진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

nanoparticles의 세포 biodistribution을 평가하는 데 사용 Bioimaging 방법은 nanoformulated 화합물의 치료 및 진단 모니터링에 적용할 수 있습니다. histological coregistration에 의해 평가하면 여기에 설명된 방법은 민감하고 구체적인 수 있습니다. 방법은 설치류에서 인간의 응용 프로그램에 translational 경로를 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 자기 표지 또는 약물 제형 나노 입자의 분포를 이미지화하고 치료 효능을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 입자를 제조하고, 실험실 모델 시스템에서 세포 흡수를 위한 생물학적 특성을 테스트한 다음, 세포가 함유된 제형을 주입하고 생체 이미징을 통해 조직 분포를 평가함으로써 수행됩니다. 영향을 받은 뇌 영역은 바이러스에 감염된 단핵구 유래 대식세포의 주입 전과 후를 시각화했습니다.

절차의 두 번째 단계는 세포가 함유된 나노입자, 자기적으로 표지된 나노입자 또는 치료용 나노입자를 포함하는 뇌 하위 영역을 이미지화하는 것입니다. 이것은 자기적으로 표지된 나노 입자 또는 나노 제형 약물을 포함하는 세포를 주입한 후 다양한 시간에 수행됩니다. 절차의 세 번째 단계는 나노 입자, 생체 내 분포 및 세포 변화에 대한 종말점 조직학적 분석을 수행하는 것입니다.

이미징 결과의 공동 정합은 조직학을 통해 이루어집니다. 절차의 마지막 단계는 나노 입자의 생체 분포를 정량화 및 표시하고, 분광 이상을 결정하고, 세포 주입 배치 후 시간의 함수로 확산 텐서 이상을 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 조직학적 분석에 공용등록된 자기공명영상(MRI) 및 분광학을 통한 치료 및 진단적 나노물질 치료의 결과로 발생하는 뇌 화학 및 세포 형태에 미치는 생체 분포 및 효과를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 네브래스카 대학교 메디컬 센터의 바이오이미징 프로그램 책임자인 마이클 보스카 박사입니다. 이 연구는 제 연구실과 Howard Gendelman 박사의 연구실 간의 지속적인 협력의 일부입니다. 컨포칼 현미경 검사, 형광 나노 입자와 같이 일반적으로 사용되는 방법에 비해 비침습적 이미징의 주요 장점은 단일 검사로 전체 뇌를 다룰 수 있고 동일한 동물에 대한 종단 연구가 가능하다는 것입니다.

이를 통해 생물학적 변동성이 줄어들고, 더 적은 수의 동물이 필요하며, 많은 경우 인간이 사용할 수 있도록 변환할 수 있습니다. 이 방법은 생체 분포 약동학 프로필 및 치료 효능을 포함하여 새로 파생된 나노 입자와 관련된 주요 문제에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 조직학적 공동 등록과 결합된 강력한 이미징 절차의 조합은 독특하며 이러한 절차를 입증하는 질병의 복잡한 동물 모델에서 시간 분해 바이오 분포 및 약물 효능 연구를 수행하는 데 필요하며, 이러한 절차를 입증하는 것은 제 실험실의 기술자인 Lindsey와 Melissa 및 박사 후 연구원 Dr.P.They가 실험실에서 동물의 이미징 데이터를 수집하는 책임이 있습니다.

Aaron과 Mariano는 확산 텐서 이미징 및 조직학적 공동 정합을 포함한 이미지 처리를 담당하고 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 하워드 델먼 박사이고 네브래스카 대학교 메디컬 센터의 캐롤 슈워츠 신흥 신경과학 연구소 소장입니다. Basca 박사 및 그의 실험실과의 이러한 학제 간 협력은 다양한 신경 퇴행성 질환의 치료 및 진단에 광범위한 영향을 미칩니다.

자기 상주 분광법(magnetic resident spectroscopy) 및 확산 테너 이미징(diffusion tenor imaging) 이상은 질병 중 신경 세포 및 신경 돌기 손상을 모니터링하는 데 사용됩니다. 현재 프로젝트의 경우, 이 방법은 전신 약물 분포 및 신경계에 대한 치료 효능과 같은 나노 약물의 생체 내 분포 효능에 대한 통찰력을 제공합니다. 질병 중 세포 분포 감지를 개선하고 입자 크기, 코팅 및 전하의 변경을 포함할 수 있는 다양한 입자 제조 기술이 개발되고 있습니다.

