Name: 사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 제브라피시(Danio rerio) 내이 발달 연구를 위한 마이크로인젝션 및 전기천공 기법을 활용한 MIF 모르필리노 표적 전달 방법. 이 기술은 내이 특이적 유전자 기능을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 KFB에 난청 연구 재단에서 YC S 및 NSF (IOS 0,930,096)를 부여 지원했다. KFB : NIH / NINDCD이 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184 - 08W1</a> , NSF DBI 0,832,862, NSF IOS 0,930,096

1. Electroporation에 대한 전극 만들기 <ol><li> 적당한 길이의 75 μm의 직경의 텅스텐 와이어를 (AM 시스템즈 Carlsborg, WA) (약 3-5센티미터) 컷 </li><li> molex 케이블 커넥터 (핀 스탬프 황동)를 통해 텅스텐 와이어를 넣어 </li><li> 랩 텅스텐 와이어 및 축소 튜브 (SPC 기술, 시카고, 일리노이)와 와이어로 축소 튜브를 밀봉하기 위해 알콜 램프 또는 열 총을 들고 열을 적용과 molex 케이블 커넥터 </li><li> 텅스텐 와이어의 팁을 선명하게하려면, 1.0 N의 수산화 나트륨에 와이어를 찍어 (콘라드 외. 1993)하고, 다른 전극으로 종이 클립을 사용하여, 스퀘어 웨이브 Electroporator와 와이어를 전해하다. 우리가 사용하는 조건은 펄스 사이에 50 MS 각 지속적인 100 MS 5 50 볼트 펄스입니다. 전극은 15-20 μm의의 직경을 날카롭게한다 </li><li> electroporation에 사용하기 전에 모델링 흙으로 눌러 홈 이내 트레이에서 전선을 유지 </li></ol> 2. Electroporation 스테이션 설정 <ol><li> 테이프 micromanipulators (세계 정밀 장비)에 75μm 텅스텐 전극을 날카롭게. </li><li> 해부 현미경 스테이지 (Leica)의 양쪽에 플레이스 micromanipulators. </li><li> 보호 뀨이 - 21 수정 스퀘어 웨이브 Electroporator (그림 1)에 전극을 연결합니다. </li><li> electroporator 켜고 전압, 펄스 기간, 그리고 펄스의 수를 포함하여 electroporation에 대한 매개 변수를 설정합니다. 이 실험에 대한 가장 효과적인 매개 변수는 각 각 펄스 사이에 100ms와 5.0ms 동안 지속 세 13 볼트 펄스로 발견되었다. electroporation은 배아에서 공기 방울을 만드는 경우, 펄스 길이를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 3. Zebrafish 귀의 소포으로 Morpholinos의 Microinjection <ol><li> 번식 탱크에서 수확 zebrafish의 배아. 에서 배아를 품어 배아 육아 ° C 하룻밤 28.5에서 0.3 PPM 메틸렌 블루 (웨스 터, 2005)와 매체를. </li><li> 서터 P - 97 전극 풀러와 유리 바늘을 당겨 </li><li> 37 아가로 오스 겔 기지 (10mm 페트리 접시에 생선 물 1퍼센트 아가로 오스) 워밍업 ° C 물 목욕으로 </li><li> 생선 물 열 1% 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMPA)까지 녹아 및 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻하게 유지. </li><li> morpholino 솔루션 (GeneTools, 코르 발리스, OR)와 유리 바늘을 작성하고 적절한 직경에 대한 제보를 잘라. micromanipulator (쿤)에 주사 바늘을 탑재합니다. </li><li> 약 10 μm의에 바늘 끝부분을 잘라 끝 morpholino 솔루션의 충분한 공급을 허용하도록 미네랄 오일에 주입. </li><li> 24 시간 postfertilization (HPF)에서 배아를 Dechorinate 및 0.3 PPM의 메틸렌 블루 피시 물에 MS222 (tricaine, 시그마)으로 그들을 마취. </li><li> 편리 유니폼을 분석 오른쪽 위로와 아가로 오스 겔베이스에 3-5 anesthetized 배아 정렬 </li><li> 각각의 배아 이상 1 % LMPA 1 ~ 2 방울을 넣어 보자 자리에서 배아를 해결하기 위해 응고 </li><li> 귀의 소포가 오른쪽에 있도록 페트리 접시를 회전 </li><li> 귀의 소포의 루멘에 바늘을 놓고 부착된 질소 탱크 (그림 2)와 PV820 공압 PicoPump (세계 정밀 악기)와 morpholino 솔루션을 주입 </li></ol> 4. Electroporation 절차 <ol><li> 즉시 주사 후 electroporation 역에 탑재된 배아를 이동 </li><li> 귀의 소포 단 후부 조직에 긍정적인 전극을 플레이스하지만, 침투하지 마십시오 귀의 소포로 단지 앞쪽에 두뇌에 부정적인 전극을 삽입 </li><li> 발 페달이나 스위치를 눌러서을 사용하여 현재 적용합니다. </li><li> 아가로 오스의 물고기 물을 붓고하고 소용돌이와 유리 피펫와 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 배아를 손상하지 않도록주의하시기 바랍니다. 제거하기 어려운 배아 들어, 부드럽게 배아를 둘러싼 모든 LMPA 멀리 휴식하기 위해 바늘을 사용합니다. </li><li> 메틸렌 블루 피시 물 및 분석을위한 원하는 단계 (현장 하이브리드화 등 및 미세한 anlaysis에 immunohistochemical, 형태학의)에 배아를 높이와 함께 접시에 장소 배아. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Electroporation 역. 전극 날카롭게 75μm 텅스텐 와이어를 사용하여 만든 보호 뀨이 - 21 수정 스퀘어 웨이브 Electroporator로 연결로 연결되어 있었다. 이 전극은 micromanipulators이 테이프로 붙여져 있었다. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 사출 역. 모든 배아는 표준화 목적으로 오른쪽 귀에 주입했다. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 3 DPF의 배아와 굴지의 필라멘트의 그림 3. Phalloidin의 얼룩. (A) 3 DPF의 배아 injecte제어 MO와 D는 사후 망막의 황반 (PM)에 phalloidin 강한 얼룩이 있습니다. (B) 제어 MO로 주입 후 electroporated되었다 난자는 주사에만 배아에서 오후 phalloidin의 얼룩 비슷한 수준을했다. electroporation와 함께 MIF 수법의 살인인의 주입은시 (D)에서 phalloidin의 얼룩의 극적인 감소가 발생하면서 (C) 혼자 귀의 소포로 MIF 수법의 살인인과 사출이 phalloidin의 얼룩의 감소가 발생하지 않았다. 오전, 앞쪽에 망막의 황반. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 5. DPF의 애벌레와 굴지의 필라멘트의 Phalloidin의 얼룩. 이 주사 사이에 차이는 없었다 (A) 및 표준 제어 morpholino가 (B) 사용되었다 electroporation와 함께 주입. 그러나, MIF morpholinos와 electroporated로 주입되었다 5 DPF의 애벌레는 MIF morpholinos (C를 주사 맞은 배 (胚)에 비해 3 DPF 이상하지만 덜 극적인 뒷부분 망막의 황반 (PM) (D)에서 phalloidin의 얼룩을 감소했다 ). 오전, 앞쪽에 망막의 황반. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 3 DPF에서 배아의 Acetylated tubulin의 얼룩. (A)의 배 (胚)는 주사 또는 electroporation을받지 못했습니다. (B)의 배 (胚)는 electroporated하지만 주사를받지 않았다. MIF morpholinos와 함께 주입하여 electroporation (C, D)를 모두받을 수 배아 컨트롤에 비해 가시 감소 tubulin의 얼룩을했다. (PM, 사후 망막의 황반). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 컨트롤 morpholino 3 DPF에서 배아의 Acetylated tubulin의 얼룩. (A) 어떠한 치료를하지 않고 난자는 사후 망막의 황반 (PM)와 광범위한 innervation에 강한 acetylated tubulin의 얼룩을 보여주었다. (B) 난자는 제어 morpholino 주사. (C) 난자는 오직 electroporation과 치료. (D) 주입 및 제어 electroporated morpholino와 컨트롤 난자는 치료없이 컨트롤에 비해 뒷부분 망막의 황반과 innervation의 acetylated tubulin 비슷한 수준을했다.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

문서의 생산은 비디오와 텍스트에 언급된 시약을 생산 유전자 도구, LLC에 의해 후원되었다.

