Name: Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 해마 조직 슬라이스 배양법으로 신경과학 연구에서 해마 기능을 2주간 유지하며 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 뇌 생리학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NINDS에 의해 투자되었다 - NIH R01NS060756은

1. Hippocampal 조각의 준비를 시작하기 전에. <ol><li> 테플론 시트의 한 조각을 배치하고 새 블레이드를 장착하여 조직의 기계를 준비​​합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 조직 문화 (TC) 후드를 닦으과 해부 현미경 내부를 설정합니다. 후드, 현미경, 조직 슬라 이서 및 자외선과 함께 15 분 동안 모든 해부기구를 소독. </li><li> 식스 웰 TC 플레이트를 준비합니다. 각 우물에 750 μL 슬라이스 문화 미디어 (SCM)마다 잘과 장소 세포 배양 삽입을 추가합니다. 점막이 아래없이 거품과 함께 철저하게 서부 유럽 표준시 있는지 확인합니다. 35 인큐베이터에있는 접시를 놓고 ° 필요한 때까지 C 5 % CO 2 가스에. </li><li> 100 ML의 비이커에 50 ML 낮은 나 + ACSF을 (솔루션을 해부) 기름을 붓고 얼음 소금 믹스에 배치하십시오. 버블은 낮은 나 + ACSF는 5 % CO 2 / 95% O 2 컬러 변경 및 ACSF은 냉동 액체 용액 (10-20 분)의 슬러리 혼합을 형성까지. </li><li> P5 - P7 랫은 새끼하십시오. 최대 3 새끼를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. Hippocampal 슬라이스 준비. <ol><li> 날카로운 유틸리티 가위로 동물의 머리를 잘라. 피부를 잘라 두개골을 노출. 작은 가위로 화살 봉합 따라 다음 interaural 라인을 따라 좌우로 절단하고하여 두개골을 엽니다. 정면에서 좌우로 옵션 상처는 뼈와 뇌 노출을 제거 촉진하기 만들 수 있습니다. 둥근 스푼 마이크로 주걱과 함께 신속하게 두뇌를 꺼내서 ~ 1 분 쉬고 솔루션을 해부의 슬러리에 놓으십시오. 60mm 요리에 얼음 추위 해부 솔루션 ~ 10 ML을 붓고와 비커에서 접시에 두뇌를 전송합니다. 두뇌는 솔루션을 해부으로 덮여 있어야합니다. </li><li> 아래 현미경 해부 : 플레이스 두뇌와 60mm 요리의 하단에 눌러 해부 포셉있는 정중선에서 들고있어. midbrain을 떠나는 반구를 분리하는 해마 해부 도구를 사용하십시오. hippocampi는 다음 각 반구에 노출됩니다. 부드럽게 도구를 해부 말머리 말머리를 특종. 완전히 해마를 분리하고 가능한 한 그것을 청소하기 위해 해부 바늘을 사용합니다. </li><li> P1000 필터 피펫 팁의 냈다 팁을 사용하여 부드럽게 해마를 기음과 조직 슬라이에 테플론 시트로 전송할 수 있습니다. 그 오목한 측면에 해마를 놓습니다. </li><li> 코로나 섹션을 얻고 액체의 초과를 유출하는 블레이드 hippocampi의 직각을 맞춥니다. </li><li> hippocampi 매 400 μm의를 얇게. </li><li> 다른 냈다 P1000 필터 팁 및 감기에 SCM을 사용하여 기계에서 hippocampi을 얇게 60mm 요리 및 전송에 ~ 10 ML 추위 SCM 하거라. 거품을 만드는 피하십시오. </li><li> 이리스 주걱과 직선 주걱의 도움으로 부드럽게 서로의 슬라이스를 구분한다. </li><li> 손상 조각에서 잘 정의되고 손상되지 않은 조각 분리합니다. </li></ol> 3. Hippocampal 조각 문화 <ol><li> 인큐베이터에서 SCM과 세포 배양 삽입과 여섯 잘 접시를 가져와. 다른 냈다 P1000 필터 팁의 도움으로, 멤브레인에 개별 조각 전송합니다. 막 당 4-5 슬라이스를 놓습니다. 조각 역시 삽입 벽 가까이에 또는 서로 가까운 장소에하지 않도록주의하십시오. 필요한 경우, 별도의 조각으로 이리스 주걱을 사용합니다. 초과 매체를 제거합니다. 그들은 막에있는 한 최대한 작은 조각으로 터치. </li><li> 35 다시 인큐베이터로 판과 문화를 이동 ° C와 5% CO 2. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 SCM을 aspirating하여 TC 후드 안쪽 SCM 매 48 시간을 변경합니다. 잘마다 신선한 사전 예열 SCM의 750 μL를 추가합니다. 더 거품이 막 아래에 형성되지 않습니다 있는지 확인합니다. </li></ol> 4. 솔루션 <ol><li> 낮은 나 + ACSF - 슬라이스 문화 분석 해 봅시다 솔루션 deionized 및 무균 H 2 O에 추가하려면 : <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500 ML에 대한 </td><td> 1000 ML의 경우 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 0.901 g </td><td> 1.802 g </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 0.149 g </td><td> 0.298 g </td><td> 4 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 (1 M) </td><td> 2.5 ML </td><td> 5 ML </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 1.092 g </td><td> 2.184 g </td><td> 26 MM </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 40g </td><td> 80g </td><td> 234 MM </td></tr><tr><td> DPBS에 페놀 레드 솔루션 0.5 % </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 0.1 % V / V </td></tr></tbody></table> 믹스 ~ 30 분 Steril0.22μm 필터를 통해 통과하여는 어때 ° C 이상 이개월 4 개 이상의 50 ML aliquots하고 저장하십시오. </li><li> 슬라이스 문화 매체 (SCM) <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 500 ML에 대한 </td><td> 1000 ML의 경우 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 멤 이글 매체 </td><td> 4.2 g </td><td> 8.4 g </td><td> 8.4 g / L </td></tr><tr><td> 호스 혈청 열 inactivated </td><td> 100 ML </td><td> 200 ML </td><td> 20% </td></tr><tr><td> L - 글루타민 (200 ㎜) </td><td> 2.5 ML </td><td> 5 ML </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 M) </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> MgSO 4 (1 M) </td><td> 1 ML </td><td> 2 ML </td><td> 2 MM </td></tr><tr><td> 인슐린 (1 MG / ML), HCL 0.01 N에 녹아있는 </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 1 MG / L </td></tr><tr><td> 아스코르비 산, 솔루션 (25 % W / V) </td><td> 0.024 ML </td><td> 0.048 ML </td><td> 0.00125 % </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 1.16g </td><td> 2.32g </td><td> 13 MM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 0.22g </td><td> 0.44g </td><td> 5.2 MM </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 3.58g </td><td> 7.16g </td><td> 30 MM </td></tr></tbody></table> 완전히 녹아까지 섞어 실온에 가져와. 1 N NaOH로 7.27-7.28로 산도를 조정 측정 osmolarity. deionized 및 소독 H 2 O.과 320 mmol / kg으로 조정 약 25-40 ML을 추가할 예정입니다. 다시 osmolarity를​​ 확인하십시오. osmolarity를​​ 조정하면서 *** 산도가 약간 변경될 수 있습니다,이 괜찮습니다, 그것은 osmolarity가 올바른 범위 (317-323)에있는 것을 더 중요합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 통과하여 소독. 4 2 대 3 주 20 ML aliquots하고 저장하십시오 ° C. Gluatamine 재고 : 2.5 ML의 aliquots에서 -20 ° C에서 200 mm까지와 저장소의 농도에서 준비합니다. 아스코르비 산 주식 : 25 %의 농도 (W / V)에서 준비하고 100 μL의 aliquots에서 -20 ° C에 저장됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 조각은 검은 반점이없는 해부 현미경 흰색 외관과 잘 정의되고 손상되지 않은 CA1, CA3 및 이가있는 이랑 지역 것입니다. 박테리아 오염은 쉽게 SCM의 매체 또는 탁도에 검은 점들을 이동으로 볼 수 있습니다. 현미경으로 배치하면, 단면의 표면은 분명하고 discernibly 세포 기관과 문화 4 일 후에 깨끗하게 보일 것입니다. 더 명확한 세포 기관은 본 적이 있고 많은 부스러기 4 일 후에 표면을 다루고있다면 건강 슬라이스되지 않습니다.

