사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.

다음 실험의 전반적인 목표는 수정 후 하루 또는 24시간 단계에서 안티센스, 올리고뉴클레오티드, 모르포스 또는 기타 발달 교란 분자를 제브라피시 이물질에 직접 전달하는 것입니다. 이 예에서는 정적 음향 신경절 발달을 담당하는 가장 초기의 신경 영양 물질인 대식 세포 이동, 억제 인자 또는 MIF라고 하는 면역 체계 사이토카인에 대한 morph morphos를 사용하여 이 분자에 대한 morphos가 내이 발달 또는 신경 발생에 영향을 미치는지 확인합니다. 이것은 먼저 미세 주입을 사용하여 이낭의 내강에 Morphos를 도입한 다음 전기천공법을 수행하여 내강에서 이낭의 세포로 Morphos의 침투를 용이하게 함으로써 달성됩니다.

다음으로, 모르포스가 내이 발달과 신경 발생에 미치는 영향을 관찰하기 위해 배아를 섭씨 28.5도에서 키웁니다. 그 후 며칠 동안 내이 감각 유모 세포의 감소와 면역조직화학(immunohistochemistry)에 기초한 스타토 음향 신경절(stato acoustic ganglion)에 의한 신경 분포의 감소를 보여주는 결과가 얻어졌는데, 이는 각각 키노실리아(Kinocilia)의 아세틸화 튜불린(acetylated tubulin)과 입체섬모(Stereocilia)의 액톤(acton)을 표기합니다. 우리는 원래 병아리 배아에서 모르포스의 주입 및 전기천공법을 개발했으며, 실험실의 매우 재능 있는 학부생이 개발했습니다.

Katie Holmes는 이를 제브라피시 크기로 축소하는 데 성공했습니다. 박사후 연구원인 Yuchi와 실험실의 전 박사후 연구원인 Matt Wyatt를 포함한 현재 연구팀은 제브라피시를 위해 이 기술을 개선했습니다. 이 방법은 귀와 같은 장기 시스템에 대한 특정 morph eno 효과가 많은 장기 시스템에 영향을 미치고 귀에 이차적인 일반적인 발달 효과와 구별될 수 있는지 여부, 예를 들어 귀에 이차적으로 영향을 미치는 뇌에 대한 영향과 구별할 수 있는지 여부를 포함하여 발생 생물학 및 청각 연구 분야의 핵심적이고 핵심적인 질문에 답할 수 있기를 바랍니다.

1-4개의 세포 단계에서 마이크로 주입과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 후기 단계에서 모르포스를 귀에 직접 도입한다는 것입니다. 따라서 브랜드에 대한 morphoses의 직접적인 효과에서, 내이의 2 차 효과는 내이가 될 수 있습니다 전극을 만들기 위해 약 3-5 센티미터 길이의 75 마이크로 미터 직경의 텅스텐 와이어를 절단하여 시작합니다. 텅스텐 와이어를 Molex 케이블 커넥터에 끼웁니다.

다음으로, 텅스텐 와이어와 Molex 케이블 커넥터를 수축 튜브로 감싸고 분젠 버너 또는 히트 건으로 열을 가하여 수축 튜브를 와이어에 밀봉합니다. 그런 다음 텅스텐 와이어의 끝을 날카롭게하려면 와이어를 하나의 일반 수산화 나트륨에 담그고 클립을 사용하여 다른 전극으로 와이어를 구형파 전기로 전기분해합니다. 우리가 사용하는 조건은 5개의 50볼트 펄스이며, 각 펄스는 100밀리초 동안 지속되며 펄스 사이에는 50밀리초

전극 끝을 하나의 일반 수산화나트륨에 담근 상태에서 3회 반복합니다. 전극을 수산화나트륨에 약간 더 삽입하고 한 번 더 반복합니다. 전극을 더 삽입하고 전극을 거의 같은 거리로 두 번 전진시키고 마지막으로 한 번 반복합니다.

이 점진적 샤프닝은 전극에 매우 미세한 점을 생성하여 발달 중인 제브라피시 배아에 전극을 더 정확하고 덜 손상시키는 삽입을 가능하게 합니다. 제브라피시 귀 소포에 모르포스를 마이크로 주입하기 위한 전기천공에 사용하기 전에 트레이의 모델링 점토에 와이어를 눌러 두십시오. 먼저 저녁에 수컷과 암컷을 분리하기 위해 플라스틱 칸막이가 있는 번식 탱크를 설치합니다.

4마리의 수컷과 4마리의 암컷을 수조에 넣고 밤새 14-10개의 어두운 주기로 수조를 배양실에 둡니다. 다음날 아침 불을 켠 후 칸막이를 당겨 20-30분 정도 생선을 그대로 둡니다. 수컷과 암컷을 분리하고 번식 탱크에서 사육자를 제거하십시오.

민물고기 물이 담긴 탱크에 넣으십시오. 물이 들어있는 난자를 여과기에 부어 번식 탱크에서 배아를 수확합니다. 페트리 접시에 물기를 빼기 전에 신선한 달걀 물로 체에 계란을 여러 번 헹굽니다.

