April 11th, 2011
RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인 입증되었습니다 Drosophila tracheal 개발. 최저의 유전자 발현에 플라이 배아에 dsRNA를 주입하기 위해 티베트 연구실에서 사용하는 자세한 프로토콜은 그림입니다. 이 기술의 조직 및 장기 개발에 필요한 심사 유전자의 가능성을 가지고 Drosophila.
이 절차의 전반적인 목표는 장기 발달에 필요한 유전자를 확인하기 위해 초파리 배아에 이중 가닥 RNA를 주입하여 내인성 유전자 발현을 억제하는 것입니다. 이것은 먼저 배아를 수집하고 일직선으로 정렬함으로써 수행됩니다. 다음으로, 바늘을 준비하여 이중 가닥 RNA를 배아에 주입하는 데 사용합니다.
마지막으로, 배아를 축축한 방에 넣어 발달시킵니다. 궁극적으로, 말기 배아의 항체 염색을 통해 또는 명시야 현미경으로 유충을 관찰하여 초파리 기관 가지 융합의 결함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 장기 발달에 필요한 유전자를 식별하기 위한 순방향 유전자 스크리닝과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 이점은 해당 유전자에 돌연변이가 발생하기 전에 유전자 기능을 분석하는 비교적 간단하고 빠른 역 유전적 접근 방식이라는 것입니다.
이 방법은 D 기관 시스템의 발달에 필요한 중요한 유전자의 식별과 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 척추동물의 기도, 순환계, 신관, 탐색적 상피와 같은 포유류 기관의 형태형성을 연구하는 데 탁월한 모델입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 배아를 정렬하고, 바늘을 부러뜨리고, 좌초된 RNA를 배아에 주입하는 것과 같은 방법을 배우는 데 시간이 걸리기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 방법의 시각적 시연은 이중 가닥의 양과 관련된 단계로서 중요합니다. 주입된 RNA는 배아마다 다르며 syncytial, blasto derm 배아가 어떻게 생겼는지에 대한 서면 시연은 어려울 수 있습니다. 적절한 양의 이중 가닥 RNA를 syncytial blasto 배아에 주입하는 것은 내인성 유전자의 발현을 효과적으로 녹다운하는 데 매우 중요한 단계이기 때문에 이러한 단계는 배우기 어렵습니다.
먼저 2-4일 된 W 1 1 1 8마리의 파리를 사용하여 섭씨 25도의 케이지를 설정하고 하루 중 한 시간마다 포도 주스 플레이트를 교체하여 하루에서 이틀 동안 계란 채취를 동기화합니다. 컬렉션 전에. 섭씨 25도에서 1시간 동안 syn city 또는 blaster derm 배아를 채취한 후 직사각형의 포도 주스 한천 조각을 면도날로 한천 중간에 가볍게 자릅니다.
금속 프로브를 사용하여 포도 주스 플레이트에서 포도 주스 조각으로 배아를 옮깁니다. 한천. 약 50개의 배아를 배아와 일직선으로 정렬하고, 더 긴 축은 한천 중앙의 선과 45도 각도로 정렬합니다. 모든 배아가 같은 방향을 가리키고 뒤쪽 끝이 선에서 멀어지도록 합니다.
직사각형 양면 테이프를 잘라 18 x 18mm 커버 슬립에 붙입니다. 커버 슬립에 있는 테이프를 사용하여 배아를 집습니다. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다.
배아를 양면 테이프에 살짝 누르고 약 10분 동안 배아를 자연 건조시킵니다. 배아를 700 헤일로 카본 오일의 얇은 층으로 덮습니다. 현미경으로 배아가 깨끗해질 때까지 약 10분 동안 기다립니다.
바늘은 유리 모세관 튜브를 당겨 미세 주입을 준비합니다. 프로그램 설정에서 World Precision Instruments의 니들 풀러를 사용합니다. 1 지연 4 개를 뒤로 가열합니다.
Einor 마이크로 로더 팁이 있는 Einor P 20 피펫을 사용하여 2마이크로리터의 이중 가닥 RNA를 바늘에 로드합니다. 깨끗한 커버 슬립이 있는 슬라이드를 준비하고 테이프로 함께 붙입니다. 채워진 바늘을 커버 슬립의 가장자리에 가져다 대면 날카로운 점이 생깁니다.
