Name: 골격근에서 Progenitors의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 생쥐 골격근에서 근성 및 지방성 전구세포를 효소 소화와 유세포 분석으로 정화하는 방법입니다. 이 기술은 조직 재생 연구와 세포 치료 개발에 필수적인 도구를 제공합니다.

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1. 조직 컬렉션 : <ol><li> 7 일 사이와 12 주 된 마우스를 사용합니다. 보통, 적어도 두 동물이 사용됩니다 : 하나는 보상과 형광 - 마이너스 - 원 isotype 컨트롤 샘플에 필요한 외과 단일 색상 컨트롤을 설정하는 것입니다. 다른 분류에 대한 실제 예제입니다. </li><li> CO 2 흡입하여 쥐를 안락사 또는 선택의 윤리 규정에 따라. 종이 타월, 최대 직면하고, 70 % 에탄올로 스프레이 플레이스 마우스는 철저하게 마우스 모피와 오염을 방지합니다. </li><li> 포셉와 복부의 피부를 리프트, 그리고 날카로운 가위로 작은 길이 절단합니다. </li><li> 필 반대 방향으로 피부의 두 날개는 (위, 아래)를 완전히 아래 뒷다리 사지 근육을 노출합니다. </li><li> 발목 부분의 경골의 양쪽을 따라 가위를 삽입하고 확장하여 엑사이스 근육 조직. </li><li> 근육 조직을 추출하는 대퇴골에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 각 마우스에서 조직 한 접시를 사용하여, 60mm 배양 - 요리의 모든 excised 근육 조직을 놓습니다. </li><li> 모든 마우스에 대해 위의 단계를 반복합니다. </li></ol> 2. 효소 소화에 의해 단일 ​​셀에 조직을 떼어 놓다 : 프로토콜의이 섹션 동안 살균 시약 및 도구를 사용하여 멸균 조건하에 작동합니다. <ol start="9"><li> 각 페트리 접시에 Collagenase - II 2 ML (시그마, 고양이 # 6885, 500u / ML) 및 250mM CaCl 2 주식 20 μL를 추가합니다. </li><li> 많은 오염을 제거하고 폐기에주의를 기울이고이 포셉 (한 톱니 모양의, 파인 과학 도구에서이 치아 한, 고양이 # 11051-10, 11154-10)과 작은 조각 (약 1 mm 3)로 근육 조직을 테어 가능한 비 근육 조직. </li><li> 페트리 - 요리를 커버하고 30 분 섭씨 37도에서 그들을 품어. </li><li> 페트리 - 요리를 검색하고 철저하게 매쉬 조직 조각 3 ML의 주사기의 플런저를 사용합니다. contaminations을 피하기 위해 각 샘플에 대해 하나 플런저를 사용합니다. </li><li> 각 페트리 - 음식 일부 (~ 5 ML) 살균 차가운 PBS를 추가하고 (필요한 모든 조직을 복구하는 경우 페트리 접시를 씻어 -) 50mL 팔콘 튜브로 조직 슬러지를 전송 </li><li> 적극적으로 팰컨 튜브 쉐이크, PBS로 튜브를 기입, 원심 분리기 @ 800rpm X 5 분 (Eppendorf 벤치 최고 모델 : 5810R), 그리고 표면에 뜨는를 기음 (반복 3 회) </li><li> 37도에서 품어, 각각의 튜브와 CaCl 2 10μL (250mM) : 1mL Collagenase D의 혼합 (로체, ​​고양이 # 11088882001, 1.5u / ML) / Dispase II (04,942,078,001, 2.4u / ML 로체, 고양이 #)을 추가 한 시간 만이라도 회전 섭씨. </li><li> 감기, 멸균 PBS, 소용돌이 그리고 조직을 균질하기 위해 철저하게 피펫의 50-10 ML을 추가합니다. </li><li> PBS로 튜브를 가득 채우고 잘 섞는다. </li><li> 조직의 나머지 큰 조각을 필터링하는 50 ML 팰컨 튜브의 상단에 위치 40μm 셀 스트레이너에 액체를 전송합니다. 고르게 세 50mL 팰컨 튜브에 각각의 샘플을 나누십시오. PBS는 다음 섭씨 8 도에 5 분 @ 1600rpm을 원심 분리기로 튜브의 각을 입력합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 얼룩을 위해 세포를 수집합니다. </li></ol> 3. 항체 스테 이닝과 정렬 : 프로토콜의이 섹션 동안 살균 외과 및 수집 버퍼를 사용하여 멸균 조건하에 작동합니다. 적절히 치료하면 상업 항체는 일반적으로 멸균 간주됩니다. <ol start="20"><li> 단일 색상과 isotype 컨트롤 샘플, 1mL 외과 버퍼에 샘플을 resuspend 아홉 1.5mL 미리 표시 Eppendorf 튜브 (100 μL 각 튜브)에서 일시 중지 세포를 나눕니다. <ol><li> 단일 색상의 얼룩을 설정하면 다음 표에 따라 믹스 : 주의 : 착색에 isotype 제어 항체의 최종 농도가 그들이 관리하는 주요 항체의 일치해야합니다. 