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 11. 첫째 Stoppini 외에 기술된 방법에 따라 문화 hippocampal 조각하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 조각이 멸균 유지하는 것입니다, 따라서 그것은 적절한 살균 기술을 사용하고 적절히 조직과의 접촉에있는 모든 자료를 소독하고 소독하는 것이 중요합니다. 다른 serums 소스는 조각의 품질에 영향을 미칠 수있다. 우리는 처음 몇 번이나 테스트하는 것이 좋습니다. 오염 문제가 재발하는 경우, 보육 및 오염의 가능성 소스에 대한 조직 문화 후드를 확인하십시오. 모든 절차를 수행하는 동안 살균 기술의 적절한 사용은 필수적입니다. 잘린에서 막과 보육의 조각 배치하는 총 시간은 1.5 시간보다 더 이상이어야합니다. 절차가 너무 오래 걸린다면, 그것은 조각의 건강을 손상됩니다. ...

<table><tbody><tr><td>세포 배양 인서트</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>조직 절편기</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td> 해마 해부 도구</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>대형 유틸리티 가위, Perfection</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 우수성/좌수성</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 스패튤라</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>직형 스패튤라</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>라운드 스푼 마이크로 스패튤라</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>해부용 단일 절삭날 바늘</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>해부용 핀셋</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>소형 해부 가위</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle 배지</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>열 불활성화 말 말혈청</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 (1 mg/ml), 0.01 N HCl에 용해됨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산 용액 (25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>수크로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 내 페놀 레드 용액 0.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic hippocampal 슬라이스 문화

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

해마는 변연 계 시스템의 구성 요소, 장기 기억과 공간적 탐색 1 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Hippocampal 신경 강력한 정품 인증 짧은 기간 이후에 그들의 연결 강도를 수정할 수 있습니다. 장기 potentiation (LTP)으로 알려진이 현상은, 몇 시간 또는 며칠 동안 지난 수 있으며, 학습과 기억이 가장 적합한 후보기구가되었다. 또한, 해마 3 잘 정의된 해부 및 연결은 시냅스 전달 및 시냅스 소성 4를 공부하는 클래식 모델 시스템을 만들었습니다. hippocampal 시냅스의 생리에 대한 우리의 이해가 성장하고 분자 플레이어가 확인되자, 시냅스 단백질을 조작할 필요가 필수적이되었습니다. Organotypic hippocampal 문화는 쉬운 유전자 조작과 정확한 약리 개입 가능성을 제공하지만, 일상 문화 dissociated 뉴런 방법보다 더 자연 맥락에서 버렸네 기능을 이해하는 것이 중요합니다 신경 조직을 유지합니다. 여기 우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 hippocampal 조각 준비하고 문화에 방법을 제시한다. 이 방법은 바이러스 감염 5,6 또는 biolistics 7과 같은 다른 방법을 사용하여 유전자 조작을위한 조각에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 조각 쉽게 생화학 assays 8 복구할 수, 또는 영상 9 electrophysiological 실험 10 현미경으로 전송.

우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 organotypic hippocampal 조각을 준비하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각이 인터페이스를 형성하기 위해 허용되는 구멍이 세포막과 문화 미디어에 누워있다. 이 방법은 최대 문화에 이주하는 해마의 매출 구조를 유지합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