수정되지 않았거나 불투명한 난자를 제거하고 배아가 부화하는 동안 섭씨 28.5도에서 0.3PPM 메틸렌 블루로 하룻밤 동안 배아 배아를 배양합니다. 주입 직전에 Sutter P 97 전극 풀러로 유리 바늘을 당깁니다. 10mm 페트리 접시에 담긴 생선 물에 1% 아그로스로 구성된 AROS 젤 베이스를 수조 열에서 섭씨 37도, 생선 물에 1%낮은 융점 AGROS 또는 LMPA가 녹을 때까지 예열하고 섭씨 37도의 수조에서 따뜻하게 유지합니다.

유리 바늘에 모르포 용액을 채우고 팁을 적절한 직경으로 자릅니다. 약 10-15미크론. 질소 탱크가 있는 PV 8 20 공압 피코 펌프에 부착된 마이크로 매니퓰레이터에 주사 바늘을 장착하고 수정 후 24시간이 지나면 배아를 코팅하고 0.3PPM 메틸렌 블루 피쉬 물에 트리카로 마취합니다.

다음으로, 편리하고 균일한 분석을 위해 3-5개의 마취된 배아를 AROS 겔 베이스에 오른쪽이 위로 향하게 정렬하고, 각 배아에 1% LMPA를 1-2방울 떨어뜨린 후 배아를 제자리에 고정하기 위해 응고시킵니다. 귀 소포가 오른쪽에 오도록 페트리 접시를 회전시킵니다. 그런 다음 바늘을 귀 소포의 내강에 넣고 풋 페달을 사용하여 모르포 용액을 주입합니다.

microinjection 직후에, electroporation station를 설치하기 위하여 거치된 배아를 electroporation station에 옮기십시오. 먼저 날카로운 75 마이크로 미터 텅스텐 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 테이프로 붙입니다. 그런 다음 해부 현미경 스테이지의 양쪽에 미크론 매니퓰레이터를 놓습니다.

전기를 켜고 electroporation을 위한 매개변수를 설정합니다. 가장 효과적인 매개 변수. 이 실험을 위해 2 밀리 초에서 3 개의 13 볼트 펄스가 발견되었으며, 각 펄스 사이에는 100 밀리 초가 있습니다.

이낭이 고르게 측면에 위치하도록 전극을 삽입하고 한 전극은 이낭 표면에, 다른 전극은 이낭 깊숙한 곳에 위치하도록 합니다. 다음으로, 풋 페달을 사용하거나 전기천공이 완료되면 스위치를 눌러 전류를 인가합니다. 아로스에 생선 물을 붓고 유리 피펫을 사용하여 접시를 부드럽게 휘젓아 배아를 제거합니다.

제거하기 어려운 배아의 경우 배아가 손상되지 않도록 주의하십시오. 바늘을 사용하여 주변의 LMPA를 부드럽게 부수십시오. 배아를 메틸렌 블루 피쉬 물이 담긴 플레이트로 옮기고 형태학적 면역조직화학을 위해 원하는 단계로 배아를 올립니다.

C two hybridization 및 microscopic analysis에서는 morphos의 귀 주입 및 electroporation의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. PM으로 표시된 후방 또는 청각 황반은 Phin red로 표시된 물고기의 청각 기관 중 하나입니다. 이 사진에서 감각 유모 세포의 입체섬모에 있는 액톤 다발은 탁구에 빨간 점으로 나타납니다.

수정 3일 후 MIF morphs를 주입한 배아인 Phin을 사용한 형광 표지에서 볼 수 있는 패들 모양의 황반은 전기와 주입된 동일한 연령의 배아와 비교할 때 유모 세포의 입체섬모 내에서 더 많은 액틴 필라멘트만 보여줍니다. 그러나 표준 대조군 모르포를 사용한 주입 및 전기천공은 모르포만 주입한 것에 비해 F와 염색이 감소하지 않았습니다. 결과는 후방 황반에서도 비슷하지만, MIF Morphoses만 주입한 배아와 비교했을 때 주입 및 전기천공된 유충에서 5일 후에는 덜 극적이었습니다.

표준 제어 morph를 사용할 때 주입만 하는 것과 전기천공을 사용한 주입 사이에는 차이가 없었습니다. 아세틸화된 튜불린에 대한 항체로 염색된 이 배아는 MIF Morphoses의 주사나 전기천공을 받지 않았습니다. 이 배아는 전기천공을 받았지만 주사를 맞지 않았다.

두 배아 모두 정상적인 아세틸화 튜불린 염색을 보여줍니다. 이 배아는 주입과 전기천공을 모두 수행했습니다. 그들은 대조군에 비해 튜불린 염색이 눈에 띄게 감소했으며 귀 관련 및 주변 신경절과 관련된 신경 돌기가 훨씬 적었습니다.

대조군 모르포를 주입 및 전기천공에 사용했을 때, 우리는 튜불린 염색 정도의 감소를 못했으며, 한 번만 마스터한 모르포의 주입과 비교할 때 음향 신경절에 의한 신경분포의 감소를 못했습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술의 가장 어려운 부분은 전기천공법이며, 뇌를 손상시키지 않도록 특별한 주의를 기울여야 하며, 날카로운 전극은 이 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다.