안티 무서 - 1이 1 μg/10 6 세포를 사용하는 경우 예를 들어, 해당 isotype은 같은 농도에서 사용해야합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 튜브 # </td><td> 튜브의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 고양이 # </td><td> 클론 </td><td> isotype </td><td> 노동 희석 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 비 - 얼룩 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> 시그마 </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> 시그마 </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31 - FITC CD45 - FITC </td><td> ebioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> 쥐 IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 하우스 만든 </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> 쥐 IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sca1 - PECY7 </td><td> ebioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> 쥐 IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α - 7의 APC </td><td> 하우스 만든 </td><td></td><td> R2F2 </td><td> 쥐 IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> isotype 제어 얼룩은 다음 테이블을 사용하여 믹스 설정 : <table border="1"><tbody><tr><td> 튜브 # </td><td> 이름 튜브 </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31 - FITC </td><td> CD45 - FITC </td><td> Scal - PE - CY7 </td><td> A - 7 - APC </td><td> 쥐 - IgG2b - APC </td><td> 쥐 - IgG2a - pecy7 </td><td> 쥐 - IgG2a - FITC </td><td> 쥐 - IgG2b - FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> ISO - CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> ISO - Scal - pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> ISO - α - 7 - APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> 단계 20에서 해당 Eppendorf 튜브에 Pipet 단일 색상과 동위 원소 제어 얼룩 믹스를 (우리가 일반적으로 혼합 얼룩 5 사이에 10 μL 각 샘플에 추가되도록 항체의 농도를 조정합니다.) 잘 믹스 1 시간 동안 얼음에 품어. </li></ol></li><li> 외과 세포 분류에 대한 항체 칵테일의 800μL (아래)와 샘플 마우스 세포를 얼룩. 잘 믹스 1 시간 동안 얼음에 품어. 항체 칵테일 : Hoechst, PI, CD31 - FITC, CD45 - FITC, Sca1 - PECY7, α - 7 APC 주의 : 세포에 항체의 최적 비율은 큰 차이가 일괄 사이에 존재하는 수 있으므로 개별적으로, 각각의 항체를 titrating에 의해 결정되어야합니다. 사용되는 항체의 최적의 금액은 10 6 표적 세포마다 항체의 μgs 표현과 항체의 동일한 일괄 처리를 사용할 때 지속적인 보관해야합니다. 분명, 대상 세포의 숫자는 실험을 사이에 크게 변화하지 않는 경우, 또는 얼룩 볼륨은 세포의 숫자와 크기를 조정하는 경우, 각 항체의 고정 희석도 사용할 수 있습니다. </li><li> 세척 : 9 제어 튜브 각 외과 버퍼의 약 1mL에 추가하고, 샘플 튜브에 외과 버퍼의 약 20mL 추가할 수 있습니다. </li><li> 5 분 Eppendorf 튜브 @ 3000rpm (5417C Eppendorf 벤치 최고 원심 분리기, 모델)을 원심 분리기. 샘플 튜브에게 5​​ 분 @ 1600rpm (5810R Eppendorf 벤치 톱 원심 분리기, 모델)을 원심 분리기. </li><li> 기음 모든 튜브의 표면에 뜨는를 삭제. </li><li> 외과 버퍼 (컨트롤 각각에 대해 1mL, 정렬 샘플 4mL)에 Resuspend 세포는 "외과 튜브 '셀 스트레이너 뚜껑을 통해 (BD 팰컨 고양이 # 352235, 40μm 구멍 크기)로 피펫 세포 수 있습니다 남아있는 대단히 짧은 시간을 제거하는 cytometer에 영향을 미칩니다. </li><li> 단일 색상 컨트롤과 isotype 컨트롤과 함께 외과 분류기를 설정합니다. </li><li> 3.5 ML 수집 버퍼에서 다음 테이블 (95% DMEM 5 % FBS)에 따라 개별적으로 정렬된 세포를 수집합니다. 