이 모든 것은 우리 연구소 내에서 활발한 연구 영역으로 남을 것입니다. 첫째, 약물 전달 및 생체 내 분배를 위한 나노 물질을 준비해야 하며, 이는 이번 호의 병렬 원고 주제입니다. 먼저, 적절한 계면활성제로 코팅하기 전에 약물 코어 또는 액적을 동일한 크기의 입자 또는 분쇄된 초상자성 산화철 조각으로 교체하여 생체 내 사용을 위한 후보 나노 제형을 복제합니다.

그런 다음 크기, 전하 모양 및 세포 독성을 측정하여 SPIO 모델 시스템이 후보 나노 제형 약물과 동일한 특성을 갖는지 여부를 확인합니다. 마지막으로, 한천 겔에 현탁된 세포로 구성된 팬텀을 사용하여 세포 내 활성을 결정하기 위해 후보 SPIO 모델 나노 제형으로 배양하여 세포 내 활성을 측정하여 세포 내 SPIO 흡수로 인한 활성을 정량화하기 위해 팬텀을 일련의 농도로 3회 준비해야 합니다. 이는 감도 지수를 제공하고 나노 제형이 산화 상태에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정하여 자기 공명 이미징 스캔에서 SPIO의 가시성을 결정합니다.

스캔하기 전에 마취 가스가 미리 채워진 마취실에 동물을 넣습니다. 이렇게 하면 마취 시작 속도가 빨라지고 동물이 챔버에서 꺼낼 때 깨어나지 않도록 하는 데 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 완전히 마취되면 챔버에서 동물을 꺼내 호흡 속도와 온도를 모니터링할 수 있는 정위 홀더에 넣습니다.

동물의 머리를 머리 홀더에 넣고 이어바를 고정한 다음 거즈로 몸을 테이프로 붙입니다. 동물 사육장에는 조절 가능한 이빨 막대가 장착되어 머리의 수직 및 수평 정렬이 가능해야 하며, 머리가 코달 로스트랄 방향으로 적절하게 배치되고 머리가 회전하지 않도록 해야 합니다. 표면 코일이 머리에 제대로 배치되어 동물 홀더가 회전할 수 있는지 확인하십시오.

자석에 있을 때 동물에서 동물로 발생할 수 있는 사소한 회전에 대한 보상을 제공합니다. 동물이 홀더에 고정되면 MRI 스캐너에 홀더를 놓습니다. 이제 표면 코일이 있는 홀더를 스캐너 중앙으로 이동합니다.

능동적으로 분리된 72mm 공진기는 RF 에너지를 전송하여 신호를 생성하는 데 사용되며 헤드 코일은 신호 수신에 사용됩니다. 이제 코달 로스트랄 방향의 실시간 1차원 판독값을 사용하여 초기 위치를 결정합니다. 표면 코일 수신을 사용하면 표면 코일 주변 영역에 대한 신호가 제한되어 관찰된 파형을 해석할 필요가 제한됩니다.

그런 다음 스캐너에서 동물의 정확한 위치를 결정하기 위해 3면 로컬라이저를 구입하십시오. 다음으로 자기장의 균질성에 대한 shimming 또는 조정이 필요합니다. 이를 위해 Hobie Heatherington 박사가 개발한 다중 그래디언트 에코 시퀀스 및 매핑 소프트웨어를 사용하여 균질성 영역을 각 개별 이미징 방법으로 검사한 영역과 일치시킵니다.

shimming이 완료되면 관심 있는 스캔을 얻을 수 있습니다. 나노 입자를 함유 한 SPIO의 생체 내 분포는 동물을 주입하기 전에 먼저 고해상도 3 DT 2 스타 가중 MRI에서 신호 손실 영역으로 감지 할 수 있으며, LOCALIZER 스캔에서 스캔 할 뇌 영역을 결정합니다. 그런 다음 150미크론 등방성 해상도로 리콜된 에코 시퀀스를 불러오는 고해상도 3D 구배를 처방합니다.

기준선 스캔을 획득한 다음 동물을 주입하고 동일한 염기서열을 다시 획득합니다. 나노 약물의 치료 효능을 결정하기 위한 병렬 연구는 확산 텐서 이미징 및 수소 자기 공명 분광법 검사를 사용하여 수행할 수 있습니다. 먼저 S 스카우트 이미지를 획득하고 스캔할 영역을 심습니다.

