출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

저는 Troy Gasai입니다. 지난 몇 년 동안 저희 연구실에서 완성한 장기 유사 조직 절편 분석법(organotypic slice assay)에 대해 말씀드리겠습니다. 저희 연구실의 Ben jacket이 이 분석법의 수행 방법을 시연해 드릴 것입니다.

생후 뇌의 기관형 슬라이스 분석법은 다양한 인자들과 이러한 인자들이 생후 뇌 및 TRO 이동 경로 내 신경세포 이동에 미치는 역할을 테스트하는 강력한 방법입니다. 안녕하세요, 저는 노스캐롤라이나 주립대학교 수의과대학 Dr. Troy Gge 연구실의 박사후 연구원 Ben Jakay입니다. 오늘은 생후 뇌에서 이동하는 신경모세포를 시각화하기 위해 기관형 마우스 뇌 슬라이스 간의 조직 교차 이식 방법을 어떻게 수행하는지 보여드리겠습니다.

이 영상에서 설명하는 모든 기술은 멸균된 도구를 사용하여 가급적 층류 후드(laminar flow hood)와 같은 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 23 gauge 바늘이 장착된 일회용 주사기를 사용하여 디쉬의 바닥 유리 중앙에 슬라이스 배지 150 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 유체 교환 A를 위해 한쪽 면은 접착하지 않은 상태로 두고, 원형 유리 바닥 커버슬립 바깥쪽에 접착제를 여러 군데 찍어 고정합니다. 그 다음, 마이크로 포셉을 사용하여 핵공 막을 배지 위에 조심스럽게 올리며, 이때 막 아래에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의합니다.

그 다음 곡선 핀셋을 사용하여 접착제 지점을 평평하게 펴고 막을 제자리에 고정합니다. 막 위에 1 mL의 슬라이스 배지를 첨가하고, 마지막으로 사용할 때까지 디쉬를 인큐베이터에 보관합니다. P1에서 P10 사이의 어린 생후 쥐로 슬라이스를 준비했을 때 가장 좋은 결과를 얻을 수 있으며, 먼저 미세 핀셋으로 코끝을 잡아 머리를 고정합니다.

목에서 주둥이까지 피부를 세로 방향으로 절제합니다. 두개골이 드러나도록 두피를 벗겨낸 후, sternum magna에서 시작하여 중앙에 한 번, 양측에 각각 한 번씩 총 두 번의 외측 절개를 가하여 두개골을 전방 및 세로 방향으로 절단합니다. 이때 하부의 피질 조직과의 접촉을 최소화하도록 주의해야 합니다.

조직의 안정성을 높이기 위해 두개골 덮개를 뇌에서 제거합니다. 진동 절편 제작 중에 뇌의 가장 외측 및 미측 부위를 면도날로 제거합니다. 두 반구를 두개골에서 조심스럽게 퍼내어 내측면이 아래로 향하도록 매몰 몰드에 배치합니다.

그 후, 37°C로 유지되는 조직 준비 버퍼에 용해된 3% DNA 등급 아가로스 겔(agarose gel)을 녹여 즉시 덮어줍니다. 평평한 수평면 위에서 2분 동안 안정화합니다. 아가로스가 고르게 굳을 수 있도록, 몰드를 얼음 위에 올려놓아 경화를 완료합니다.

반구 형태의 조직이 포함된 겔이 굳으면, 몰드에서 제거하고 뇌 조직 주변을 다듬습니다. 그 다음 겔에 매몰된 조직의 내측면이 위로 오도록 바이브레이톰(vibratome)의 시편 디스크에 올리고 시아노아크릴레이트 접착제로 고정합니다. 이 디스크를 얼음처럼 차가운 조직 준비 배지가 채워진 바이브레이톰 시편 트레이에 장착한 후, 뇌를 150 µm 두께로 절편화합니다.

RMS를 포함하는 절편이 블레이드에서 분리되면, 작은 플랫헤드 스패튤라를 사용하여 조심스럽게 걷어내어 배양 접시 중앙에 평평하게 놓습니다. 조직이 매우 취약하므로 절편을 다루는 과정을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 배양 접시 내 배지의 양은 뇌 절편이 움직이지 않도록 고정하면서 완전히 덮을 수 있을 만큼의 높이로 조절합니다.

디쉬에 라벨을 붙여 인큐베이터로 옮깁니다. 공여 뇌는 수혜 뇌와 유사한 방식으로 준비하되, 절편을 250 µm 두께로 절단하여 얼음 위에서 수집한다는 점만 다릅니다.

냉각 조직 준비. 완충액에 담긴 절편을 에피 형광 기능이 있는 실체 현미경 아래에 즉시 배치합니다. RMS는 하뇌실막대(subependymal zone)에서 후각구(olfactory bulb)까지 뻗어 있는 회색의 U자형 구조로 관찰됩니다.