일반적으로, 두 뒷다리 손발을 수확하면, 하나의 야생 타입 마우스는 프로 시저의 끝 부분에 외과의 reanalyzing 정렬 세포에 의해 판단 95% 위의 생존과 150,000 myogenic 전구 세포 또는 100,000 adipogenic 전구 세포 (그림 1에 대해 얻을 수 ) myogenic 및 adipogenic progenitors의 정의는 표면 얼룩을 기반으로 <table border="1"><tbody><tr><td> 항체는 / 얼룩 </td><td> Myogenic 시조 (MP) </td><td> Adipogenic 시조 (서울 = 연합 뉴스) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31 - FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45 - FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> Sca1 - PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α - 7의 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. 이식 : <ol start="28"><li> @ 1500rpm 5 분, autoclaved Eppendorf 튜브 (1.5 ML)에 뜨는 및 전송 세포를 제거 정렬 세포를 원심 분리기, 5 분 @ 3000rpm을 원심 분리기 다음 멸균 PBS (혈청 무료!) 500 μL로 세포를 씻어. 무균 조건에서 모든 시약을 유지하고 조직 문화 후드에서 근무 약 10 6 세포 / ML에서 PBS에 myogenic progenitors, 또는 Matrigel에서 adipogenic 시조 (BD 고양이 # 354234)을 resuspend. </li><li> myogenic progenitors 또는받는 마우스로 adipogenic 시조를 이식. <ol><li> isoflouran이 기관의 정책에 따라와 마우스를 마취시키다. </li><li> 사출 지역 주변의 머리를 면도, 다음 70 % 에탄올과 마찰로 피부를 소독 </li><li> 10분의 3 CC의 인슐린 주사기를 사용하여 myogenic progenitors 또는 adipogenic progenitors (= 20K 세포)의 20μL (BD 고양이 # 309300)을 주사. </li></ol></li><li> 적절한 시간 (3 주 잘 작동하지만, 기증자 파생 형질 마커를 표현 myofibers는 이식 수술 후 일주 시간 이내 증거들이) 후, (시그마 고양이 # T04840 - 2, 400 μL Avertin의 intraperitoneal 주사로 단계 29받는 쥐를 마취시키다 25 MG / ML)은 다음 4% PFA의 15mL 다음 50mL PBS (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 μm의를 포함) 먼저와 transcardially perfuse. 필요한 경우 하루 20 %의 자당로 전송 후, 밤새 4% PFA와 대상 조직, 사후 수정 사항을 수집합니다. OCT, 동결 및 cryosection에 삽입할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : MP가 마우스 골격근에 이식하는 경우, 그들은 쉽게 기존 myofibers와 퓨즈. 따라서 기증자의 세포에 존재하는 유전자 레이블을받은 섬유에서 쉽게 감지됩니다. 그림 2는 이식 세포, 인간의 알칼리성 phostphatase을 표현 histochemically 발표 예제를 보여줍니다. AP가 이식 때 결과는 이식 사이트의 환경에 크게 의존 : subcutaneously 이러한 세포 (그림 2 참조) adipocytes와 myofibroblasts에 기원을 제공 이식 때. 지방 변성은 3 유도되지 않는 근육을 포함하여 많은 다른 사이트에서는, 그들은 생존하지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 골격근의 시조 인구의 격리를위한 전략을 정렬 (A) 정렬 전략 :. 가능한 세포는 앞으로 산란 및 측면 산란을 기반으로 확인되었습니다. Hoechst의 얼룩은 죽은 세포를 제외 anuclear 파편과 propidium 요오드화물의 (PI) 얼룩을 제외하는 데 사용되었다. 조혈 (CD45) 및 내피 (CD31) 세포가 정렬 성문에서 제외되었습니다. α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - Scal - 집합은 모든 myogenic progenitors (MP)가 포함되어 있습니다. Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - 인구 adipogenic progenitors (AP)가 포함되어 있습니다. (B) 형광 - 마이너스 - 원 (FMO) isotype 컨트롤은 얼룩의 특이성을 확인합니다. (C) 순도가 정렬 후 MP와 AP 하위 집합을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. MP와 AP 이식. AP 다음과 같은 대표적인 결과는 subcutaneously 이식 (맨 위 패널)와 MP intramuscularly (하단 패널)되었습니다. 