Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

이 실험 절차의 전반적인 목적은 기관형 해마 절편을 배양하는 것입니다. 이는 먼저 해마를 적출함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 해마를 절단하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 해마 슬라이스를 분리하고 분류하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 해마 슬라이스를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 해부 현미경 또는 일반 현미경을 통한 시각화를 통해 건강한 유기적 해마 슬라이스를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Jimena Opitz이며 워싱턴 대학교 Andres bar 박사 연구실의 연구원입니다. 시애틀에서 저는 기관형 해마 슬라이스 배양 절차를 시연하겠습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 분들은 해마를 신속하게 해부하고 절편으로 만들어야 한다는 점과 오염을 방지하기 위해 멸균된 해부 용액 및 슬라이스 배양 환경을 유지해야 한다는 점 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

배지는 서면 프로토콜에 기술된 대로 최대 3주 전에 미리 준비하여 4°C에서 보관할 수 있습니다. 해마 슬라이스 제작 전에 배양액을 준비할 수 있습니다. 조직 배양 후드와 해부 과정에서 사용할 장비를 적절하게 멸균하는 것이 필수적입니다.

먼저, 조직 배양 후드의 내부 표면을 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 해부 현미경과 모든 해부 도구를 후드 내부에 배치합니다. 스테이지 위에 깨끗한 Teflon 시트를 놓고 새 칼날을 장착하여 조직 절단기를 준비합니다.

조직 배양 후드 내부에 조직 슬라이서를 배치하고, UV 램프를 사용하여 모든 표면과 장비를 15분 동안 멸균합니다. UV 멸균 과정이 완료되면 램프를 끕니다. 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행합니다.

먼저, 해마 슬라이스를 배양하는 데 사용할 6-웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 750 µL의 SEM을 피펫으로 분주합니다. 그다음 멸균 핀셋을 사용하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 세포 배양 인서트를 넣습니다.

인서트 아래에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 각 세포 배양 인서트의 멤브레인이 슬라이스 배양 배지로 젖어 있는 것이 중요합니다. 멤브레인이 말라 있다면 기포가 없는지 확인하십시오.

멤브레인이 SCM의 메니스커스(meniscus) 위에 떠 있다면, 웰에 배지를 더 추가할 수 있습니다. 준비된 배양 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 사용 전까지 35 °C, 5% carbon dioxide 조건으로 설정하십시오.

마지막으로, 얼음과 소금 혼합물로 아이스 버킷을 채워 후드 내부의 안락사 구역 옆에 둡니다. 100 mL 비커에 해부액을 채웁니다. 비커를 얼음 소금 혼합물에 넣고 5% carbon dioxide와 95% oxygen으로 10~20분 동안 용액을 버블링하여 색상이 분홍색에서 주황색으로 변할 때까지 둡니다.

해부 용액은 냉동 및 액체 용액이 섞인 슬러리 혼합물을 형성합니다. 이제 해부 환경과 조직 배양 플레이트가 해부를 위해 준비되었습니다. P3에서 P7 랩(wrap)을 사용합니다.

이 절차에는 새끼 쥐를 사용합니다. 한 번에 최대 세 마리의 새끼 쥐로부터 슬라이스 배양물을 준비할 수 있습니다. 본 절차는 새끼 쥐 한 마리를 사용하여 설명하겠습니다.

참수된 wrap pup에서 뇌를 빠르게 적출하여 dissection solution Slurry Chill이 담긴 100 milliliter 비커에 1분 동안 넣어둡니다. 이 시간 동안 60 millimeter 조직 배양 접시 바닥에 ice cold dissection solution을 약 10 milliliter 추가하여 해부 접시를 준비합니다. 라운드 스푼이나 마이크로 스파출러를 사용하여 뇌를 100 milliliter 비커에서 차가운 dissection medium이 채워진 60 millimeter 접시로 옮깁니다. 이때 뇌가 dissection solution에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.

뇌가 담긴 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 해부 현미경을 통해 뇌의 위치를 확인합니다. 멸균된 해부용 핀셋을 사용하여 뇌를 시야 중심부로 이동시킵니다.