우리는 성공적으로 24 HPF의 zebrafish 배아의 귀에에 안티 센스 oligonucleotide의 수법의 살인인를 도입했습니다. 분사와 electroporation 이후 자랐던 공룡의 태아가 가능한되었습니다. 배아의 electroporation에서 살아남는다면, 그들은 치료뿐만 아니라 전용 주입에만 electroporated 있었다 배아 있었다 배아를받은 적이 없음 배아에 비해 정상적인 속도로 증가했다. 우리는 phalloidin과 acetylated tubulin과 라벨을 통해 귀 분사와 electroporation 후 MIF 및 MIF 같은 수법의 살인인의 효과를 관찰했다. 뒷부분 망막의 황반의 감각 세포에있는 굴지의 필라멘트의 Phalloidin의 얼룩은 수법의 살인인로 주입되었다 배아에 비해 머리카락 세포 및 / 또는 stereocilia 번호의 변화를 일으킨 MIF와 24 HPF 단계에서 MIF와 같은 MO의 electroporation을 나타냅니다 (그림 3). 헤어 셀 번호에있는이 감소는 쉔 외의 결과와 일치합니다. (제출) MIF 및 MIF처럼하는 수법의 살인인 걸 saccular 망막의 황반에있는 세포의 수를 감소의 원인이되는. 그 electroporation을 설명 수법의 살인인 및 electroporated로 주입되었다 태아의 머리 세포 숫자의 감소함으로써 귀의 소포에만 주입어진 배아에 비해 형태학의 효과의 범위를 증가, 세포막에 걸쳐 수법의 살인인 이동에 도움이됩니다. statoacoustic 신경절의 형태의 변경은 acetylated tubulin의 얼룩을 통해 관찰했다. statoacoustic 신경절에 의해 innervation의 범위는 주입과 공연이 neurites (그림 5)의 분기 감소 electroporated되었습니다 배아으로 영향을했습니다. acetylated tubulin의 얼룩이 크게 주입하고 electroporated 있었다 모두 배아 감소하기 때문에 또한, ganglionic 세포 및 / 또는 신경절 세포의 감소 번호 결로가 발생 감소있을 수 있습니다. MIF는 신경 시스템 개발 (스즈키 외., 2004)에 중요한 것으로 표시 되었기 때문에, electroporation 후 본 변경 사항은 MIF 및 MIF 같은 neuroblast 세포에 MO 솔루션입니다. 증가 transfection 결과 수 있습니다 직접 개발 조직으로 안티 센스 oligo morpholinos의 Electroporation은 배아에서 조직 개발하는 동안 유전자 모두 공간과 temporally의 표현을 제어하기위한 유용한 도구입니다. MIF와 내이 (内耳)의 조직에 수법의 살인인 MIF처럼의 Electroporation은 사후 망막의 황반과 statoacoustic 신경절 모두 비정상적인 형태의 결과. 어느에만 주사 또는 유일한 electroporated했다 배아 또는 전혀 치료를받은 적이 없음 배아에 비해 주입하고 electroporated 있던 태아의 사후 망막의 황반에있는 감각 세포의 수가 감소가 발생했습니다. statoacoustic 신경절 및 SAG의 크기에 의해 사후 감각 패치 innervation의 정도에 감소도 발생했습니다. Electroporation 원하는 조직에서 특정 DNA, RNA, 또는 MO의 주요 효과를 관찰하고 다른 조직에있는 보조 효과에서 이들을 차별, 뇌, 신경 문장을 포함하여의 이익과 특정 조직에 macromolecules를 transfecting위한 가치있는 방법입니다 내이 (内耳)의 개발에 periotic mesenchyme (Barald와 켈리, 2004).