두 경우 모두, 기증자 세포는 갈색 얼룩으로 식별 유전자 변형 인간의 알칼리성 인산 가수 분해 효소를 표현 마우스에서 유래.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜의 목적은 높은 수율과 정화 ​​세포의 높은 생존 능력 사이에 적절한 균형을 공격하는 것입니다. 건강한 세포가 회복되는 보장에서 가장 중요한 단계는 예측할 수, 시작 조직의 효소 분해됩니다. 조직의 처리 증명 또는 시청각 형식도 감사 힘든되는, 특히 부드럽게해야합니다. 또 다른 주요 요인은 절차의 길이입니다. 더 이상 그것은 따라서 낮은 생존하고, engraftment 효율, 기증자로부터받는 동물로 이동 걸립니다. 즉시 정렬 후 정화 세포 샘플에 PI 긍정적인 사건의 빈도를보고하여 답변을하지 않습니다 생존에 대한 질문이있을 경우, 우리는 clonogenicity을 측정하기 위해 제한 희석 분석은 3 수행하는 것이 좋습니다. 손상되지 않은 근육의 일반적인 종류는 정기적으로 체외에 myogenic 또는 fibro / adipogenic 식민지를 시작 할 수 15-20 세포의 약 1를 얻을 수 있습니다. 의원에서 시작한 식민지의 기본적 100 % 차별화된 myotubes가 포함되어 있지만, FAPs에서 얻은 식민지 중 고작 1 ~ 세번째는 부드러운 근육 굴지 긍정 myofibroblasts 이외에 adipocytes가 포함되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C - 6885, </td><td> 500 U / ML </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> 로체 </td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 U / ML </td></tr><tr><td> II를 치환 </td><td> 로체 </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 U / ML </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너와 관 </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B2261 </td><td> 2-5 UG / ML </td></tr><tr><td> CD31 - FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> 클론 390 </td></tr><tr><td> CD45 - FITC </td><td> 홈 만든 </td><td></td><td> 클론 I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1 - PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> 클론 D7 </td></tr><tr><td> α - 7 인테 APC </td><td> 홈 만든 </td><td> 로씨 연구실에 문의 </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

골격근에서 progenitors의 정화

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

골격 근육은 서로 다른 배아 기원과 발달 잠재적 여러 전구 인구가 포함되어 있습니다. 일반적으로 myofiber 플라즈마 막과 ensheaths를 laminin 풍부한 지하 막 사이에 &#39;위성 휴대폰 위치 &quot;에 거주 Myogenic progenitors은, 전적으로 myogenic 혈통 1,2하기 위해 최선을 다하고 있습니다 자기 갱신 세포 수 있습니다. 우리는 최근 myofibroblasts 효율적 확산을 입력하여 손상에 대응하고 조직 재생 3,4 중 myogenic 세포에 영양 지원을 제공하는 백색 adipocytes을 생성할 수 있습니다 선박 관련 progenitors의 두 번째 클래스를 설명합니다. 주어진 세포 인구의 발달과 재생 가능성을 결정하는 가장 신뢰할 수있는 assays 중 하나는 그들의 고립과 5-7 이식에 의존합니다. 이를 위해 우리는이 문서에서 개요 것입니다 효소 dissociated 근육에서 유동세포계측법에 의해 자신의 정화를 위해 프로토콜을 최적화합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 인구는 myogenic 또는 fibro / adipogenic 콜로니 형성 세포 중 하나를 포함합니다 : 다른 세포 유형은 체외에서 확장 또는 생체내 전달에서 살아남기 수 없습니다. 그러나 이러한 인구가 하나가 신선한 정렬 집합이 식민지를 형성하거나 수신자를 engrafting의 능력이 결여되어 다른 오염 물질 세포를 포함할 수 있습니다 점을 염두에 보관해야 분자 분석 (예 : qRT - PCR)에 대한 정렬 즉시 사용할 때.

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

골격근은 서로 다른 배아 기원과 발달 잠재력을 가진 여러 전구세포 집단을 포함하고 있습니다. 보통 ...에 거주하는 근원성 전구세포는...