해부용 핀셋을 접시 바닥에 밀착시켜 뇌의 중앙선을 고정합니다. 해마 해부 도구를 사용하여 중뇌는 그대로 둔 채 대뇌 피질 반구를 중뇌에서 조심스럽게 벗겨냅니다. 이때 대뇌 피질 반구가 뇌의 나머지 부분에서 완전히 분리되지 않도록 하는 것이 좋으며, 이렇게 하면 해마가 노출됩니다. 해마 해부 도구를 사용하여 한쪽 반구에서 해마를 긁어내어 추출합니다.

그런 다음 해부용 바늘을 사용하여 해마 이외의 조직을 가능한 한 많이 제거합니다. 첫 번째 해마를 분리하고 세척한 후, 다른 반구의 두 번째 해마에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 멸균 가위로 P 1000 필터 피펫 팁의 끝부분을 잘라냅니다.

멸균된 P 1000 피펫에 피펫 팁을 장착합니다. 해마 하나를 조심스럽게 흡입하여 조직 절편기(tissue slicer)의 테플론 시트 위에 올립니다. 그런 다음 동일한 방법으로 두 번째 해마를 절편기 위에 올립니다.

해마의 절반 부분을 오목한 면이 위로 오게 놓은 다음, 칼날과 수직이 되도록 정렬하고 테플론 시트에서 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 버니어 마이크로미터(ver or micrometer)를 0점에 맞춥니다. 해마를 400 µm 두께의 절편으로 자릅니다.

끝을 자른 P 1000 필터 팁을 추가로 준비하여 멸균된 P 1000 피펫에 장착합니다. 60 mm 멸균 조직 배양 접시에 차가운 SCM 약 10 milliliters를 붓습니다. 피펫을 사용하여 배지를 약간 추가한 후, 슬라이서에서 해마 절편을 접시로 옮깁니다.

모든 슬라이스에 대해 전송 과정을 반복한 후 기포가 생기지 않도록 주의하며 디쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 마지막으로, 아이리스 스패튤라와 스트레이트 스패튤라를 사용하여 슬라이스들을 서로 조심스럽게 분리합니다.

형태가 뚜렷하고 손상되지 않은 슬라이스를 손상된 슬라이스로부터 분리하십시오. 이렇게 형태가 뚜렷한 해마 슬라이스는 이제 배양 준비가 된 상태입니다. SCM과 세포 배양 인서트가 들어 있는 미리 준비된 6-웰 조직 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내십시오. 끝부분을 자른 넓은 보어 팁이 장착된 P 1000 파이펫을 사용하여 멤브레인당 4~5개의 개별 슬라이스를 옮기십시오.

필요한 경우, 아이리스 스패출라(iris spatula)를 사용하여 슬라이스를 분리하십시오. 슬라이스를 인서트 벽면에 너무 가깝게 배치하거나 서로 너무 밀착되지 않도록 주의하십시오. 슬라이스에 닿지 않도록 주의하며, 세포 배양액 상층의 과잉 배지를 흡입하여 제거하십시오.

막을 삽입합니다. 마지막으로, 해마 슬라이스 배양이 포함된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 온도는 35 °C, 이산화탄소 농도는 5%로 설정합니다.

48시간 후, 조직 배양 후드 내부에서 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냅니다. 후면 피펫을 사용하여 배지를 흡입하여 제거합니다. 웰당 750 µL의 신선하게 예열된 SCM을 첨가합니다.

다시 한번, 세포 배양 인서트 막 아래에 기포가 형성되지 않았는지 확인하십시오. 이것은 배양 준비가 된 건강한 해마 절편의 예시입니다. 해마의 영역인 CA1, CA3 및 치상회(dentate gyrus)가 손상 없이 명확하게 보입니다.

여기에 배양에 사용되지 않은 손상된 해마 슬라이스가 나와 있습니다. 마지막으로, 이는 4일간 배양한 후의 건강한 해마 슬라이스의 예시입니다. 해부 현미경 하에서 슬라이스가 하얗게 보이며 슬라이스의 표면이 깨끗하다는 점에 유의하십시오.

해마의 영역인 CA1, CA3 및 치상회(dentate gyrus)가 손상 없이 뚜렷하게 관찰됩니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 약 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 적절한 멸균 기술을 사용하고 조직을 조심스럽게 다루는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 해마의 조직배양(organotypic culture) 및 용해(lysis) 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.