<ol><li> 수법의 살인인 : 0.3 MIF, MIF 같은 MO1에 대한 조합의 MM, 그리고 MIF 같은 MO2 사용되었다. 5&#39; - acatcggcatgactgcgacagagat - 3 &#39;MIF MO은 zebrafish MIF의 mRNA의 시작 코돈으로 무료입니다. 두 수법의 살인인는 MIF와 같은 사용되었습니다 MIF ​​MO1 같은 translational 시작 사이트 무료입니다. MO2 MIF와 같은 intron1/exon이 경계에서 순서 AS에서 파생된 반면, 5&#39; - GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA - 3 &#39;5&#39; - GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC &#39;-3. 5&#39; - CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA - 3 &#39;제어 수법은 진 도구에서 발진 뉴클레오 티드 시퀀스되었습니다. </li><li> 생선 물속에 메틸렌 블루 (0.3 PPM) </li><li> MS222 (tricaine, 시그마, 생선 물 속에 0.64 ㎜) </li><li> 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMPA, 로체) </li><li> 페놀 레드 (시그마) </li><li> 안티 acetylated tubulin (시그마) </li><li> 알렉사 플루어 ® 488 염소 방지 마우스 두번째 항체 (분자 프로브) </li><li> 텍사스 붉은 phalloidin (분자 프로브) </li></ol>

사출 및 electroporation에 의해 zebrafish otocyst으로 mif morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

최근에는 electroporation은 눈, 뇌 및 zebrafish의 somites 등 다양한 조직로 DNA, RNA, 그리고 morpholinos의 생체내 transfection에 대한 인기가 기술되고있다. 유전자 조작의 다른 방법 이상의 electroporation의 장점은 특정 조직은 전류의 응용 프로그램에 의해 macromolecules의 도입을 위해, 두 공간과 temporally, 타겟이 될 수있다는 것입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 개발 내이 (内耳)의 조직에 MIF 및 MIF 같은 morpholinos를 transfecting위한 electroporation의 사용을 설명합니다. 과거 연구에서는 MIF morpholino은 1 배아에 주입 - 8 세포 단계에 확산 형태학의 신경계 및 안구의 변화뿐만 아니라 귀에 결과. 개발 나중 단계에서 내이 (内耳)의 조직을 대상으로하여, 우리는 다른 조직의 영향에서 발생할 수 있습니다 보조 효과를 반대로 개발 내이 (内耳)에서 MIF의 주요 효과를 확인할 수 있습니다. 뉴런,의 연결을 처리하고, 사후 망막의 황반과 관련된 세포의 형태를 연구 얼룩 phalloidin 및 acetylated tubulin을 사용함으로써, 우리는 zebrafish 내이 (内耳)에서 타겟으로 transfection을위한 방법으로 electroporation의 효능을 평가할 수 있었다. 24hpf 배아의 귀의 vesicles는 morpholinos와 electroporated로 주입되었고 그 어떤 치료를받은 적이 없음 또는 유일한 주입 또는 electroporated 있었다 배아에 비해했다. 주입 및 electroporated했다 공룡의 태아가 머리 셀 번호의 감소를 보여주 statoacoustic 신경절 (SAG)과 통제 그룹에 비해 적은 세그 뉴런에 의해 innervation을 감소. 결과는 나중 단계에서 otocysts에 morpholinos의 직접 배달은 불특정 신경계와 1-8 세포 단계에서 제공 morpholinos의 신경 크레스트 효과를 피할 것으로 나타났다. 또한 허용하는 내이 (内耳)와 뇌, 신경 문장 또는 periotic mesenchyme에 기본 효과의 귀가 아닌 보조 효과로 이동 효과 시험.