다음 실험의 전반적인 목표는 대칭되는 골격근으로부터 생존 가능한 근원성 및 지방원성 전구세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 안락사시킨 마우스에서 근육 조직을 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 샘플을 효소 처리하여 조직을 단일 세포로 해리시킵니다.다음으로, 전구 세포를 분리하기 위해 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting, FACS)을 사용합니다. 유전자 표지(본 예에서는 human alkaline phosphatase)에 대한 조직 화학적 염색을 통해, 분리된 세포를 수용 마우스에 이식했을 때의 생존력과 분화 정도를 보여주는 결과를 얻습니다. prepl과 같은 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 시점에 동물로부터 세포를 직접 분리할 수 있다는 점입니다.예를 들어, 조직 손상을 유도한 후에는 세포 집단에 대한 선택 과정이 없으므로, 세포 집단을 분자 수준에서 분석하여 생체 내 재생 과정 동안 세포가 거치는 서로 다른 단계들을 살펴볼 수 있습니다. 따라서 이 기술은 조직 재생 분야의 핵심적인 질문, 특히 생체 내 재생 과정에서 각 세포 유형이 어떤 역할을 하며 이러한 세포 유형들이 서로 어떻게 상호작용하여 건강한 조직을 재건하는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 근이영양증과 같은 질환의 치료로까지 확장됩니다.이러한 전구세포에 대한 연구는 결과적으로 이 유형의 질환에 대한 재생 전략을 가능하게 할 수 있기 때문입니다. 또한, 우리가 지금까지 테스트한 모든 조직에서 최소한 섬유지방 생성 전구세포가 발견되었으므로, 이 기술의 적용 범위는 심장에서 지방 조직에 이르는 다양한 다른 조직으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 가혹한 해리 기술이 세포 생존율을 낮추고 너무 많은 잔해물을 생성하여 이후의 정밀한 세포 분리를 방해하기 때문입니다.우리는 일반적으로 APOE 세포에 사용되는 유세포 분석법을 고형 조직 내 줄기세포 연구에 적용하기로 결정했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 조직 해리 단계는 적절하게 설명하기 매우 어렵기 때문에 학습하기가 까다로우며, 따라서 이 기술에 대한 시각적 시연이 중요합니다. 오늘 이 기술의 시연은 제 실험실에서 이 기술을 처음으로 개발하고 최적화한 연구원인 linky가 맡을 예정입니다. 이 절차를 위해서는 최소 두 마리의 마우스가 필요합니다.한 마리의 마우스는 실험 결과 확인을 위해 필요한 단일 색상 및 항체 이소형 대조군 세포를 제공하는 데 사용하고, 다른 한 마리는 분리 대상 샘플을 제공하는 데 사용합니다. 우선, 멸균된 실험실 후드 내에서 이전에 안락사시킨 7~12주령의 마우스를 준비합니다. 안락사시킨 마우스를 멸균 종이 타월 위에 등을 대고 눕힌 뒤, 한 손에는 핀셋을, 다른 한 손에는 날카로운 가위를 들고 오염을 방지하기 위해 털 부위에 70% ethanol을 충분히 뿌립니다.복부 부위의 피부를 들어 올리고 작은 세로 절개를 가합니다. 절개부 양쪽의 피부를 잡아 당겨 뒤쪽 다리 근육이 완전히 드러나도록 피부를 벗겨냅니다. 다음으로, 닫힌 가위를 근육 아래와 경골 위에 삽입한 후 가위를 벌려 근육 조직을 절제합니다.날의 뒷날을 이용해 근육을 경골에서 부드럽게 분리합니다. 경골의 양측 모두에 대해 이 과정을 반복하고, 분리한 조직을 60 millimeter 페트리 접시에 담습니다. 이제 동일한 방식으로 대퇴골에서 근육 조직을 절제하여 페트리 접시에 추가합니다.마우스 한 마리당 페트리 접시 하나를 사용하여 각 마우스에 대해 반복합니다. 다음으로, 조직을 단일 세포로 해리합니다. 근육 조직이 담긴 각 페트리 접시에 collagenase 2 mL 또는 1000 units와 250 mM calcium chloride 스톡 솔루션 20 µL를 추가합니다.그런 다음 신속하고 주의 깊게 작업을 진행합니다. 톱니 모양의 핀셋 하나와 끝이 두 갈래인 핀셋 하나, 이렇게 두 개의 회색 핀셋을 사용하여 조직을 1 mm³ 크기의 조각으로 찢습니다. 비근육 조직은 가능한 한 많이 제거하여 폐기하십시오.페트리 접시의 덮개를 덮고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 접시를 꺼내어 멸균 실험실 후드로 옮깁니다. 3 mL 주사기에서 플런저를 분리하여 조직을 으깹니다.교차 오염을 방지하기 위해 플레이트당 하나의 플런저를 사용하십시오. 