 경험적으로 관심의 기원과 MMP에 따라 결정되어야합니다. 단백 분해 효소가 밴드의 영역에서 소화 수있는 너무 많은 기판이 그대로 너무 로딩하는 동안 거의 감지하지 않도록 할 수도로드하면 채도가 발생할 수 있습니다. 필요한 경우, 샘플은 이전에 읽어 버퍼 또는 개발 시간과 믹싱에 탈이온수에 희석 수있는 데 4 시간이 하루에서 단축하실 수 있습니다. 그것은 concentrators (예 : Millipore 카탈로그 # UFC803024)를 사용하여 솔루션에 단백질을 집중하는 것도 가능합니다. 밴드가 겨우 보이는 남아있다면, 그것도 최대 48 시간, 시간의 긴 기간 동안 젤을 개발해야 할 수도 있습니다. 조직 문화 supernatants에서 샘플을 비교할 때, 그것은 태아 소 혈청 (및 기타 세라)가 결과에 영향을 미칠 수 MMPs를 포함 것을인지해야합니다. 이러한 이유로, 우리는 혈청이없는 배지에서 문화 이후 우리 supernatants 모두 수집합니다. 프로토콜의 단락 2.9 및 2.10에 명시된 세척은 소화 밴드의 얼룩 배경을 제거하기 위해 필요합니다. 더 이상 세척 시간은 젤 내내 기판의 얼룩 더 많은 배경을 제거 하겠지만도 희미합니다. 이상 세척 시간이 필요하는 경우, 우리는 최고의 명암으로 스캔을 선택 젤 매일 몇 시간을 스캔하는 것이 좋습니다. 이 기술은 다른 MMPs를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 젤라틴들이 선호하는 기판이 아니므로 예를 들어, MMP - 9는 낮은 정도 MMP - 1, MMP - 8과 MMP - 13 또한 젤라틴 젤에 대한 감지, 그리고 수 있습니다. 카제인은 MMP - 11에 대한 선호하는 기판이며, 또한 MMP - 1의 탐지, MMP - 3, MMP - 7, MMP - 12 및 MMP - 13을 허용하면서 MMP - 1과 MMP - 13은 최고의 콜라겐 zymography에 감지 9. MMP - 7 (matrilysin)와 collagenases (MMP - 1과 MMP - 13) 때 카제인이나 젤라틴 젤 낮은 수준에서 현재 감지하기가 어렵습니다. 겔 로딩 시간에 샘플로 헤파린의 또한 MMP - 7에 대한 검색 제한을 대폭 향상시킵니다. MMP - 1과 MMP - 13의 경우, 헤파린은 전기 실행이 방법은 12 세 미만 이미 후 겔에 추가되어야합니다. zymography이 효소의 변성 및 renaturation 후 효소 활동을 측정 때문에, 그것은 샘플에있는 모든 MMPs의 활동을 측정합니다. 이것은 효소, 프로 효소, 그리고 내생 억제제 (예 : 팀프 - 2)에 바운드 효소를 포함합니다. 그것은 활성 효소의 밴드 밀도를 비교하여하고 약간 높은 분자량을 가지고되는, 프로 효소의의 예제에서 MMP 활성화 수준을 결정하는 그러나이 가능합니다. Zymography은 종종 MMP을 확인하기에 충분하지 않습니다. 알려진 분자량 표준 MMP의 마이 그 레이션 수준의 비교는 식별에 도움이 되나요하지만 이러한 표준의 일부가 감소 요원을 포함하고 비 절감 조건에서 사용할 때 그들이 9 가지 분자 무게를 나타낼 수 있다고 언급한다. 옵션은 테스트 샘플과 같은 겔에 가용성 재조합 MMP를 로드할 수 있습니다. MMPs는 그러나 겉보기 분자량의 변화를 유도, 다른 단백질에 연결되어있을 수 있습니다. 선택적 MMP 억제제는 interest.A 초 기술 (웨스턴 블롯, immunocytochemistry, 또는 엘리사)의 MMP가하는 것이 좋습니다 정체성에 약리 도구로 개발 버퍼에 부화 중에 젤 (또는 반 젤 컷의 일부)에 추가할 수 있습니다 관심 MMP의 식별에 도움이됩니다. 그것은 서양 Blots에 대한 검색 제한이 기​​술을 사용하면 잠재적으로 거짓 - 부정적인 결과로 이어지는, 자주 zymographic 젤보다 훨씬 낮은 것을 지적해야합니다.