24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.

사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

최근 몇 년 동안 전기천공법은 ...를 포함한 다양한 조직에 DNA, RNA 및 모르폴리노(morpholino)를 체내(in vivo)로 형질전환시키는 대중적인 기술이 되었습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 수정 후 1일 또는 24시간 단계의 제브라피시 이낭(otic)에 안티센스, 올리고뉴클레오타이드, 모르포(morph), 또는 기타 발달 저해 분자를 직접 전달하는 것입니다. 본 예시에서는 정적 청신경절(static acoustic ganglion) 발달을 담당하는 초기 뉴로트로핀이자 면역 체계 사이토카인인 대식세포 이동 저해 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF)에 대한 모르포를 사용하여, 이 분자에 대한 모르포가 내이 발달 또는 신경 발생에 영향을 미치는지 확인합니다. 이는 먼저 미세주입법을 통해 이낭의 내강(lumen)으로 모르포를 도입한 후, 내강에서 이낭 세포로 모르포의 침투를 촉진하는 전기천공법(electroporation)을 수행함으로써 이루어집니다.다음으로, 모르포(morpho)가 내이 발달 및 신경 발생에 미치는 영향을 관찰하기 위해 배아를 28.5 °C에서 배양합니다. 이후 며칠 동안, 면역조직화학 및 염색법을 통해 내이 감각모세포의 감소와 평형청각신경절(stato acoustic ganglion)에 의한 신경 지배의 감소를 보여주는 결과를 얻습니다. 이때 각각 운동성 섬모(kinocilia)의 acetylated tubulin과 모세포 표면 정모(stereocilia)의 actin을 표지합니다. 우리는 닭 배아에 모르포를 주입하고 전기천공하는 이 방법을 연구실의 매우 재능 있는 학부생과 함께 처음으로 개발했습니다.Katie Holmes는 이를 제브라피쉬 크기에 맞게 성공적으로 축소했습니다. 박사후 연구원인 Yuchi와 대학원생 Matt Wyatt, 그리고 실험실의 이전 박사후 연구원이었던 Deb Thompson을 포함한 현재의 연구팀이 제브라피쉬에 맞게 이 기술을 정교화했습니다. 이 방법은 발생 생물학 및 청각 연구 분야의 핵심적인 질문들에 답할 수 있기를 기대하며, 예를 들어 귀와 같은 기관 시스템에 미치는 특정 형태 형성 인자의 영향이 여러 기관 시스템에 영향을 주어 결과적으로 귀에 2차적인 영향을 미치는 일반적인 발생 효과(예: 뇌에 영향을 주어 2차적으로 귀에 영향을 미치는 경우)와 구분될 수 있는지 여부 등이 이에 포함됩니다.1~4세포기 단계에서 수행하는 미세 주입과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 후기 단계에서 귀로 모르포제네틱 단백질(morphogens)을 직접 주입할 수 있다는 점입니다. 따라서 뇌에 미치는 모르포제네틱 단백질의 직접적인 영향과 내이(inner ear)에 나타나는 이차적인 영향을 구분하여 관찰할 수 있습니다. 전극을 제작하려면, 먼저 직경 75 µm의 텅스텐 와이어를 약 3~5 cm 길이로 절단하십시오. 절단한 텅스텐 와이어를 Molex 케이블 커넥터에 끼우십시오.다음으로, 텅스텐 와이어와 Molex 케이블 커넥터를 수축 튜브로 감싼 후, 분젠 버너나 히트 건으로 열을 가하여 수축 튜브를 와이어에 밀착시켜 밀봉합니다. 그런 다음 텅스텐 와이어의 팁을 날카롭게 만들기 위해, 와이어를 일반 수산화나트륨 용액에 담그고 종이 클립을 상대 전극으로 사용하여 사각파 전극으로 와이어를 전기분해합니다. 이때 사용되는 조건은 50 V 펄스를 5회 가하는 것이며, 각 펄스의 지속 시간은 100 ms, 펄스 사이의 간격은 50 ms입니다.전극의 팁을 1N 수산화나트륨 용액에 담근 상태에서 3회 반복 측정합니다. 