미세 핀셋을 사용하여 RMS를 조심스럽게 미세 절제합니다. 한쪽 핀셋으로 슬라이스를 고정하고, 다른 쪽 핀셋으로 RMS 주변을 조금씩 절개하여 슬라이스에서 분리합니다. 절제된 RMS는 지름 약 200에서 500 micrometers의 작은 조각으로 자릅니다.

이 예시에서는 TD tomato glass 적색 형광 단백질을 발현하는 마우스에서 외식물을 준비합니다. 숙주 슬라이스가 담긴 바닥 접시를 인큐베이터에서 꺼내 가시광선을 사용하는 해부 현미경 아래에 놓습니다. RMS의 초기 분절에 작은 절개를 넣고, 20 µL 팁이 장착된 피펫을 사용하여 단일 공여 RMS 절편을 숙주 RMS의 절개 부위로 옮깁니다.

두 조직 간의 접촉을 형성하기 위해 엑스플란트(explan)를 절개 부위로 부드럽게 밀어 넣습니다. 이 접촉 상태가 안정적으로 유지되도록 엑스플란트를 슬라이스와 핵공 막(nuclear pore membrane) 사이로 약간 밀어 넣습니다. 그 후, 절편이 막 위에 안착될 수 있도록 접시를 배양기에 넣고 최소 1시간 동안 둡니다.

신경모세포는 약 1~2시간 후에 이식편에서 숙주 RMS로 이동하기 시작해야 합니다. 세포 이동은 초장작동거리 20배율 대물렌즈를 사용하여 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 조직 배양 조직을 배양기에서 현미경의 가온 챔버로 옮깁니다.

형광 신경모세포는 원하는 분석 유형에 따라 0분에서 10분 사이의 간격으로 이미징할 수 있습니다. 당사의 유기적 전형적 절편 배양 프로토콜은 RMS 내의 이동 패턴과 방향의 일관성을 위해 지난 몇 년간 철저히 테스트되고 최적화되었습니다. 이 예시에서는, nestin 프로모터 하에서 TD tomato가 발현되는 마우스에서 얻은 explant로부터 이동하는 세포를 분석하여, 호스트 RMS로의 매우 지향적이고 신속한 이동을 보여줍니다.

고배율. 타임랩스 분석 결과, 20분간의 이미징 세션 동안 이동하는 신경모세포(neuroblast)의 전체 길이에 대해 우수한 해상도를 보여줍니다. 이미징이 완료되면, 슬라이스를 얼음처럼 차갑게 새로 준비한 4% 파라포름알데히드(paraform aldehyde)로 고정하고 이동 스트림의 다양한 구성 성분에 대해 면역 염색을 수행합니다.

이 사례에서는 형광 면역조직화학법을 사용하여 파란색의 GFAP 양성 성상세포와 녹색의 CD 31 양성 혈관을 나타냈으며, 세포골격 단백질인 actin(파란색)과 tubulin(녹색)으로 염색된 절편의 고배율 분석을 통해 이동 중인 세포에서 이러한 성분들이 불균일하게 발현됨을 보여줍니다. 본 프로토콜은 결과의 준비와 분석 모두에 있어 인내심과 숙련도, 그리고 상당한 시간이 소요되는 몇 가지 도전적인 과제들을 포함하고 있습니다.

실험에서 최선의 결과를 얻기 위해 도움이 될 만한 유용한 제안 사항들은 다음과 같습니다. 저희의 경험상 P1에서 P10 범위의 연령대인 마우스가 가장 좋은 결과를 보여주었습니다. 공여 뇌와 수혜 뇌의 연령을 일치시키는 것 또한 실험의 재현성을 높여줍니다.

대부분의 시약과 배양 접시를 즉석에서 준비해야 하므로, 본 슬라이스 분석법은 하루 동안 수 시간의 중단 없는 준비 및 이미징 과정이 필요합니다. 뇌를 적출한 후에는 후속 단계들을 가능한 한 신속하게 수행해야 합니다. 머리 절단부터 슬라이스 준비까지의 모든 단계는 얼음을 사용하여 진행해야 하며, 해부학적 손상을 방지하기 위해 조직 조작은 최소한으로 제한해야 합니다.

이러한 박리 작업에 사용되는 도구는 멸균 상태여야 하며, 오직 생체 조직 조작용으로만 사용해야 합니다. 포름알데히드와 같은 고정액과 접촉한 적이 있는 도구는 절대 사용하지 마십시오. 절편은 일반적으로 최대 36시간 동안 생존 가능하며, 24시간에서 36시간 사이에 이동성, 속도 및 방향성에서 눈에 띄는 저하가 나타납니다.

실험 및 분석을 계획할 때 이러한 제한 사항에 유의하십시오.