대뇌변연계의 구성 요소인 해마는 장기 기억과 공간 탐색에서 중요한 역할을 합니다 1. 해마 뉴런은 ...을 수정할 수 있습니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 기관형 해마 절편을 배양하는 것입니다. 이는 먼저 해마를 적출함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 해마를 절단하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 해마 슬라이스를 분리하고 분류하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 해마 슬라이스를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 해부 현미경 또는 일반 현미경을 통한 시각화를 통해 건강한 유기적 해마 슬라이스를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Jimena Opitz이며 워싱턴 대학교 Andres bar 박사 연구실의 연구원입니다. 시애틀에서 저는 기관형 해마 슬라이스 배양 절차를 시연하겠습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 분들은 해마를 신속하게 해부하고 절편으로 만들어야 한다는 점과 오염을 방지하기 위해 멸균된 해부 용액 및 슬라이스 배양 환경을 유지해야 한다는 점 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.배지는 서면 프로토콜에 기술된 대로 최대 3주 전에 미리 준비하여 4°C에서 보관할 수 있습니다. 해마 슬라이스 제작 전에 배양액을 준비할 수 있습니다. 조직 배양 후드와 해부 과정에서 사용할 장비를 적절하게 멸균하는 것이 필수적입니다.먼저, 조직 배양 후드의 내부 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 해부 현미경과 모든 해부 도구를 후드 내부에 배치합니다. 스테이지 위에 깨끗한 Teflon 시트를 놓고 새 칼날을 장착하여 조직 절단기를 준비합니다.조직 배양 후드 내부에 조직 슬라이서를 배치하고, UV 램프를 사용하여 모든 표면과 장비를 15분 동안 멸균합니다. UV 멸균 과정이 완료되면 램프를 끕니다. 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행합니다.먼저, 해마 슬라이스를 배양하는 데 사용할 6-웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 750 µL의 SEM을 피펫으로 분주합니다. 그다음 멸균 핀셋을 사용하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 배양 인서트를 넣습니다.인서트 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 각 세포 배양 인서트의 멤브레인이 슬라이스 배양 배지로 젖어 있는 것이 중요합니다. 멤브레인이 말라 있다면 기포가 없는지 확인하십시오.멤브레인이 SCM의 메니스커스(meniscus) 위에 떠 있다면, 웰에 배지를 더 추가할 수 있습니다. 준비된 배양 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 사용 전까지 35 °C, 5% carbon dioxide 조건으로 설정하십시오.마지막으로, 얼음과 소금 혼합물로 아이스 버킷을 채워 후드 내부의 안락사 구역 옆에 둡니다. 100 mL 비커에 해부액을 채웁니다. 비커를 얼음 소금 혼합물에 넣고 5% carbon dioxide와 95% oxygen으로 10~20분 동안 용액을 버블링하여 색상이 분홍색에서 주황색으로 변할 때까지 둡니다.해부 용액은 냉동 및 액체 용액이 섞인 슬러리 혼합물을 형성합니다. 이제 해부 환경과 조직 배양 플레이트가 해부를 위해 준비되었습니다. P3에서 P7 랩(wrap)을 사용합니다.이 절차에는 새끼 쥐를 사용합니다. 한 번에 최대 세 마리의 새끼 쥐로부터 슬라이스 배양물을 준비할 수 있습니다. 본 절차는 새끼 쥐 한 마리를 사용하여 설명하겠습니다.참수된 wrap pup에서 뇌를 빠르게 적출하여 dissection solution Slurry Chill이 담긴 100 milliliter 비커에 1분 동안 넣어둡니다. 이 시간 동안 60 millimeter 조직 배양 접시 바닥에 ice cold dissection solution을 약 10 milliliter 추가하여 해부 접시를 준비합니다. 라운드 스푼이나 마이크로 스파출러를 사용하여 뇌를 100 milliliter 비커에서 차가운 dissection medium이 채워진 60 millimeter 접시로 옮깁니다. 이때 뇌가 dissection solution에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.