dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

본 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아에 이중 가닥 RNA를 주입하여 내인성 유전자 발현을 억제함으로써 기관 발달에 필요한 유전자를 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아를 수집하여 일직선으로 정렬합니다. 그다음, 바늘을 준비하여 배아에 이중 가닥 RNA를 주입합니다.

마지막으로, 배아를 습윤 챔버에 넣어 발달시킵니다. 결과적으로, 후기 단계 배아의 항체 염색이나 명시야 현미경을 통한 유충 관찰을 통해 초파리 기관지 분지 융합의 결함을 확인할 수 있습니다. 장기 발달에 필요한 유전자를 식별하기 위한 순방향 유전학 스크리닝과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 해당 유전자의 돌연변이체가 준비되기 전에 유전자 기능을 분석할 수 있는 비교적 간단하고 빠른 역방향 유전학적 접근 방식이라는 점입니다.

이 방법은 D 기관계 발달에 필요한 핵심 유전자의 식별과 같이 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 척추동물의 기도, 순환계, 신장 도관 및 탐색 상피와 같은 포유류 기관의 형태 형성을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 배아 정렬, 바늘 부러뜨리기, 배아 내 stranded RNA 주입과 같은 기술을 익히는 데 시간이 걸리기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

배아마다 주입되는 이중 가닥 RNA의 양이 다르며, 합포체 포배기 배아의 모습에 대한 서술적 설명은 한계가 있기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 합포체 포배기 배아에 적절한 양의 이중 가닥 RNA를 주입하는 것은 내인성 유전자의 발현을 효과적으로 억제하기 위한 매우 결정적인 단계이므로, 해당 과정을 익히는 데 어려움이 있을 수 있습니다.

먼저 2~4일 된 W 1 1 1 8 초파리를 사용하여 25 °C에서 케이지를 설정합니다. 1~2일의 기간 동안 알 수집을 동기화하기 위해 낮 동안 매시간 포도당 플레이트를 교체하십시오. 수집 전, 25 °C에서 1시간 동안 syn city 또는 blaster derm 배아를 수집합니다. 직사각형 모양의 포도당 아가 플레이어를 준비한 다음, 면도날을 사용하여 아가 중앙에 선을 가볍게 긋습니다.

금속 프로브를 사용하여 배아를 포도 주스 플레이트에서 포도 주스 한천 조각으로 옮깁니다. 약 50개의 배아를 한천 중앙의 직선상에 일렬로 배치하되, 배아의 장축이 직선과 45도 각도를 이루도록 합니다. 모든 배아의 후단이 직선의 반대 방향을 향하도록 동일한 방향으로 정렬되었는지 확인하십시오.

양면테이프를 직사각형 모양으로 잘라 18 by 18 밀리미터 크기의 커버 슬립에 붙입니다. 커버 슬립에 붙은 테이프를 사용하여 배아를 집어 올립니다. 커버 슬립을 유리 슬라이드 위에 올립니다.

배아를 양면테이프에 살짝 누르고 약 10분 동안 공기 중에서 건조시킵니다. 배아 위에 700 halo carbon oil을 얇게 덮어줍니다. 현미경 상에서 배아가 투명해질 때까지 약 10분 정도 기다립니다.

유리 모세관을 가열 인발하여 마이크로인젝션용 니들을 준비합니다. World Precision Instruments 사의 니들 풀러(needle puller)를 사용하며, 프로그램 설정은 Heat one, delay four, back으로 설정합니다.

Einor P 20 피펫과 einor micro loader 팁을 사용하여 이중 가닥 RNA 2 µL를 바늘에 충전합니다. 깨끗한 커버 슬립을 올린 슬라이드를 준비하고 테이프로 함께 고정합니다. 충전된 바늘을 커버 슬립의 가장자리에 밀착시켜 날카로운 지점을 만듭니다.

