Name: 셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 세포 유형별 단백질 국소화와 핵세포질 왕복 운반을 분석하는 헤테로카리온 기법을 사용하여 형광 표지 융합 단백질로 단백질 이동을 실시간 관찰하는 방법입니다.

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우리는 자금에 대한 화학 생화학의 우스터 폴리 테크닉 연구소 부서를 감사드립니다.

1. 세포 라인의 Transfection Transfection 방법 1 (증가 기본 세포 transfection 효율을위한 Lonza의 Nucleofection) <ol><li> 세포는 최근 통과 사전 transfection 로그 위상 성장해야합니다. phophate의 세포를 세척하는 것은 trypsinization하여 생리 (PBS)와 수확 세포를 버퍼. </li><li> 5 분 1,500 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> 6 잘 플레이트에 살균 커버 전표를 추가합니다. 커버 풀렸는데이 향상 세포 접착을위한 코팅 수 있습니다. 플레이스 1.5 문화 미디어의 ML (이 경우에는 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)) 각 우물에와 인큐베이터에있는 미디어를 평형. </li><li> 인산염의 최소 볼륨에서 trypsinization와 resuspend하여 세포를 수확하는 것은 (PBS) 살린 버퍼. </li><li> 세포를 카운트하고 샘플 당 ~ 5x10 5 세포를 제공하기 위해 resuspension의 정확한 금액을 원심 분리기. </li><li> 샘플 당 100 μL 실내 온도 Nucleofector 솔루션에 신중하게 세포를 Resuspend. </li><li> 5 μg 플라스미드 DNA와 세포 현탁액을 100 μL을 결합하고 기포를 포함하지 않도록주의되는 Nucleofector 쿠베트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 해당 Nucleofector 프로그램 (이것은 최소한의 사망률과 최적의 transfection 효율을 수립 이전에 테스트를 요구할 수 있습니다)를 선택합니다. </li><li> Nucleofector 쿠베트 홀더에 세포 / DNA 정지를 포함하는 쿠베트를 삽입하고 선택한 프로그램을 시작합니다. </li><li> 완료되면, 쿠베트을 제거하고 (6 - 음 판에서 가져온)로 사전 equilibrated 문화 미디어의 ~ 500 μL를 추가합니다. </li><li> 즉시 잘 당 1.5 ML의 최종 볼륨 6 잘 플레이트에 샘플을 전송합니다. 전지는 컨트롤, 혼합 또는 별도로 인구 중으로 도금되어야합니다. </li></ol> Transfection의 방법 2 (세포 라인에 대한 Qiagen Effectene의 transfection) <ol><li> 첫번째 200 μL EC 버퍼 각 플라스미드 DNA 샘플의 0.8 μg을 추가하여 Qiagen Effectene 시약을 사용하여 transfection의 단지를 준비합니다. </li><li> 각 샘플에 6.4 μL 향상제 시약을 추가, 튜브를 flicking하여 간략하게 혼합하고, 실온에서 2 분 알을 품다. </li><li> 튜브를 flicking하여 각 샘플, 혼합 20 μL Effectene 시약을 추가하고, 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 이 부화하는 동안 transfection에 대한 관심의 두 세포 라인을 준비합니다. 한번 인산염 최근 passaged 세포를 (&lt;80 % 합류) 세척 식염수 (PBS)가 버퍼. 다시 1.5 ML 신선한 예열 및 equilibrated 성장 매체를 추가하십시오 (이 경우에는 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)). </li><li> transfection의 단지 15 분 동안 incubated 후에는, 각 샘플 미디어 1.2 ML를 전송합니다. pipetting, 즉시 6 자 판에서 두 우물의 각 단지의 ~ 700 μL를 전송하여 섞는다. dropwise 추가하고 번호판을 소용돌이로 부드럽게하여 섞는다. 세포가 적어도 3 시간 동안 transfect 수 있도록 허용 (세포 유형과 다를 수 있습니다.) </li><li> 새로운 6 - 잘 플레이트에 살균 커버 전표를 추가합니다. 커버 풀렸는데이 향상 세포 접착을위한 코팅 수 있습니다. </li><li> 세포 transfected 후, 각 잘하는 약 100 μL 트립신 솔루션을 추가 간단히 완전히 코트 각각 잘 수있는 접시 agitating, 즉시 트립신을 aspirating하여 PBS로 두 번 세포를 씻어하고 최소한의 trysinization하여 세포를 수확. 세포가 해제되면, 1.5 ML 신선한 미디어를 추가할 수 있습니다. </li><li> 이 시점에서, 세포는 멸균 커버 전표에 혼합 또는 별도의 중 인구 (컨트롤)에 도금되어야합니다. </li><li> 세포는 12 시간 복구할 수 있습니다. </li></ol> 2. 