Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

본 비디오 프로토콜의 목적은 뉴로스피어 분석법(neurosphere assay)을 사용하여 마우스 배아 뇌에서 신경 줄기세포를 분리하고 증식시키는 것입니다. 실험 절차에는 E 14 마우스 배아 수확, 신경절 융기(ganglionic eminences) 수확을 위한 뇌 미세 절제, 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 수확 조직의 해리, 그리고 마지막으로 뉴로스피어 배양 접시에 세포를 플레이팅하는 과정이 포함됩니다. 안녕하세요, 저는 플로리다 대학교 마이트 뇌 연구소(Mite Brain Institute)의 Brent Frennels 박사 연구실 소속 Hassan Ali입니다.

오늘은 뉴로스피어 분석법(neurosphere assay)을 이용하여 생쥐 배아 뇌로부터 뉴로스피어 배양을 구축하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 신경 줄기세포를 분리하고 증식시키기 위해 이 분석법을 일상적으로 사용하고 있습니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

교배된 임신 쥐를 마취합니다. 임신 14일째에 경추 탈구를 수행하고 복부를 70% ethanol로 헹굽니다. 큰 포셉을 사용하여 복부 피부를 잡은 다음, 큰 가위로 피부와 그 아래의 근막을 절개합니다.

복강과 자궁각을 노출시키기 위해, 배아가 포함된 자궁각을 제거하여 차가운 HEM이 담긴 50 ml conical tube로 옮깁니다. 자궁 조직을 PC two hood로 옮긴 후, 50 ml tube에서 HEM을 제거하고 신선하고 차가운 HEM을 충분한 양으로 사용하여 혈액이나 털과 같은 오염 물질을 제거하도록 조직을 헹구며, 이 과정을 2~3회 반복합니다. 이후 자궁 조직을 차가운 HEM이 담긴 10 centimeter Petri dish로 옮깁니다.

작은 곡선 핀셋과 가위를 사용하여 자궁각을 열고 배아를 차가운 hem이 담긴 새 디쉬로 옮깁니다. 모든 배아를 수집할 때까지 이 과정을 반복합니다. 그 후 배아를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

배아의 머리를 경추 척수 수준에서 분리하여 차가운 hem이 들어 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다. 미세 곡선 핀셋으로 머리를 잡고 미세 가위를 사용합니다. 먼저 코 윗부분을 가로로 절개한 다음, 이마에서 머리 뒤쪽 방향으로 정중선을 따라 계속 절개합니다.

피부와 두개골을 절개하되, 그 아래의 뇌가 손상되지 않도록 주의하십시오. 곡선 핀셋을 사용하여 절개된 단면의 가장자리를 뒤쪽 방향으로 밀어내어 두개골에서 뇌를 분리하십시오. 모든 두개골에서 뇌가 제거될 때까지 이 과정을 반복하십시오.

곡선 핀셋을 사용하여 뇌의 등쪽 면이 위를 향하도록 안정적으로 고정한 다음, 미세 가위로 각 반구의 후각구부터 반구 뒷부분까지 피질을 절개합니다. 신경절 융기를 노출시키기 위해 뇌를 제자리에 고정한 상태에서, 45도 각도 핀셋으로 신경절 융기 전체를 박리하여 다른 페트리 접시에 옮깁니다. 여기에서 내측 및 외측 부위가 포함된 신경절 융기의 모습이 명확하게 나타납니다.

또는, 미세 핀셋을 사용하여 주변 조직을 제거함으로써 신경절 융기를 분리할 수 있습니다. 두 영역 중 어느 한 곳에서 세포를 배양하고자 하는 경우, 융기 전체를 내측과 외측 절반으로 자를 수도 있습니다.

모든 뇌 조직의 미세 절제가 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 1 mL의 신경 줄기세포 배지를 사용하여 조직 조각들을 수집하고 이를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 조직이 누락되지 않도록 15 mL 튜브 내에서 조직 덩어리들이 가라앉을 때까지 기다립니다.

상층액 배지를 일부 제거하고 페트리 접시 바닥을 세척하여 남아 있는 조직을 15 ml 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁을 튜브 바닥에 댄 후, 현탁액을 3~4회 피펫팅하여 조직을 분쇄함으로써 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

그런 다음 현탁액을 1분 동안 방치하여 결합되지 않은 덩어리들이 침전되도록 한 후, 세포 현탁액의 거의 전체를 다른 15 ml 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 남은 덩어리들에 신경 줄기세포 배지 1 ml를 첨가하여 단일 세포로 해리시킵니다. 튜브의 내용물을 회수합니다.