각 페트리 접시에 차가운 멸균 PBS 약 5 mL를 넣고 접시의 내용물을 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 조직을 회수하기 위해 PBS 5 mL를 추가로 사용하여 헹군 후 이를 원추형 튜브에 넣습니다.프로토콜에 따라 샘플을 세 번 세척하고 원심 분리하십시오. 그다음, collagenase D dys space two와 calcium chloride로 구성된 용액 1 mL를 각 튜브에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 회전시키며 배양하십시오. 배양 후, 튜브에 차가운 멸균 PBS 5 mL를 넣고 튜브를 짧게 볼텍싱한 뒤, 응집물을 해체하기 위해 여러 번 트리튜레이션하십시오.튜브에 PBS를 채워 잘 섞은 후 얼음에 둡니다. 남아 있는 큰 조직 조각을 제거하기 위해, 얼음에 둔 50 mL 원심분리관 위에 40 µm 세포 스트레이너를 놓고 세포 현탁액을 여과합니다. 여과액을 차갑고 멸균된 PBS가 채워진 세 개의 50 mL 원심분리관에 균등하게 나누어 담고 8 °C에서 1600 RPM으로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고, 근원성 및 지방원성 전구세포의 염색 및 분리를 위해 세포를 얼음에 둡니다.먼저, 동봉된 서면 프로토콜에 따라 6가지 단색 염색 혼합 대조군을 준비하십시오. 이 대조군에는 염색 없음, hulk stain, propidium iodide, CD 31 및 CD 45 FSE 표지 항체, SC one P size seven 표지 항체, 그리고 alpha seven A PC 표지 항체가 포함됩니다. 다음으로, 서면 프로토콜에 따라 3가지 항체 이소타입 대조군 염색 혼합물을 준비하십시오.염색 혼합액이 준비되면, 단일 색상 및 아이소타입 대조군 샘플을 위해 1.5 mL 에펜도르프 튜브 9개에 라벨을 붙입니다. 3개의 원추형 튜브에 들어있는 세포를 총 부피 1 mL의 FACS 버퍼로 재현탁하여 합칩니다. 다음으로, 라벨이 붙은 각 대조군 에펜도르프 튜브에 세포 100 µL씩을 분주하고, 항체 농도에 따라 5~10 µL의 염색 혼합액을 해당 대조군 튜브에 피펫으로 넣습니다.샘플 마우스의 세포를 200 µL의 FACS buffer에 재부유시키고 50 mL 원추형 튜브 중 하나에 합칩니다. 그다음 항체 칵테일 800 µL를 추가합니다. 각 대조군 튜브와 샘플 튜브를 혼합합니다.이를 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 9개의 대조군 튜브 각각에 1 mL의 FACS 버퍼를 추가하고 샘플 튜브에는 약 20 mL의 FACS 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다. 대조군 에펜도르프 튜브를 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.샘플 원추형 튜브를 1600 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 원심 분리 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 대조군 세포는 각 eend orph 튜브에서 1 mL의 fax buffer로 재현탁하고, 샘플 세포는 4 mL의 fax buffer로 재현탁합니다.샘플 세포와 이소타입 대조군, 그리고 pi 단일 색상 대조군 튜브에 propidium iodide를 추가하십시오. 세포 스트레이너 캡을 통해 세포를 fax 튜브에 분주하여 사이토미터에 영향을 줄 수 있는 잔여 응집물을 제거하십시오.단색 및 아이소타입 대조군을 사용하여 FACS 장비를 설정하십시오. 제공된 서면 프로토콜에 따라 샘플 세포를 분리하고 각 세포군을 별도로 수집하십시오. 수집에는 3.5 mL 수집 튜브를 사용합니다. 생존 가능한 근원성 전구세포는 CD117+ 및 alpha 7 integrin+이면서 PI-, CD31-, CD45- 및 Sca-1-인 세포군입니다.One PE size seven 음성 생존 가능한 지방세포 전구세포는 hulked이며, ska one PE size seven 양성 및 pi CD 31 FE CD 45 FE 및 alpha seven a PC 음성입니다. 단일 야생형 마우스에서 약 1 × 10⁵개의 지방세포 전구세포와 95% 이상의 생존율을 가진 1.5 ~ 2 × 10⁵개의 근육세포 전구세포를 얻을 수 있습니다.숙주 마우스에 이식하기 위해 세포를 준비하려면, 세포를 세척해야 합니다. 먼저 변형된 세포를 1500 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고, 세포를 500 µL의 PBS에 재현탁하여 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.