마우스의 전통 NASA Hindlimb 하역 모델 Alternant 방법

본 절차의 전반적인 목적은 동물의 스트레스를 최소화하는 더 간단하고 직접적인 방법을 통해 마우스의 후지 하중 제거(hind limb unloading, hu)를 수행하는 것입니다. 이 꼬리 고정법은 전반적인 건강과 체중을 저하시키지 않으면서 후지 위축을 성공적으로 유도합니다. 첫 번째 단계는 성체 마우스에 테일 링(tail ring)을 이식하는 것입니다.

연구 전반에 걸쳐 체중과 건강 상태 관찰 내용을 기록하는 것이 중요합니다. 그다음 후지 하중 제거 장치를 조립하여 하중 제거가 진행될 케이지 안에 배치합니다. 동물이 회복되면, 하중 제거 절차를 위해 해당 장치에 배치합니다.

최종적으로, 체중과 근육량 측정을 통해 비하중 상태의 마우스 후지에서 근위축이 나타남을 확인하여 결과를 얻을 수 있습니다. Maori Holton 테이핑 기법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 꼬리 피부가 항상 노출되어 있다는 점입니다. 마우스는 현수 장치에서 탈출하거나 링을 가지고 놀 수 없으며, 회복이 더 빠르고 안정적인 체중을 유지합니다.

이 방법은 근골격계 생리학 분야뿐만 아니라 중력 및 우주 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 장기간의 신체 활동 부족, 침상 안정, 사지 고정, 미세 중력, 신경근 질환 및 노화로 인한 골격근 위축과 골 손실을 어떻게 예방할 수 있는지가 이에 해당합니다. 저희는 Maury Holden 꼬리 테이핑 기법을 사용하며 겪은 문제들로 인해 처음 이 아이디어를 얻게 되었습니다. 마우스가 뒷다리 장치에서 탈출함으로써 동물을 잃고 실험 데이터가 소실되는 일이 지속적으로 발생했기 때문이며, 이에 본 기법을 시연하고자 합니다.

오늘은 저희 실험실의 선임 연구원인 Andre's Ferrara 님과 함께하겠습니다. Andre's 님을 보조하기 위해 실험실의 박사 과정 학생인 Jacqueline Chrissy 님과 학부생인 Andrew Dunn 님이 함께 참여하였습니다. 먼저 수술 부위를 멸균하고, adult mouse인 anise the Ty를 isof fluorine으로 마취한 후, 마우스의 체중을 기록하고 가열 패드 위에 놓습니다. chlorhexidine 용액으로 문질러 닦아 수술을 위한 꼬리 준비를 마칩니다.

꼬리 기저부의 체모가 끝나는 지점부터 수를 세어, 꼬리의 두 뼈 돌출부 사이에 있는 다섯 번째, 여섯 번째 또는 일곱 번째 추간 공간의 위치를 찾습니다. 지혈 겸자와 20 5G 바늘을 사용하여 두 척추뼈 사이의 추간 공간에 가이드 구멍을 만듭니다. 바늘을 제거하고 스틸 봉합사를 삽입합니다.

구멍을 통해 10 centimeter 길이로 자릅니다. 봉합사의 5 centimeter 부분이 꼬리 양쪽으로 돌출되어야 합니다. 엄지손가락 끝을 꼬리 위에 올리고, 반대쪽 손을 사용하여 스틸 봉합사를 엄지손가락 주위에 감습니다.

끝부분을 비틀어 큰 루프를 만듭니다. 감긴 부분 또는 원형 부분의 길이는 ±3 mm여야 합니다. 지혈鉗子(hemostat)로 봉합사의 한 가닥을 고정하고 이를 구부려 더 작은 루프를 만들며, 이 루프의 끝부분을 원래의 큰 루프에 있는 비틀린 부분에 최대한 가깝게 부착합니다.

여분의 와이어를 잘라내고 꼬인 와이어를 뒤로 구부립니다. 질산은 스틱을 사용하여 과도한 출혈을 지혈합니다. 수술 후 후지 부하 제거(hind limb unloading 또는 hu)를 실시하기 전까지 동물을 5~7일 동안 회복시킵니다.

꼬리 링이 서로 엉키는 것을 방지하기 위해 마이저 하우스(miser house)를 단독으로 배치합니다. 가슴 우리 상단에 1인치 와이어가 있는 3/8인치 두께의 도금 슬롯형 강철 바를 얹고 테이프로 고정합니다. 와셔와 윙 너트를 추가로 장착하되, 나중에 조정할 수 있도록 완전히 조이지는 마십시오.

보빈이 빠지는 것을 방지하기 위해 보빈의 중앙 구멍으로 기계 나사를 삽입하십시오. 기계 나사의 끝에 나일론 락 너트를 조이십시오. 보빈은 자유롭게 회전할 수 있어야 합니다.

낚시용 회전 도래의 스냅 후크를 보빈의 하단부에 끼웁니다. 플라이어를 사용하여 종이 클립을 S자 모양의 후크로 만듭니다. S자 후크의 한쪽 끝을 낚시용 회전 도래의 구멍에 넣고 플라이어로 꽉 집어 고정합니다.