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE 마크 전기영동 장치</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치 (모델 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% gelatin zymogram gel, 1.0 mm, 12 wells</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice 겔 로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 팁</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분자량 표준물질</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine-SDS 러닝 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram 재성질화 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram 발색 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 포토 스캐너</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>W. Rasband, NIH/NIMH 저술</td></tr></tbody></table>

zymography의 기능 매트릭스 metalloproteinases의 감지

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

매트릭스 metalloproteinases (MMPs)는 아연 함유 endopeptidases 있습니다. 그들은 펩티드 채권 절단하여 단백질을 저하. 더보기보다 20 MMPs가 확인된과 구조와 기판 특이성 (collagenases, gelatinases, 멤브레인 타입 [MT - MMP] stromelysins, matrilysins, 등)에 따라 여섯 그룹으로 구분됩니다. MMPs는 세포 침공, 연골 저하, 조직 리모델링, 상처 치유, 그리고 embryogenesis에 중요한 역할을한다. 그들은 따라서 두 정상 프로세스 및 류마티스 관절염, 암, 또는 만성 폐쇄 폐 질환 1-6 많은 질병의 pathogenesis에 참여합니다. 여기서는 MMP - 2 (gelatinase A, 유형 IV collagenase), MMP 널리 표현에 초점을 맞출 것이다. 우리는 zymography 먼저 C. Heussen 및 EB 다우 70-10에 의해 1980 년에 설명 일반적으로 사용되는 매우 민감한 아직 단순하고, 기술에 의해 세포 배양 supernatants에서 MMP - 2를 검출하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 기술 세미 양적이며, 그것은 따라서 재조합 MMP 알려진 농도가 같은 겔 11 로드할 때 테스트 샘플에서 MMP 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 그리고 젤라틴 (MMP - 2 기판), MMPs (예 : 세포 배양 supernatants, 소변, 또는 혈청)이있는 솔루션은 나트륨 dodecyl 황산염 (단백질 linearize하는 SDS)를 포함하는 polyacrylamide 젤에로드됩니다. 샘플 버퍼 (겔 로딩을 촉진하기) 샘플 점도를 높이기 위해 만들어진 것입니다, 추적 염료 (bromophenol 파란색, 샘플 마이 그 레이션을 모니터)를 제공 denaturing 분자를 (단백질 linearize)을 제공하고, 샘플의 산도를 제어합니다. 단백질은 다음 일정 마이 그 레이션 속도를 제공하기위한 실행 버퍼의 전류에 따라 마이 그 레이션하는 것이 허용됩니다. 이주의 거리는 반대로 단백질의 분자량 (작은 단백질이 큰 단백질은보다 젤을 통해 신속하게 이동하고 따라서 젤 아래 추가로 마이 그 레이션)와 상관 있습니다. 마이 그 레이션 후, 젤은 단백질이 효소 활동에 필요한 자신의 차 구조를, 다시 수 있도록 renaturing 버퍼에 배치됩니다. 젤은 다음 프로 테아제는 기판을 소화 수 있도록 설계된 개발 버퍼에 배치됩니다. 개발 버퍼는 또한 활성화된 MMPs에 비 proteolytic 프로 MMPs를 활성화하기 위해 P - aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA)가 포함되어 있습니다. 다음 단계는 기판 (우리의 예제에서는 젤라틴) 염색법으로 구성되어 있습니다. 겔에서 여분의 염료를 세척 후, 테아제 소화 영역은 분명 밴드로 나타납니다. 명확하게 밴드가 더 집중 프로 테아제는가 포함되어 있습니다. 밴드 얼룩 강도는 다음 샘플 비교 있도록 같은 ImageJ 같은 소프트웨어를 사용, densitometry에 의해 결정하실 수 있습니다.

이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinases, MMPs)는 아연을 함유한 엔도펩티다제입니다. 이들은 펩타이드 결합을 절단함으로써 단백질을 분해합니다. 20종 이상의 MMP가 ...