이중 가닥 RNA가 바늘 끝에서 흘러나옵니다. 피코 펌프의 풋 페달을 밟을 때, 슬라이드 중앙에 오일 한 방울을 떨어뜨려 준비합니다. 바늘을 오일 방울 속에 삽입합니다.

풋 페달을 밟았을 때 피코 펌프에서 100 내지 200 picoliters의 이중 가닥 RNA가 배출되도록 설정을 조정하십시오. 이중 가닥 RNA는 작은 방울 형태로 나타납니다.

첫 번째 배아의 후방 부위에 바늘 끝을 위치시킨 후 피코 펌프 발판을 누릅니다. 주입 부위에 이중 가닥 RNA가 작은 점 형태로 나타날 것입니다.

슬라이드 위의 배아에 이중 가닥 RNA 주입을 완료합니다. blastomere 단계가 아닌 배아는 모두 제거합니다. 커버 슬립을 플라스틱 페트리 접시와 같이 덮개가 있는 습윤 챔버에 넣고, 배아가 원하는 배아 또는 유생 단계까지 발달할 때까지 18 °C에서 배양합니다.

원하는 배아 단계까지 발달한 배아의 경우, 프로브를 사용하여 양면테이프에서 배아를 제거하고 커버슬립의 가장자리로 밉니다. 헵탄을 사용하여 배아를 씻어내어 바닥에 나일론 메쉬가 있는 수집 바이알로 옮깁니다. 배아를 PBT로 세 번 세척하고 50%Bleach에서 5분 동안 처리한 후, 다시 PBT로 세 번 세척합니다.

피펫을 사용하여 수집 바이알에서 나일론 메쉬 조각으로 배아를 옮긴 후, 나일론 메쉬 조각을 고정액에 담급니다. 배아를 30분 동안 고정합니다. 고정액의 하층을 제거합니다.

그 후 메탄올로 고정합니다. 배아를 에펜도르프 튜브로 옮기고, 원하는 유생 단계까지 발달한 배아를 위한 표준 항체 염색 프로토콜을 사용하여 두 가지 A 12 및 diffusion 항체로 면역 염색합니다. 슬라이드 중앙에 halo carbon 700 오일을 한 방울 떨어뜨리고, 오일 방울 양옆에 작은 커버 슬립 두 개를 배치하여 슬라이드를 준비합니다. 유생 한 마리를 슬라이드로 옮긴 후 오일 방울 위에 커버 슬립을 덮습니다.

명시야 현미경으로 유충을 관찰합니다. 확산 이중가닥 RNA와 GFP 이중가닥 RNA 주입의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

GFP 이중 가닥 RNA가 주입된 배아는 정상적인 기관 융합을 보이며, 융합 세포 내에 확산 단백질이 존재합니다. 화살표는 외측 몸통 확산 양성 융합 세포를 가리키며, 별표는 정상 융합 위치를 나타냅니다.

하지만, 이중 가닥 RNA가 주입된 배아에서는 분지 융합에 실패하며, 융합 세포에서 확산 단백질이 나타나지 않습니다. 삼각형은 이중 가닥 RNA가 주입된 배아가 유충 단계로 발달했을 때 분지 융합에 실패한 부위를 나타냅니다. G-F-P-R-N AI 유충은 별표로 표시된 바와 같이 정상적인 기관 분지 융합을 보여줍니다.

반면, diffusion RN AI 유충은 삼각형으로 표시된 가지 융합 실패 양상을 보였습니다. 이러한 결과는 초파리 배아에 이중 가닥 RNA를 주입하여 내인성 diffusion 유전자 발현을 억제했을 때의 효과를 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때는 발달이 완료된 후 모든 enseal blaster 배아를 사멸시켜야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 발생 생물학 분야의 연구자들이 초파리의 기관 발달에 관여하는 새로운 유전자들의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 초파리 배아에 이중 가닥 RNA를 주입하여 내인성 유전자를 넉다운시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.