U자형 와이어를 케이지 내부의 기계 나사와 평행하게 배치하고 끝부분을 측면 너머로 구부립니다. 물병 전체를 지지하려면, 스피곳(spigot)이 아래를 향하되 바닥에 닿지 않도록 U자형 와이어에 물병을 삽입합니다. 덕트 테이프를 사용하여 물병을 케이지에 고정합니다.

2인치 바인더 클립을 구부려 열어두되, 뒷다리 하중 제거 절차 전 펠렛을 으깨지 않고 음식 몇 조각을 고정할 수 있을 정도의 장력을 유지합니다. 비교 분석을 위해 마우스의 체중을 기록합니다. 이후 S자형 훅의 열린 끝부분을 꼬리에서 돌출된 작은 링에 끼웁니다.

기계 나사의 하단 윙 너트를 조이거나 풀어 마우스의 높이를 조절하십시오. 뒷다리에 체중이 실리지 않아야 합니다. 최적의 높이가 되면 상단 윙 너트를 조이고, 마우스가 뒷다리로 급수 밸브 위로 올라갈 수 없도록 새로운 모양의 와이어로 물병의 위치를 조정하십시오.

연구 기간 동안의 사료 섭취량을 측정하기 위해, 바인더 클램프에 넣기 전 펠릿의 무게를 잽니다. 하루에 약 5~6g의 사료를 섭취할 수 있도록 약 8~10g을 제공합니다. 마우스 한 마리당, 마우스가 위로 올라갈 수 없도록 사료가 담긴 바인더 클램프를 케이지 바닥에 배치하고 덕트 테이프로 고정합니다.

2x2인치 크기의 고어(Gore) 두 장을 느슨하게 사용합니다. 꼬리 부분을 낚시용 스위벨(swivel)에 감습니다. 꼬리의 작은 조각을 고어 주변으로 감아 고어를 꼬리에 고정합니다.

이 단계는 꼬리가 아래로 처져 혈액이 끝부분으로 쏠리고 꼬리가 괴사하는 것을 방지하는 데 중요합니다. 케이지 반대편에 있는 다른 동물에 대해서도 동일한 절차를 반복하십시오. 케이지당 두 마리의 동물을 수용할 때는 서로 거의 닿을 수 있을 정도의 간격을 두고 배치하십시오.

케이지 중앙에 위치시킵니다. 쥐가 둥지를 틀 수 없을 정도의 소량의 옥수수 속대 베딩을 케이지에 추가합니다. 후지 unloading 절차가 끝나면, 장치에서 동물을 꺼내고 꼬리 링을 제거합니다.

와이어 커터를 사용하여 체중을 기록하고 동물을 회복을 위해 홈 케이지로 돌려보냅니다. 회복 기간이 지난 후, 동물을 다시 대기시킨 다음 가자미근과 부신 질량을 측정합니다. 꼬리 절단 수술 전의 체중은 수술 5일 후 및 hu 전의 체중과 유의미한 차이가 없었습니다.

14일 및 28일 동안의 후지 현수(hind limb unloading) 결과, 체질량이 소폭 감소했으나 통계적으로 유의미하지 않았으며, 생쥐들은 HU 종료 후 3일의 회복 기간을 거쳐 HU 이전의 체중으로 완전히 회복되었습니다. 보행 제어군 생쥐와 HU 군 생쥐의 사료 섭취량이 여기에 표시되어 있습니다.

28일 동안 HU 처리군 마우스의 일일 평균 식이 섭취량은 대조군과 차이가 없었습니다. HU 처리 후 14일과 28일째에 유의미한 가자미근 위축이 관찰되었으며, 이는 3일간의 회복기 이후 효과적인 절차임을 나타냅니다. 가자미근 질량은 두 HU 그룹보다 유의미하게 컸으나, 보행 대조군 동물보다는 여전히 유의미하게 적었습니다.

동물의 스트레스 지표를 제공하기 위해 좌우 부신을 모두 절제하여 무게를 측정하였습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 대조군 쥐와 HU 쥐 간의 평균 무게는 비슷했습니다. 숙달되면, 테일러링 수술은 쥐 한 마리당 5~10분 이내에 완료할 수 있으며, 이 절차 이후 케이지 설정은 15분 이내에 완료될 수 있습니다. 근육 및 골격계가 이러한 장기간의 불용 상태에서 어떻게 회복하고 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 쥐를 이용한 Hein, 사지 재부하 및 불용성 위축 회복과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이제 이 영상을 통해 마우스의 후지 하중 제거(hind limb unloading)를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 기술을 통해 심혈관계, 근골격계 및 간질과 같은 다양한 조직과 시스템을 하중 및 재하중 조건 하에서 연구할 수 있으며, 녹아웃(knockout) 또는 녹인(knockin)과 같은 다양한 마우스 모델을 활용할 수 있습니다.