세포 융합 <ol><li> 세포에서 문화 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 씻는다. </li><li> 이 시점에서, 그것은 단백질 합성을 억제하기 위해 cycloheximide (100 μg / ML)로 세포를 치료하는 것이 좋습니다. 세포 2 시간 동안 부화 후 PBS로 두 번 세포를 씻어 수 있습니다. </li><li> 상온에서 1백25초에 대한 혈청없는 DMEM에 50% 폴리에틸렌 글리콜 1000 (PEG 1000)의 솔루션을 노출하여 퓨즈 세포. </li><li> PEG 1000 솔루션을 제거하고 신선한 예열 및 equilibrated 미디어이 ML을 추가하는 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 24시간 - 세포가 18 품어 수 있습니다. </li></ol> 형광 현미경 <ol><li> 문화 미디어를 제거하고, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 각각 잘 수있는 4 % paraformaldehyde 용액 (PBS)를 1 ML를 추가하여 세포를 수정. 부드럽게 15 분 동안 선동. </li><li> 두 번 PBS에 고정 세포를 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 접시에서 커버 전표를 제거, 여분의 PBS에서 심지. 현미경에 장착 매체 중 하나를 드롭 (90 % 글리세롤, 100mM 트리스 산도 7.5, 2% DABCO (1,4 - diazabicoyclo - 옥탄)이있는 DAPI (4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole)와로드 슬라이드. 반전 </li><li> 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거하고, 인감 공동버전은 매니큐어와 전표. </li><li> 공촛점 또는 epifluorescence 현미경을 통해 세포를 시각화. </li></ol> 3. 대표 결과 그림 2는 기본 섬유아 세포 및 H1299 비 작은 세포 폐 암종 세포를 사용하는 예제 heterokaryon 실험을 보여줍니다. 본 실험에 대한 관심의 단백질 (치킨 빈혈 바이러스 - VP3)는 epifluorescence 현미경에 의해 시각으로 기본 셀 형식에 주로 세포질 현지화 및 변형 세포 유형에 핵 지방화를 표시합니다. 단백질은 H1299 세포의 기본 포피의 섬유아 세포 (PFF) 또는 dsRed에서 GFP 중 하나에 융합 (pE​​GFP - N1 벡터, Clontech) (dsRed - N1 벡터, Clontech)로 표시됩니다. 자기 fusions 관련된 컨트롤 샘플 (상위 2 행)은 정상 상태 로컬 라이제이션 패턴에는 변화와 multinucleated 세포를 표시합니다. 이러한 변경 사항은 별도로 융합 조건이나 syncitia의 형성에 감도로 인해 발생할 수 있습니다. Heterokaryon의 fusions (하단 행)는 GFP - 융합 기본 셀 - 파생 단백질과 변형 세포 물질의 도입에 대응 dsRed - 융합 단백질로 colocalization의 핵 항목을 보여줍니다. 표시 예제는 두 fluoroprotein 신호의 존재에 의해 입증 두 세포, 각 유형 중 하나에서 발생하는 비교적 드문 heterokaryon 융합이다. 현지화 전환 이러한 유형의 탐지뿐만 아니라, nucleocytoplasmic 였죠 활동은 쉽게 두 핵 사이에 하나의 형광단의 존재에 의해 감지가 가능하다. 1시 1분 세포 fusions을 검토하고 번역의 억제에 따라 것이다 때 결정이 유형의 분명하다. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 기본 섬유아 세포 및 H1299 비 작은 세포 암종 세포를 사용하여 heterokaryon 방식의 플로우 차트. 관심 유전자 두 형광 단백질 유전자 중 하나의 프레임 융합을 생산하기 위해 복제됩니다. 셀 라인은 다음 transiently 중 구조로 transfected하고 복구하는 허용됩니다. Heterokaryon 형성은 더욱 부화 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 간단한 치료에 의해 유발됩니다. 마지막으로, 관심의 단백질의 하위 세포 로컬 리 제이션은 형광 현미경의 다양한 형태를 사용하여 관찰합니다. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Nucleocytoplasmic 밀매와 치킨 빈혈 바이러스 VP3 단백질의 활동을 였죠은 heterokaryon 융합에 의해 시각. 끝줄 : dsRed - VP3을 표현 자체 융합 H1299 세포의 대표 이미지 중간 행 :.. PEG 융합 후 GFP - VP3을 표현하는 기본 포피의 fibroblast 세포 (PFF) 대표 epifluorescence 이미지 아래 행 : PFF 및 H1299 세포의 Heterokaryon 융합. 노란색은 GFP와 dsRed 신호 colocalization을 나타냅니다. 전지 Leica AF6000E 형광 현미경 및 Leica 이미징 소프트웨어를 사용하여 몇 군데 있었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