그런 다음 스캔에서 호흡기 게이트 스핀 에코 확산, 가중 에코 평면 이미징 시퀀스를 사용하여 DTI를 획득합니다. 사용된 확산 인코딩은 12개 방향의 균형 잡힌 회전 및 변형 및 교대 극성 ISO 대성당 구성표였으며 인코딩 체계는 배경 확산 구배 결합을 줄이도록 설계되었습니다. 총 획득 시간은 호흡수에 따라 20분에서 40분이었습니다.

다음으로 Mr.Spectroscopy를 구입합니다. 이전에 획득한 이미지에서 관심 영역을 찾고, 선택한 영역에서 shimming을 수행한 다음, 수분 억제 펄스의 전력을 최적화합니다. 물 주파수를 측정하여 공진 물 신호를 확인하고 스펙트럼의 품질이 충분하지 않은 경우 품질 관리를 제공하기 위해 짧은 테스트 스펙트럼을 획득합니다.

무선 주파수, 전원 및 심 설정을 포함한 시스템 설정을 확인합니다. 마지막으로, 자기장 드리프트의 영향을 제거하기 위해 수집 사이의 시스템 주파수를 재설정하여 짧은 블록에서 스펙트럼을 획득합니다. 인수가 끝날 때.

단일 펄스 물 스펙트럼을 사전 정의된 사전 증폭기 이득으로 정량적 신호 진폭 기준으로 사용합니다. 시리즈의 마지막 MRI 스캔 후 마우스를 관류하고 뇌를 제거한 다음 인도 잉크 한 방울을 사용하여 어둡게 한 OCT 화합물 블록에 삽입합니다. 그런 다음 이 블록을 슬라이싱 및 조직학적 분석을 위해 저온 유지 장치에 넣습니다.

저온 유지 장치 전면에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 블록 표면 이미지를 획득합니다. 이미지는 전체 뇌 용적 번호를 통해 50마이크로미터마다 촬영해야 하며, 슬라이스는 체적 내에 등록할 수 있도록 해야 합니다. 조직학적 처리 및 염색 후 개별 블록 면 슬라이스를 정렬하여 3D 볼륨을 재구성합니다.

블록 윤곽선을 사용하여 저온 유지 장치 헤드 위치의 지터를 고려한 다음, 분석 소프트웨어 패키지의 시드 기반 영역 성장 알고리즘을 사용하여 뇌 볼륨을 자동으로 분할합니다. 초상자성 산화철은 T 별 2개 가중 MRI에서 신호 손실을 일으키므로 MRI 신호 공극은 민감하지만 그 존재에 대한 특정 마커는 아닙니다. 뇌에서 SPIO의 존재에 대한 민감도와 특이성을 모두 제공합니다.

뺄셈 이미지는 연구를 위해 주입 전후 3D MRI 스캔에서 생성되어야 합니다. 스캔은 우리 실험실에서 개발된 제한된 수준 설정 방법을 사용하여 하위 이미지화되었습니다. 그런 다음 하위 이미지화된 뇌 볼륨을 공동 등록 신호 강도를 정규화하고 볼륨을 빼서 신호 손실이 있는 뇌 내 영역을 감지했으며, 이는 하위 픽셀 등록 오류에서 힘 양성 신호를 제거하기 위해 가장자리를 따르지 않았습니다.

다음으로, 조직학과 MRI 간의 공동 정합은 블록 얼굴 이미지를 공통 참조로 사용하여 수행됩니다. 이 두 신호의 정확한 공동 국소화는 조직학의 공동 정합 및 뒤틀림의 정확성을 슬라이스의 원래 모양으로 되돌려 놓는 하나의 척도를 제공합니다. DTI 스캔은 특정 해부학적 하부 구조에서 조직의 평균 확산 특성을 결정하기 위해 먼저 관심 있는 해부학적 영역을 선택하여 분석할 수 있습니다.

우리의 연구에서는 확산 가중 데이터의 분석이 Cada Hassan 박사가 제공하는 대화형 데이터 언어로 작성된 맞춤형 프로그램을 사용하여 수행됩니다. San 분석은 텐서 확산도, 평균 확산도 및 분수 무위축의 맵을 생성합니다. 확산 텐서의 횡방향 및 종방향 구성 요소도 맵이 구성되면 얻을 수 있습니다.