이 절차의 전반적인 목표는 기능성 매트릭스 메탈로프로테이나아제를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 환원제가 없는 로딩 버퍼를 추가하여 샘플을 준비함으로써 달성됩니다. 그 다음 젤라틴 Zymography 젤에 샘플을 로딩하고 추적 염료가 젤 끝에 도달할 때까지 전기영동을 수행합니다.전기영동 후, 겔을 재천연화(renature), 현상, 염색 및 탈색합니다. 절차의 마지막 단계는 데이터 분석을 위해 겔을 스캔하는 것입니다. 최종적으로 밴드 밀도 분석을 통해 시료 내 matrix metalloproteinase의 활성을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 LER 의과대학 분자 생리 및 생물물리학과의 Kristin bitten 박사 연구실 소속입니다. 오늘은 zymography를 이용한 matrix metalloproteinase 검출 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 배양된 일차 세포에서 분비되는 matrix metalloproteinase를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 학습을 시작해 보겠습니다. 본 프로토콜을 시작하기 전에, 효소의 기능을 유지할 수 있도록 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, MMPs)를 적절히 준비하십시오. 샘플은 즉시 사용하거나 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.여기서는 gelatinase A 또는 4형 collagenase로도 알려진 MMP-2를 사용하여 zymography를 통한 MMP 활성 시각화를 보여줍니다. MMP 효소가 준비되면, 카세트 내부에 겔이 들어 있는 10% gelatin zymogram 겔 파우치를 준비하십시오. 카세트를 탈이온수로 헹굽니다.카세트 바닥의 보호 테이프와 겔 상단의 콤을 제거합니다. 웰을 tris glycine SDS 러닝 버퍼로 3회 헹굽니다.카세트의 작은 면이 안쪽을 향하도록 하여 겔을 미니 세포 전기영동 장치에 배치합니다. 겔 텐션 웨지(gel tension wedge)를 사용하여 겔을 고정합니다. 장치의 상단 챔버에 웰의 높이보다 높게 tris glycine SDS 러닝 버퍼를 채우고 누출 여부를 확인합니다.겔 전기영동 장치의 하단 챔버에도 러닝 버퍼를 채웁니다. 그다음 단백질 분자량 마커 10 µL를 로딩합니다. 환원제가 포함되지 않은 겔 로딩 버퍼와 샘플을 동일한 양으로 혼합합니다.일반적인 SDS page와 달리, 샘플을 가열하지 말고 겔의 웰에 직접 로딩하십시오. 겔 로딩 팁을 사용하면 각 웰에 최대 20 microliters의 부피를 넣을 수 있습니다. 미니 셀의 덮개를 닫고 전극 코드를 전원 공급 장치에 연결하십시오.전원 공급 장치를 켜고 젤을 125V 정전압에서 90분 동안 가동하도록 설정하십시오. 첫 번째 젤을 가동할 때, 하단 챔버의 전극 와이어에 작은 기포가 형성되는지 확인하여 전류가 순환하고 있는지 파악하십시오. 각 젤의 로딩 버퍼에 포함된 브로모페놀 블루(bromo phenol blue)를 지시약으로 사용하여 15분마다 이동 진행 상황을 모니터링하십시오.탈이온수를 사용하여 1배 농도의 xmo g Rena 완충액 100 mL와 xmo g 현상 완충액 200 mL를 조제합니다. 브로모페놀 블루(bromo phenol blue) 추적 염료가 겔 바닥에 도달하면 전원 공급 장치를 끕니다. 미니 셀을 열고 겔을 꺼냅니다.카세트의 양측면을 분리합니다. 젤 나이프를 사용하여 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리 부분을 자릅니다. 카세트에서 젤을 조심스럽게 꺼내 100 milliliters의 Rena Buffer가 담긴 용기에 넣습니다.실온에서 완만하게 흔들어주며 겔을 30분 동안 배양하고, Rena 버퍼를 제거한 뒤 현색 버퍼 100 milliliters를 겔에 첨가합니다. 실온에서 완만하게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 현색 버퍼를 제거하고 신선한 현색 버퍼 100 milliliters를 겔에 추가로 첨가합니다.겔을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 발색 완충액을 제거하고 탈이온수와 함께 부드럽게 흔들어 겔을 세척합니다. 