heterokaryon 프로토콜은 세포 유형의 특정 현지화 행동뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 였죠 활동의 특성화를위한 효율적이고 쉽게 interpretable 방법을 제공 여기를 발표했다. 이 방법은 형광 분석의 감도뿐만 아니라 기능 영상 라이브 세포와 단백질 역학 연구를 수행을 활용합니다. 기술은 쉽게 다양한 세포 유형에 적응하고 생활하고 고정 세포 이미징 모두 의무입니다. 예를 들어, 거꾸로 형광 현미경은 라이브 이미징 및 시간 저속 비디오 캡처에 사용할 수 있습니다. 반대로, 탑재 전지가 정상 상태 localizations 또는 개별 localizations의 상세한 공촛점 이미징의 결정 모두에 대해 epifluorescence 현미경에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 photobleaching 후 형광 복구 (FRAP) 또는 photobleaching에 형광 손실 (플립)와 같은 기술은 현지화 속도론 1의 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 대체 fluorophores의 결합 콘서트 2 수행하는 형광 공명 에너지 전달 (무서워) 같은 단백질 상호 작용 실험을 허용합니다. 이러한 leptomycin의 B 또는 부정적인 지배와 같은 세포 인신 매매의 다양한 억제제는 GTPase 구성 요소가 특정 가져 오거나 내보내기 경로 5,6,9에 의존을 확립하는 데 사용할 수있는 랜. <ul><li> 활동을 였죠 관련된 특정 실험에서, 관리는 새로운 단백질의 합성에 의한 현지화 효과를 피하기 위해 이동해야합니다. 이러한 경우에는 번역 억제제 또는 제한된 시간 포인트를 사용해야합니다. 그러나, translational 억제로 인해 유물은 가능성이 남아있다. 각 세포 유형 중 하나를 포함하는 셀 fusions은 대부분 였죠 및 현지화 문제의 명확한 해석에 대해 원하는합니다. 휴대폰 번호 및 융합 조건 (타이밍 및 농도)의 최적화는 유리한 1:1 퓨전 이벤트를 홍보해야 할 수도 있습니다. </li><li> 프로토콜의 특정 단계의 최적화를 사용하는 특정 세포 종류에 따라 필요합니다에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 융합 효율, transfection 효율, 그리고 퓨전 후 생존 능력으로 실험 절차 측면 세포 유형 간의 큰 차이가있을 수 있습니다. 특히, 기본 세포 유형은 복합 문화 조건과 낮은 transfection 효율성으로 인해 관리하기 위해 도전하실 수 있습니다. 같은 Lonza Nucleofector 장치로 기술의 사용은 세포의 신속한 처리를 위해뿐만 아니라 급격하게 증가 transfection 효율 허용할 수 있습니다. 또한, electroporation 방법은 다음과 융합의 단계를 중지 세포 쉽게 전송하실 수 있습니다. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene 시약</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s 배지 (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>고농도 포도당</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 혈청 (태아 송아지)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF 키트</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 heterokaryon 기법