뇌가 담긴 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 해부 현미경을 통해 뇌의 위치를 확인합니다. 멸균된 해부용 핀셋을 사용하여 뇌를 시야 중심부로 이동시킵니다.해부용 핀셋을 접시 바닥에 밀착시켜 뇌의 중앙선을 고정합니다. 해마 해부 도구를 사용하여 중뇌는 그대로 둔 채 대뇌 피질 반구를 중뇌에서 조심스럽게 벗겨냅니다. 이때 대뇌 피질 반구가 뇌의 나머지 부분에서 완전히 분리되지 않도록 하는 것이 좋으며, 이렇게 하면 해마가 노출됩니다. 해마 해부 도구를 사용하여 한쪽 반구에서 해마를 긁어내어 추출합니다.그런 다음 해부용 바늘을 사용하여 해마 이외의 조직을 가능한 한 많이 제거합니다. 첫 번째 해마를 분리하고 세척한 후, 다른 반구의 두 번째 해마에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 멸균 가위로 P 1000 필터 피펫 팁의 끝부분을 잘라냅니다.멸균된 P 1000 피펫에 피펫 팁을 장착합니다. 해마 하나를 조심스럽게 흡입하여 조직 절편기(tissue slicer)의 테플론 시트 위에 올립니다. 그런 다음 동일한 방법으로 두 번째 해마를 절편기 위에 올립니다.해마의 절반 부분을 오목한 면이 위로 오게 놓은 다음, 칼날과 수직이 되도록 정렬하고 테플론 시트에서 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 버니어 마이크로미터(ver or micrometer)를 0점에 맞춥니다. 해마를 400 µm 두께의 절편으로 자릅니다.끝을 자른 P 1000 필터 팁을 추가로 준비하여 멸균된 P 1000 피펫에 장착합니다. 60 mm 멸균 조직 배양 접시에 차가운 SCM 약 10 milliliters를 붓습니다. 피펫을 사용하여 배지를 약간 추가한 후, 슬라이서에서 해마 절편을 접시로 옮깁니다.모든 슬라이스에 대해 전송 과정을 반복한 후 기포가 생기지 않도록 주의하며 디쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 마지막으로, 아이리스 스패튤라와 스트레이트 스패튤라를 사용하여 슬라이스들을 서로 조심스럽게 분리합니다.형태가 뚜렷하고 손상되지 않은 슬라이스를 손상된 슬라이스로부터 분리하십시오. 이렇게 형태가 뚜렷한 해마 슬라이스는 이제 배양 준비가 된 상태입니다. SCM과 세포 배양 인서트가 들어 있는 미리 준비된 6-웰 조직 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내십시오. 끝부분을 자른 넓은 보어 팁이 장착된 P 1000 파이펫을 사용하여 멤브레인당 4~5개의 개별 슬라이스를 옮기십시오.필요한 경우, 아이리스 스패출라(iris spatula)를 사용하여 슬라이스를 분리하십시오. 슬라이스를 인서트 벽면에 너무 가깝게 배치하거나 서로 너무 밀착되지 않도록 주의하십시오. 슬라이스에 닿지 않도록 주의하며, 세포 배양액 상층의 과잉 배지를 흡입하여 제거하십시오.막을 삽입합니다. 마지막으로, 해마 슬라이스 배양이 포함된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 온도는 35 °C, 이산화탄소 농도는 5%로 설정합니다.48시간 후, 조직 배양 후드 내부에서 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냅니다. 후면 피펫을 사용하여 배지를 흡입하여 제거합니다. 웰당 750 µL의 신선하게 예열된 SCM을 첨가합니다.다시 한번, 세포 배양 인서트 막 아래에 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오. 이것은 배양 준비가 된 건강한 해마 절편의 예시입니다. 해마의 영역인 CA1, CA3 및 치상회(dentate gyrus)가 손상 없이 명확하게 보입니다.여기에 배양에 사용되지 않은 손상된 해마 슬라이스가 나와 있습니다. 마지막으로, 이는 4일간 배양한 후의 건강한 해마 슬라이스의 예시입니다. 해부 현미경 하에서 슬라이스가 하얗게 보이며 슬라이스의 표면이 깨끗하다는 점에 유의하십시오.해마의 영역인 CA1, CA3 및 치상회(dentate gyrus)가 손상 없이 뚜렷하게 관찰됩니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 약 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 적절한 멸균 기술을 사용하고 조직을 조심스럽게 다루는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 해마의 조직배양(organotypic culture) 및 용해(lysis) 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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organoptypic hippocampal 슬라이스 문화...