색상으로 인코딩된 방향성 맵으로 오버레이된 두 개의 가중치 MRI에 관심 영역을 그립니다. HIV 마우스 모델의 분석을 위해 실험에서 선택한 영역의 예가 여기에 표시되어 있습니다. 각 관심 영역의 데이터는 나중에 데이터베이스에 입력할 수 있도록 텍스트 파일로 다운로드됩니다.

단일 스펙트럼의 MRS 곡선 맞춤 결과의 예가 여기 실험실에 나와 있습니다. 우리는 Quest라는 시간 도메인 피팅 방법을 사용합니다. J-M-R-U-I 신호 처리 패키지.

Quest는 개별 대사 산물 스펙트럼의 선형 조합을 사용하여 스펙트럼을 피팅하여 자극된 스펙트럼과 실제 스펙트럼 사이의 최소 제곱 최소화를 수행합니다. 우리는 22개의 개별 대사 산물로 구성된 기본 세트를 잠재적인 기여 요인으로 사용합니다. Basis spectra는 개별 대사 산물의 용액 스펙트럼을 사용하여 시뮬레이션되고 검증됩니다.

이러한 방법을 사용한 SPIO 표지 대식세포의 생체 분포의 예는 여기에서 볼 수 있으며, 빨간색은 MRI에 의해 검출된 표지된 세포의 위치, 공동등록 조직학을 사용한 표지된 세포의 위치는 파란색, 겹치는 노란색의 위치를 오버레이합니다. 그 쥐는 꼬리 정맥에 주입된 단핵구 유래 대식세포(monocyte derived macrophage)라고 표지했다. 5일 후, T 2 스타 가중 MRI를 획득하여 설명된 대로 처리했습니다.

이 마우스는 HIV에 감염된 인간 대식세포를 뇌에 주입하여 제조되었으며, 이는 검출된 마우스 단핵구 유래 대식세포의 계통으로 보입니다. 표지된 세포의 검출과 조직학과의 공동 등록에 대한 추가 예는 이전 간행물에서 볼 수 있습니다. 실험실 모델 시스템에서 세포 흡수를 위한 입자 제조업체 및 생물학적 특성 테스트가 필요하며 이러한 동물 조사에 사용하기 위해 멸균 절차에 따라 수행해야 합니다.

세포가 함유된 제형의 주입은 뇌 및 기타 조직 영역에 영향을 미치므로 정맥 접근을 손상시키지 않고 수행되어야 하며, 세포 생물학적 제제와 바이오이미징 기술의 통합을 시각화하고 강력한 교차 협업 장면이 전체 프로젝트의 성공에 필수적인 것으로 입증되었습니다. 일단 숙달되면 절차를 수행하는 동안 시스템을 설정, 배치 및 보정할 수 있는 교육을 받은 직원이 있는지에 따라 절차를 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 취약한 면역 저하 마우스가 연속 연구의 시간 과정 동안 생존 할 수 있도록 무균 상태를 유지하는 것이 중요하며, 그 중 일부는 몇 달 동안 지속될 수 있습니다.

이러한 방법은 연구자들이 조직학을 사용하여 시각화된 세포 변화와 감지된 형태학적, 생리학적, 생화학적 이상 사이의 관계를 탐구할 수 있는 방법을 위한 무대를 마련했습니다. 조직학의 뇌 공동 등록에 신경 영상 방법을 사용하는 것은 어려운 일이며 소수의 그룹에서만 수행되었습니다. 이 비디오를 본 후.

뇌 영상 실험이 어떻게 수행되고 설치류 질병 모델에서 조직학과 연계되는지 이해해야 합니다. 이것은 초 상자성 산화철 입자의 생체 분포를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또는 MRI can 및 국소 Mr.Spectroscopy를 사용하여 질병 진행 중에 나타나는 신경 퇴행을 추적할 수 있습니다.

그런 다음 뇌 손상을 개선하기 위한 치료 효과를 순차적으로 평가할 수 있습니다. 이미징은 조직학과 함께 사용하여 실험 결과를 검증할 수 있습니다. 전반적으로 이러한 방법은 나노 입자, 생체 내 분포 및 치료 효능에 대한 역동적이고 정확한 측정 세트를 제공할 것입니다.