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

단백질의 상당수는 subcellular 매매 또는 였죠 nucleocytolasmic에 의해 규제됩니다. 이러한 단백질은 핵 수입 / RNA와 단백질의 수출, transcriptional 규제 및 apoptosis를 포함한 세포 기능의 다양한 배열을 표시합니다. 흥미롭게도, 세포 분열, 분화 및 변형 등 주요 휴대폰 reorganizations는 종종 그러한 활동을 할 3,4,8,10를 포함. 이러한 단백질과 해당 규제 메커니즘의 상세한 연구는 이러한 현지화 변경 기묘한 수에 대한 자극하고, 스스로 추적하는 매우 역동적이고 어려울 수있는 움직임으로 도전하실 수 있습니다. 세포 oncogenesis과 관련된 연구는 예를 들어, 이해의 경로와 정상 세포 및 기본 세포 변형 6,7,11,12 다를 단백질 활동의 혜택을 계속합니다. 많은 단백질은 변경 변형 동안이나 변환의 결과로 현지화 효율적으로이 단백질을 특성화 방법과 그들이 마약 타겟팅 oncogenesis 및 오픈 새로운 영역에 대한 이해를 향상시키기 위해 서 참여하는 경로를 보여으로. 여기 단백질 인신 매매의 분석을위한 방법을 제시하고 기본 및 변형 포유 동물 세포 사이의 활동을 였죠. 이 방법은 정상 상태 또는 동적 단백질 localizations를 감지하는 데 사용할 수있는 유연한 프로토콜을 제공하기 위해 형광 현미경과 heterokaryon의 fusions의 생성을 결합한 제품입니다. 그림 1과 같이, 두 개의 세포 종류 transiently 관심의 유전자에 부착된 fluoroprotein의 유전자를 플라스미드 베어링 구성과 transfected 있습니다. 표현 후, 전지는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합하고, 단백질 localizations 그런 다음 다양한 방법을 사용하여 몇 군데있을 수 있습니다. 여기에 제시 프로토콜은 전문 기술이 추가될 수도 있습니다에 대한 근본적인 접근 방식이다.

였죠 셀 유형 - 특정 단백질 현지화 및 nucleocytoplasmic의 특성화를위한 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 heterokaryon 접근은 세포 융합 후 이미지 단백질 localizations에 찬란 - 표시 융합 단백질을 사용합니다. 프로토콜은 정상 상태 localizations 또는 라이브 셀 이미징을 기반으로보다 역동적인 결정 의무가 있습니다.

셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법

상당수의 단백질이 세포 내 수송(subcellular trafficking) 또는 핵-세포질 셔틀링(nucleocytolasmic shuttling)에 의해 조절됩니다. 이러한 단백질들은 다음과 같은 다양한 ...