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

이 비디오는 새끼 쥐의 뇌에서 유기형 해마 절편 배양을 준비하는 방법을 보여줍니다. 해마 절편에서 세포 생존력과 성장을 촉진하여 궁극적으로 유기형 절편 배양을 생성하는 데 필요한 해마 해미 해부 및 배양 조건과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Preparation of Organotypic Slice Cultures from a Rat Pup's Hippocampus(쥐 새끼의 해마에서 유기형 슬라이스 배양 준비)

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런에서 동시에 전체 세포 패치 클램프 기록으로, 개별 뉴런 사이의 시냅스에 대한 정확한 전기생리학적 및 약리학적 특성화를 가능하게 합니다. 여기에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 유기형 해마 절편 배양에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항에 대해 설명합니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈에서, 이 조각은 진화하는 간질 같이 사건을 묘사하고 간질 발생의 전 생체 권 모형으로 간주될 수 있습니다. 이 시스템은 자발적인 활동의 역학을 모니터링뿐만 아니라 간질 발생 과정을 통해 신경 염증 기능의 진행을 평가하기위한 훌륭한 도구를 나타냅니다.

라인 피질-해마 오르가노티픽 슬라이스 배양에서 간질 발생의 모델

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

배우세요 해마 조직 슬라이스 배양법으로 신경과학 연구에서 해마 기능을 2주간 유지하며 분석하는 방법을 익히세요. 이 기법은 뇌 생리학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

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