실온에서 5분 동안 이 세척 과정을 두 번 반복합니다.겔을 플라스틱 시트 보호기에 넣고 기포를 제거합니다. 그런 다음 사진 스캐너로 겔을 스캔하여 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장하십시오. 겔 염색 후에는 이 밴드들이 거의 보이지 않게 되기 때문입니다.Simply blue safe stain 20 milliliters를 겔에 넣어 염색합니다. 실온에서 1시간 동안 겔을 배양합니다. 부드럽게 흔들어주며 simply blue safe stain을 제거하고, 실온에서 100 milliliters의 탈이온수에 겔을 넣어 부드럽게 흔들며 탈색합니다.1시간 후, 신선한 탈이온수로 교체하고 겔을 최소 1시간 동안 더 배양합니다. 사이토메트리를 이용하여 데이터를 분석하려면 먼저 겔을 물에서 조심스럽게 꺼내 플라스틱 시트 보호지에 넣습니다. 포토 스캐너를 사용하여 300 dpi 이상의 해상도로 겔을 스캔합니다.이미지를 TIFF 형식으로 저장하십시오. 밴드 강도를 측정하기 위해 Image J 또는 유사한 정량 분석 소프트웨어에서 TIFF 파일을 엽니다. 이미지 유형을 8비트로 선택하여 이미지를 흑백으로 시각화하십시오.직사각형 선택 도구를 사용하여 첫 번째 밴드의 외곽을 그리되, 가로 길이보다 세로 길이가 최소 두 배 이상 긴 직사각형을 그립니다. 젤 분석(analyze gels)을 선택합니다. 첫 번째 레인(first lane)을 선택하면 해당 밴드가 선택됩니다.그러면 새로운 직사각형이 나타납니다. 이를 다음 밴드로 이동시킨 후 Analyze gels를 선택하고, next lane을 선택하십시오. 모든 밴드가 선택될 때까지 이 과정을 반복합니다.각 밴드의 프로파일 플롯을 생성하려면 analyze gels plot lanes를 선택하십시오. 직선 선택 도구를 사용하여 관심 피크가 완전히 둘러싸인 영역이 되도록 베이스라인을 그리십시오. 마술봉 도구를 선택하고 각 피크 내부를 클릭하여 선택하십시오.각 선택된 피크의 면적이 포함된 표를 얻으려면 analyze gels label peaks를 선택하십시오. 이 데이터는 그대로 도식화하거나 선택한 밴드의 값으로 정규화할 수 있습니다. 이러한 정규화는 결과의 통계적 유의성을 결정하기 위해 여러 반복 젤의 값을 통합할 때 특히 중요합니다.여기에 표시된 겔의 각 웰에는 서로 다른 세포 배양액이 로딩되었습니다. 서로 다른 양의 MMP two가 포함된 상청액입니다. 이 겔을 직접 관찰하면 일부 웰 사이의 MMP two 농도에 분명한 차이가 있음을 알 수 있습니다.예를 들어, 밴드의 객관적인 정량화를 위해 4번과 5번 웰이 10번과 11번 웰보다 훨씬 더 많은 MMP two를 포함하고 있음이 분명합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 밀도 분석(Dense cytometry)을 수행하였습니다. 이 소프트웨어를 통해 mmp의 양이 약 4배 차이가 남을 확인하였습니다.11번 웰과 4, 5번 웰 사이에 두 배의 양 차이가 있습니다. 마찬가지로, 10번 웰과 4, 5번 웰 사이에서도 MMP two 양의 두 배 차이가 관찰되었습니다. 저희는 지금 기능적 지표를 검출하는 방법을 보여드리고 있습니다.금속 지속성은 xog에 의해 결정됩니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플을 끓이지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 겔에서 밴드를 확인할 수 없습니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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여기, 프로토콜 캡슐화 및 poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels fluorogenic 매트릭스 metalloproteinase (MMP)와 기능성된에 세포 배양에 대 한 제시는-분해 펩 티 드. 세포질 MMP와 대사 활동 표준 microplate 리더를 사용 하 여 하이드로 겔 문화에서 직접 측정 됩니다.

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박테리아 젤라티나제의 원스텝 추출 및 자이모그래피 분석

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