본 절차의 전반적인 목표는 두 종류의 서로 다른 형광 단백질이 결합된 단일 단백질을 두 개의 개별 세포주에서 발현시킨 후, 이 세포주들을 융합하여 단백질의 이동을 추적하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 유전자가 두 가지 서로 다른 형광 단백질 유전자 중 하나와 융합된 플라스미드를 두 가지 서로 다른 세포 유형에 각각 형질전환합니다. 절차의 두 번째 단계는 세포들을 함께 혼합하여 각 세포 유형에서 단백질이 축적되도록 하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 단백질 합성을 억제한 후 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포를 융합하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 형광 현미경을 통해 단백질 국소화를 시각화하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경을 통해 단백질 국소화 또는 트래픽킹 거동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 세포가 변형됨에 따라 개별 단백질의 기능과 행동이 어떻게 변화하는지와 같이 암 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 변형된 세포 특이적 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 분화, 발생 생물학 및 세포 신호 전달과 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 세포 유형마다 트랜스펙션 조건과 융합 조건을 각각 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 세포 내로 플라스미드 DNA를 도입하기 위해 처음으로 시연하는 방법은 NU Nuclear Affection 방법입니다. 이 방법은 Lonza nuclear effector 솔루션을 사용하며, 최근 계대 배양되어 대수 성장기에 있는 세포를 phosphate buffered saline PBS로 세척하고 원심 분리를 통해 수집하는 것으로 시작합니다. 세포의 부착력이 사라지면 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신을 중화하고, 1500 G에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수집합니다.조직 배양 후드 내에서 6-웰 플레이트에 멸균된 커버슬립을 넣은 다음, 각 웰에 완전 배양액 1.5 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 덮고 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 평형 상태가 되도록 합니다.원심분리 후 튜브를 후드로 옮겨 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿을 최소량의 PBS로 재현탁합니다. 다음으로 세포 수를 측정하고 세포 현탁액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 이를 통해 샘플당 약 5×10⁵개의 세포를 확보하며, 1500 G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.원심분리가 완료되면 튜브를 세포 배양 후드로 옮겨 SNA를 흡인하고 조심스럽게 재현탁합니다. 각 튜브의 세포를 상온의 nuclear effector solution 100 microliters로 부유시킵니다. 그 다음 각 샘플에 plasma DNA 5 micrograms를 첨가하고, 샘플을 nuclear effector Q vete로 옮긴 후 덮개를 닫습니다.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 샘플 qve를 Q vet 홀더에 삽입하십시오. 적절한 핵 효과기 프로그램을 선택하고 실행하십시오.최소한의 사망률로 최적의 형질전환 효율을 설정하기 위해서는 사전 테스트를 통해 가장 적절한 프로그램을 선택해야 할 수도 있습니다. 그 다음, 혼합 집단 또는 대조군으로서 각각 별도로 세포를 6-웰 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 세포가 12시간 동안 회복되도록 둡니다.플라스미드의 일시적 발현을 위해 시연하는 두 번째 방법은 kagen 영향 시약을 이용한 형질전환입니다. 먼저, 멸균된 원심분리 튜브에 각 플라스미드 DNA 샘플 0.8 micrograms를 EC buffer 200 microliters에 추가합니다. 그다음, 각 샘플에 enhancer reagent 6.4 microliters를 추가합니다.튜브를 가볍게 튕겨 짧게 혼합한 후 실온에서 2분 동안 배양합니다. 이 짧은 배양 단계 후에 각 샘플에 20 µL의 영향 시약을 첨가합니다. 각 튜브를 튕겨 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.배양하는 동안, 실험에 사용할 두 가지 세포주를 준비합니다. transfection을 위해 세포는 최근에 계대 배양되었어야 하며, 약 80% confluence의 대수 성장기에 있어야 합니다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 1.5 milliliters를 다시 첨가합니다.DNA transfection 시약이 15분 동안 배양되었으므로, 각 샘플에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 1.2 milliliters를 첨가하여 피펫팅으로 혼합하고, 즉시 이 복합물 약 700 microliters를 6-well 플레이트의 두 웰에 각각 방울방울 옮깁니다. 플레이트를 회전시켜 혼합합니다. 세포 배양 후드 내 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 transfection이 진행되도록 합니다. 필요한 경우 6-well 플레이트의 웰당 하나의 멸균된 커버스립을 넣습니다.세포 부착을 강화하기 위해 코팅된 커버슬립을 사용할 수 있습니다. 