이중 가닥 RNA가 바늘 끝에서 누출됩니다. 피코 펌프의 풋 페달을 밟았을 때는, 중간에 기름 한 방울을 넣어 슬라이드를 준비한다. 오일 방울에 바늘을 삽입합니다.
풋 페달을 밟았을 때 100-200피코리터의 이중 가닥 RNA를 배출하도록 피코 펌프의 설정을 조정합니다. 이중 좌초. RNA는 작은 물방울 위치로 볼 수 있습니다.
첫 번째 배아의 뒤쪽 부분에 있는 바늘 끝은 피코 펌프 풋 페달을 밟습니다. 이중 가닥 RNA는 작은 것으로 나타납니다. 주입 부위에서.
슬라이드의 배아에 이중 가닥 RNA 주입을 마칩니다. 블래스터가 아닌 덤 배아를 모두 죽이십시오. 배아가 원하는 배아 또는 유충 단계로 발달할 때까지 섭씨 18도의 플라스틱 페트리 접시와 같은 덮개가 있는 습한 챔버에 커버 슬립을 놓습니다.
원하는 배아 단계까지 발달한 배아의 경우, 프로브를 사용하여 양면 테이프에서 배아를 제거하고 커버 슬립의 가장자리로 밀어 넣습니다. 헵탄으로 배아를 씻어내고 바닥에 나일론 메쉬가 있는 수집 바이알에 넣습니다. 50% 표백제에 PB 테이팅으로 배아를 5분 동안 3회 세척하고 PBT로 배아를 다시 3회 세척합니다.
채취 바이알의 배아를 피펫을 사용하여 나일론 메쉬 조각으로 옮기고 나일론 메쉬 조각을 고정 용액에 담그십시오. 30분 동안 배아를 고정합니다. 정착액의 하부층을 제거합니다.
그런 다음 메탄올로 배아를 에펜도르프 튜브로 옮기고 원하는 유충 단계로 발달한 배아에 대한 표준 항체 염색 프로토콜을 사용하여 2개의 A 12 및 확산 항체로 면역염색합니다. 헤일로 카본 한 방울, 중간에 700 오일, 오일 드롭의 양쪽에 두 개의 작은 커버 슬립이 있는 슬라이드를 준비합니다. 유충 한 마리를 슬라이드로 옮긴 다음 오일 방울 위에 커버 슬립을 적용합니다.
명시야 현미경으로 유충을 관찰하십시오. 확산 이중 가닥 RNA와 GFP 이중 가닥의 대표적인 결과. RNA 주입이 여기에 나와 있습니다.
GFP 이중 좌초. RNA 주입 배아는 정상적인 기관 융합 및 확산 단백질이 융합 세포에 존재하는 것을 보여줍니다. 화살표는 측면 몸통 확산 양성 융합 세포를 가리키고 별표는 정상적인 융합 위치를 나타냅니다.
그러나 확산 이중 가닥 RNA 주입 배아는 실패한 분기 융합 및 확산 단백질이 융합 세포에 존재하지 않음을 보여줍니다. 삼각형은 이중 가닥 RNA 주입 배아가 애벌레 단계로 발달할 때 실패한 분기 융합 부위를 나타냅니다. G-F-P-R-N AI 유충은 별표로 표시된 정상적인 기관 가지 융합을 보여줍니다.
반면에, 확산 RN AI 유충은 삼각형으로 표시된 실패한 가지 융합을 보여주었습니다. 이러한 결과는 초파리 배아에 이중 가닥 RNA 주입에 의한 내인성 확산 유전자 발현의 녹다운(knockdown) 효과를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 발달 후 모든 enseal 블래스터 배아를 죽이는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 기술은 발달 생물학 분야의 연구자들이 초파리의 장기 발달을 위한 새로운 유전자의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리 배아에 이중 가닥 RNA를 주입하여 내인성 유전자를 녹다운하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 사용하여 드로소필라 배아의 유전자 발현을 억제하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 특히 기관 발달, 특히 기관지 발달에 필수적인 유전자를 식별할 수 있습니다.
Efficient gene knockdown in Drosophila embryos using dsRNA injection enables rapid interrogation of gene function in organogenesis, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This approach accelerates the identification of genes critical for tissue and organ development, providing predictive confidence before mutant lines are available. The method's simplicity and speed make it valuable for portfolio triage and prioritization in discovery pipelines.
This dsRNA injection method fits at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis-driven gene function analysis prior to preclinical model development.