그 다음 현탁액을 700 RPM 또는 110 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 1 mL의 완전 신경줄기세포 배지에 다시 현탁합니다. 세포 현탁액 10 µL를 취하여 90 µL의 trypan blue와 잘 섞습니다.

그런 다음 이 현탁액 10 µL를 취해 혈구계수기(hemocytometer)로 옮깁니다. 세포 수를 측정합니다. T 80 플라스크 하나에 분주하기 위해, 총 20 mL의 완전 신경줄기세포 배지를 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

그 다음 세포 현탁액을 혼합하고, 밀리리터당 200,000 cells 또는 T 80 플라스크당 4 million cells의 총 밀도가 되도록 적절한 양의 세포를 추가합니다. 최종 농도가 20 nanograms per milliliter가 되도록 EGF를 첨가합니다. 성장 인자가 포함된 완전 신경 줄기세포 배지 내의 세포들을 혼합한 후, 세포 현탁액을 T 80 플라스크로 옮깁니다.

플라스크에 라벨을 붙이고 현미경으로 세포를 관찰하여 조직 덩어리 없이 단일 세포 현탁액 상태인지 확인하십시오. 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에 넣고 5~7일 동안 배양하십시오. 5~7일 후, 현미경으로 플라스크 내 상태를 평가하십시오.

이 시점이 되면 뉴로스피어(neurospheres)가 형성되어 직경이 150에서 200 microns 사이가 되며, 계대 배양할 준비가 됩니다. 플라스크의 내용물을 적절한 크기의 멸균 조직 배양 튜브에 수집하고, 튜브를 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 구체들을 1 mL의 예열된 trypsin에 재현탁하고, 튜브를 37 °C 항온 수조에 2분 동안 둡니다.

그 후, 트립신 활성을 중단시키기 위해 동일한 부피의 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 첨가하고 부드럽게 잘 섞어줍니다. 다시 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음 세포를 1 mL의 완전 신경줄기세포 배지에 재현탁하고, 앞서 언급한 방식대로 세포 수를 측정합니다. T 175 플라스크 하나에 분주하기 위해, 총 40 mL의 완전 신경줄기세포 배지를 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 세포를 혼합하고, M flask당 50,000 cells 또는 T 1 75 flask당 2 million cells의 총 밀도가 되도록 적절한 양의 세포를 추가합니다. 이어서 EGF를 최종 농도 20 nanograms per mil이 되도록 첨가합니다. 성장 인자가 포함된 완전 신경 줄기 세포 배지 내의 세포들을 혼합하고, 세포 현탁액을 T 1 75 flask로 옮깁니다.

플라스크에 라벨을 부착하고 인큐베이터로 옮겨 5~7일 동안 배양합니다. 이는 일차 E 14 신경줄기세포 배양의 예시입니다. 플레이팅 3일 후, 화살표는 증식 중인 신경줄기세포 클러스터를 나타냅니다.

기질에 부착되어 분화된 세포들도 확인할 수 있습니다. 이는 플레이팅 7일 후의 primary E 14 신경 줄기세포 배양 예시입니다. 보시는 바와 같이 다양한 크기의 구체들이 형성되어 있습니다.

분화된 세포들도 존재합니다. 잔해물의 양은 성체 신경구 1차 배양물보다 훨씬 적습니다. 또한, 구체들이 응축되지 않고 주변부에 미세 돌기(micro spikes)가 형성되어 있어, 구체들이 건강하고 생존 능력이 있음을 나타냅니다.

구체가 너무 크게 자라지 않도록 해야 하는데, 중심부의 세포 사멸로 인해 색이 어둡게 변할 수 있기 때문입니다. 또한 구체가 커지면 기질에 부착되어 분화할 수 있습니다. 이것은 플레이팅 5일 후의 계대 1회 E 14 신경구(neurospheres)의 예시입니다.

여기서 다시 구체의 주변부에 있는 마이크로 스파이크(micro Spikes)를 확인할 수 있습니다. 지금까지 여기에 설명된 것과 동일한 절차에 따라 E 14 생쥐의 신경절 융기(ganglionic eminences)로부터 신경구(neurospheres)를 배양하는 방법을 보여드렸습니다. 피질(cortex)이나 중뇌(mesencephalon)와 같은 뇌의 다른 부위에서도 신경구를 배양할 수 있습니다.

시청해주셔서 감사합니다. 신경구 배양 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.