전극을 수산화나트륨 용액 속으로 약간 더 깊게 삽입하고 1회 더 반복 측정합니다. 전극을 더 깊게 삽입하되, 앞선 단계와 거의 동일한 거리만큼 추가로 전진시킨 후 마지막으로 1회 더 반복 측정합니다.단계별 연마를 통해 전극의 끝을 매우 가늘게 만들면, 발달 중인 제브라피시 배아에 전극을 삽입할 때 손상을 줄이고 더 정확하게 삽입할 수 있습니다. 제브라피시 이낭(otic vesicle)에 morphino를 미세 주입하기 위한 전기천공법 사용 전까지, 와이어를 트레이 안의 모델링 클레이에 눌러 고정해 두십시오. 먼저 저녁 시간에 수컷과 암컷을 분리할 수 있도록 플라스틱 구분판이 있는 교배 수조를 준비하십시오.수컷 4마리와 암컷 4마리를 수조에 넣고, 14:10 명암 주기가 설정된 배양실에서 하룻밤 동안 유지합니다. 다음 날 아침 전등이 켜지면, 칸막이를 제거하고 약 20~30분 동안 물고기를 그대로 둡니다. 수컷과 암컷을 분리하고, 번식 수조에서 번식 개체들을 꺼냅니다.신선한 어류수로 채워진 수조에 넣으십시오. 알이 포함된 물을 체에 부어 번식 수조에서 배아를 수확하십시오. 알을 페트리 접시에 옮기기 전, 체에 담긴 상태에서 신선한 알수로 여러 번 헹구십시오.수정되지 않았거나 불투명한 난자는 제거하고, 0.3 PP m 메틸렌 블루가 포함된 배아 배양액에서 배아를 28.5 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 주입 직전에 Sutter P 97 전극 풀러를 사용하여 유리 니들을 뽑아냅니다. 10 mm 페트리 접시에 담긴 어류용수로 만든 1% AGROS 젤 베이스를 항온수조에서 37 °C로 가온하고, 어류용수로 만든 1% 저융점 AGROS 또는 LMPA를 녹을 때까지 가열한 후 37 °C 항온수조에서 따뜻하게 유지합니다.유리 바늘에 morpho 용액을 채우고 팁을 적절한 직경으로 자릅니다. 직경은 약 10~15 microns입니다. 주사 바늘을 질소 탱크가 연결된 PV eight 20 공압 피코 펌프에 부착된 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 수정 후 24시간이 지난 배아의 난막을 제거하고, 0.3 PPM methylene blue가 포함된 fish water 내의 trica로 마취시킵니다.다음으로, 편리하고 균일한 분석을 위해 마취된 배아 3~5개를 오른쪽 면이 위로 오도록 AROS 겔 베이스 위에 정렬하고, 각 배아 위에 1% LMPA를 1~2방울 떨어뜨려 응고시켜 배아를 고정합니다. 이소낭이 오른쪽에 오도록 페트리 접시를 회전시킵니다. 그런 다음 바늘을 이소낭의 내강에 삽입하고 풋 페달을 사용하여 morpho 용액을 주입합니다.미세주입 직후, 장착된 배아를 전기천공 스테이션으로 옮겨 전기천공 장치를 설정합니다. 먼저 끝을 뾰족하게 만든 75 µm 텅스텐 전극을 마이크로 조작기에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 마이크로 조작기를 해부 현미경 스테이지 양측에 배치합니다.전기천공기를 켜고 전기천공 파라미터를 설정합니다. 본 실험에서 가장 효과적인 파라미터는 13 volt 펄스를 2 milliseconds 간격으로 3회 가하며, 각 펄스 사이에는 100 milliseconds의 간격을 두는 것으로 확인되었습니다.이삭(otic vesicle)의 표면과 심면에 각각 전극이 하나씩 위치하여 이삭이 양쪽 전극 사이에 균등하게 놓이도록 전극을 삽입합니다. 다음으로, 풋 페달을 밟거나 스위치를 눌러 전류를 가하고 전기천공법(electroporation) 과정을 마칩니다. 아가로스(agarose) 위에 어류용 배양수를 붓고, 유리 피펫을 사용하여 플레이트를 부드럽게 흔들며 배아를 회수합니다.제거하기 어려운 배아의 경우 배아가 손상되지 않도록 주의하십시오. 바늘을 사용하여 배아 주변의 LMPA를 조심스럽게 제거합니다. 