다음으로, 형질전환된 세포를 PBS로 두 번 세척하고 최소한의 트립신 처리를 통해 세포를 회수합니다. 이는 각 웰에 100 µL의 트립신 용액을 첨가하고 플레이트를 흔들어 용액이 완전히 도포되도록 하여 수행합니다.그런 다음 잔류 트립신을 즉시 흡입하여 제거합니다. 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 1.5 milliliters로 세포를 재부유시켜 남은 트립신을 중화합니다. 세포를 혼합 집단으로 또는 대조군으로서 개별적으로 플레이트에 분주합니다. 커버슬립이 들어 있는 6-웰 플레이트의 경우, 세포 배양 인큐베이터에서 12시간 동안 세포를 회복시킵니다.트랜스펙션 방법과 관계없이, hetero carry infusion을 생성하는 절차는 동일합니다. 트랜스펙션 후, 웰에서 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 추가적인 단백질 합성을 억제하기 위해 cyclo heide로 세포를 처리하는 것이 권장됩니다.배양액에 100 µg/mL 농도의 cycloheximide를 첨가하여 세포를 덮고, 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS로 2회 세척합니다. 융합을 유도하기 위해, serum-free DMEM에 50% polyethylene glycol 1000이 포함된 용액으로 세포를 덮고 125초 동안 배양합니다.실온에서 PEG 용액을 제거하고, 잔류 PEG를 없애기 위해 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 37 °C로 가온한 10% FBS가 포함된 DMEM 2 mL를 첨가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 18~24시간 동안 배양합니다.18~24시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 세포를 PBS로 2회 세척합니다. 다음으로 각 웰에 PBS에 희석된 4% paraform aldehyde 1 mL를 피펫으로 넣고 15분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.배양하는 동안, dpi가 포함된 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨려 사용할 현미경 슬라이드를 준비합니다. 그다음 고정된 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 작은 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 조직 조각으로 잔류 PBS를 닦아낸 후, tappi가 함유된 마운팅 용액이 있는 현미경 슬라이드 위에 세포 면이 아래로 향하도록 놓습니다.티슈 페이퍼를 사용하여 슬라이드에서 과도한 봉입제를 제거하고 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 매니큐어를 사용하여 밀봉하면, 이제 공초점 또는 에피 형광 현미경으로 세포를 관찰할 수 있습니다. 이 흐름도에서는 단백질의 세포 유형 특이적 국소화 분석을 위한 hetero 방법이 세 가지 기본 단계로 나타나 있습니다.폴리에틸렌 글리콜 1000을 이용한 형광 표지 단백질 발현 플라스미드의 세포 융합 형질전환 및 형광 현미경 이미징 결과, 이러한 에피 형광 이미지에서 볼 수 있듯이, GFP가 표지된 chicken anemia virus VP3 단백질을 발현하는 일차 포피 섬유아세포의 자체 융합 대조군과 비소세포폐암 세포주 H1299에서는 단백질이 주로 세포질에 국소화됨이 나타납니다. 동일한 VP3 단백질이 DsRED로 표지된 자체 융합 대조군에서는 주로 핵 내 국소화가 관찰됩니다. 일차 포피 섬유아세포와 H1299 세포의 이종 세포 융합은 변형된 세포 물질이 일차 포피 섬유아세포로 도입되게 하며, 이로 인해 일차 세포 유래 GFP 표지 VP3의 국소화가 핵으로 변화하게 됩니다.이 절차를 수행할 때, 성공 여부는 사용되는 특정 세포 유형의 형질전환 효율과 해당 세포에 최적화된 융합 조건에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 국소화 역동성의 실시간 분석과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 flip 및 frap과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 표지 단백질을 도입하고 세포 융합을 생성함으로써 세포 유형 특이적 단백질 국소화를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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생물학

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

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분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

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세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

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단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

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밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

학습하세요 세포 유형별 단백질 국소화와 핵세포질 왕복 운반을 분석하는 헤테로카리온 기법을 사용하여 형광 표지 융합 단백질로 단백질 이동을 실시간 관찰하는 방법입니다.

셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법

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