튜브를 3000 RPM에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 근원성 전구세포는 PBS에, 지방원성 전구세포는 Matrigel에 약 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 작성된 프로토콜에 따라 각 공여자 세포 유형에 맞는 마취된 수용 마우스를 준비한 후, 0.3 cm³ 인슐린 주사기를 사용하여 20 µL(약 20,000 cells)의 근원성 또는 지방원성 전구세포를 주입합니다.이식된 세포가 분화될 수 있도록 보통 약 3주 정도의 적절한 시간을 둡니다. 그 후 표적 조직을 분리하고 본 영상의 프로토콜에 설명된 대로 동결절편 제작을 준비합니다. 지방세포 분화 및 근세포 분화 전구세포를 분리하기 위한 소팅 전략은 다음과 같습니다. 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 기반으로 생존 세포를 식별하였으며, Hoechst 염색을 통해 핵 잔해물을 제외하였고, 프로피듐 요오다이드(propidium iodide) 또는 PI 염색을 통해 사멸 세포를 제외하였습니다. 이후 조혈 세포 및 혈관 내피 세포, 즉 각각 CD45 및 CD31 세포를 소팅 게이트에서 제외하였습니다. 최종적으로 alpha7 양성인 하위 집단을 선택합니다.SKA1 음성 분획에는 모든 근분화 전구세포와 alpha7 음성 집단이 포함되어 있습니다. SKA1 양성 분획에는 모든 지방분화 전구세포가 포함되어 있습니다. 형광 마이너스 하나(minus one) 아이소타입 대조군을 통해 염색의 특이성을 확인하였습니다. 또한, 지방분화 및 근분화 하위 집단의 순도 검사를 수행하였습니다.이 대표적인 예시에서 분별 후, 피하로 주입되어 형질전환된 인간 알칼리성 인산분해효소를 발현하는 지방 분화 전구 세포 공여 세포는 조직 화학 염색을 통해 갈색 염색으로 표시된 바와 같이 숙주 조직에서 식별될 수 있습니다. 근육 내로 주입되어 형질전환된 인간 알칼리성 인산분해효소를 발현하는 근분화 전구 세포 공여 세포는 이 조직 절편에서 갈색으로 표시된 것과 같이 식별되었습니다.조직화학법 사용법: 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 처리해야 할 샘플 수가 많아지면 소요 시간이 증가합니다. 이 절차를 수행할 때는 빠르고 조심스럽게 작업하는 것이 중요합니다.따라서 한 번에 너무 많은 샘플을 처리하는 것은 피하십시오. 처리 시간이 길어지면 이 절차 이후의 세포 변이성이 크게 감소하게 됩니다. 이러한 전구 세포들이 발달 후 생체 내(in vivo) 손상에 어떻게 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 quantitative R-T-P-C-R을 이용한 colono SC OG 발현 분석과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다.이 기술은 조직 재생 분야의 다른 연구자들이 손상된 조직 내 전구 세포 간의 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 조직을 손상 없이 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전구 세포의 표면 마커를 기반으로 전구 세포를 식별하고, 이들의 생체 내(in vivo) 발달 잠재력을 분석합니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 프로토콜은 성인과 노인의 골격 근육에서 분리 및 근원 세포의 전구 세포의 문화의 강력한 재현하고 간단한 방법을 설명합니다. 여기에 사용되는 근육은 발과 다리 근육을 포함한다. 이 방법은 기능 연구를위한 주요 근육 아세포의 풍부한 인구의 분리를 할 수 있습니다.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다.  이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.

교란되지 않고 손상된 마우스 골격근에서 섬유 지방 형성 전구 세포 및 근육 줄기 세포의 FACS 분리 및 배양

이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 생쥐 골격근에서 근성 및 지방성 전구세포를 효소 소화와 유세포 분석으로 정화하는 방법입니다. 이 기술은 조직 재생 연구와 세포 치료 개발에 필수적인 도구를 제공합니다.

골격근에서 Progenitors의 정화

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