배아를 메틸렌 블루가 포함된 어류 사육수로 채운 플레이트로 옮기고, 형태학적 면역조직화학 염색에 필요한 단계까지 배아를 성장시킵니다.C의 이중 하이브리다이제이션 및 현미경 분석에서, morphos의 귀 주입 및 전기천공법의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. Phin red로 염색된 후맥반(posterior or auditory macular, PM)은 물고기의 청각 기관 중 하나입니다. 이 사진에서 감각모세포의 부동모(stereocilia)에 있는 acton 다발은 핑퐁 위에서 붉은 점으로 나타납니다.MIF morphs만 주입한 수정 후 3일 된 배아의 Phin 형광 표지를 통해 관찰한 패들 모양의 반점(macula)에서는, 전기천공법과 주입을 모두 수행한 동일 연령의 배아와 비교했을 때 모세포의 부동모(stereocilia) 내에 더 많은 액틴 필라멘트가 관찰됩니다. 그러나 표준 대조군 morpho를 주입하고 전기천공법을 시행했을 때는 morpho만 주입했을 때와 비교하여 F 염색의 감소가 나타나지 않았습니다. 후방 반점에서도 유사한 결과가 나타났으나, MIF Morphoses만 주입한 배아와 비교했을 때 주입 및 전기천공법을 수행한 5일 된 자어에서는 그 차이가 덜 뚜렷했습니다.표준 대조군 morph를 사용했을 때, 주입만 한 경우와 전기천공법을 병행하여 주입한 경우 사이에 차이가 없었습니다. acetylated tubulin에 대한 항체로 염색된 이 배아는 MIF Morphoses의 주입이나 전기천공법을 거치지 않았습니다. 이 배아는 전기천공법을 거쳤으나 주입은 이루어지지 않았습니다.두 배아 모두 정상적인 acetylated tubulin 염색 양상을 보입니다. 이 배아들은 모두 주입 및 전기천공법이 수행되었습니다. 대조군과 비교했을 때 tubulin 염색이 눈에 띄게 감소하였으며, 귀와 관련된 신경 돌기 및 주변 신경절과 관련된 신경 돌기가 훨씬 더 적게 나타났습니다.대조군 morpho를 주입 및 전기천공에 사용했을 때, morpho만 주입한 경우와 비교하여 acetylated tubulin 염색 범위의 감소나 청신경절(acoustic ganglion)에 의한 신경 지배의 감소가 관찰되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 약 2시간 정도 소요됩니다. 이 기술에서 숙달하기 가장 어려운 부분은 전기천공이며, 특히 뇌가 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 끝이 날카로운 전극을 사용하면 이 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

이 프로토콜은 꼬리에 모르폴리노 주입에 의한 제브라피쉬의 유전자 발현의 표적 녹다운을 설명합니다.

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이 문서에서는, 우리는 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 성인 제브라 피쉬 telencephalon의 심실 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성인 척추 뇌 기능 연구에 사용할 수있는 효율적이고 빠른 프로토콜로이 방법을 제시한다.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

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배우세요 제브라피시(Danio rerio) 내이 발달 연구를 위한 마이크로인젝션 및 전기천공 기법을 활용한 MIF 모르필리노 표적 전달 방법. 이 기술은 내이 특이적 유전자 기능을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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