셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법

본 절차의 전반적인 목표는 두 종류의 서로 다른 형광 단백질이 결합된 단일 단백질을 두 개의 개별 세포주에서 발현시킨 후, 이 세포주들을 융합하여 단백질의 이동을 추적하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 유전자가 두 가지 서로 다른 형광 단백질 유전자 중 하나와 융합된 플라스미드를 두 가지 서로 다른 세포 유형에 각각 형질전환합니다. 절차의 두 번째 단계는 세포들을 함께 혼합하여 각 세포 유형에서 단백질이 축적되도록 하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 단백질 합성을 억제한 후 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포를 융합하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 형광 현미경을 통해 단백질 국소화를 시각화하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경을 통해 단백질 국소화 또는 트래픽킹 거동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 세포가 변형됨에 따라 개별 단백질의 기능과 행동이 어떻게 변화하는지와 같이 암 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 변형된 세포 특이적 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 분화, 발생 생물학 및 세포 신호 전달과 같은 다른 연구에도 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 세포 유형마다 트랜스펙션 조건과 융합 조건을 각각 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 세포 내로 플라스미드 DNA를 도입하기 위해 처음으로 시연하는 방법은 NU Nuclear Affection 방법입니다. 이 방법은 Lonza nuclear effector 솔루션을 사용하며, 최근 계대 배양되어 대수 성장기에 있는 세포를 phosphate buffered saline PBS로 세척하고 원심 분리를 통해 수집하는 것으로 시작합니다. 세포의 부착력이 사라지면 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신을 중화하고, 1500 G에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 수집합니다.

조직 배양 후드 내에서 6-웰 플레이트에 멸균된 커버슬립을 넣은 다음, 각 웰에 완전 배양액 1.5 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 플레이트를 덮고 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 평형 상태가 되도록 합니다.

원심분리 후 튜브를 후드로 옮겨 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 펠릿을 최소량의 PBS로 재현탁합니다. 다음으로 세포 수를 측정하고 세포 현탁액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 이를 통해 샘플당 약 5×10⁵개의 세포를 확보하며, 1500 G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 튜브를 세포 배양 후드로 옮겨 SNA를 흡인하고 조심스럽게 재현탁합니다. 각 튜브의 세포를 상온의 nuclear effector solution 100 microliters로 부유시킵니다. 그 다음 각 샘플에 plasma DNA 5 micrograms를 첨가하고, 샘플을 nuclear effector Q vete로 옮긴 후 덮개를 닫습니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 샘플 qve를 Q vet 홀더에 삽입하십시오. 적절한 핵 효과기 프로그램을 선택하고 실행하십시오.

최소한의 사망률로 최적의 형질전환 효율을 설정하기 위해서는 사전 테스트를 통해 가장 적절한 프로그램을 선택해야 할 수도 있습니다. 그 다음, 혼합 집단 또는 대조군으로서 각각 별도로 세포를 6-웰 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 세포가 12시간 동안 회복되도록 둡니다.

플라스미드의 일시적 발현을 위해 시연하는 두 번째 방법은 kagen 영향 시약을 이용한 형질전환입니다. 먼저, 멸균된 원심분리 튜브에 각 플라스미드 DNA 샘플 0.8 micrograms를 EC buffer 200 microliters에 추가합니다. 그다음, 각 샘플에 enhancer reagent 6.4 microliters를 추가합니다.

튜브를 가볍게 튕겨 짧게 혼합한 후 실온에서 2분 동안 배양합니다. 이 짧은 배양 단계 후에 각 샘플에 20 µL의 영향 시약을 첨가합니다. 각 튜브를 튕겨 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양하는 동안, 실험에 사용할 두 가지 세포주를 준비합니다. transfection을 위해 세포는 최근에 계대 배양되었어야 하며, 약 80% confluence의 대수 성장기에 있어야 합니다. 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 1.5 milliliters를 다시 첨가합니다.

DNA transfection 시약이 15분 동안 배양되었으므로, 각 샘플에 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 1.2 milliliters를 첨가하여 피펫팅으로 혼합하고, 즉시 이 복합물 약 700 microliters를 6-well 플레이트의 두 웰에 각각 방울방울 옮깁니다. 플레이트를 회전시켜 혼합합니다. 세포 배양 후드 내 인큐베이터에서 최소 3시간 동안 transfection이 진행되도록 합니다. 필요한 경우 6-well 플레이트의 웰당 하나의 멸균된 커버스립을 넣습니다.

세포 부착을 강화하기 위해 코팅된 커버슬립을 사용할 수 있습니다. 다음으로, 형질전환된 세포를 PBS로 두 번 세척하고 최소한의 트립신 처리를 통해 세포를 회수합니다. 이는 각 웰에 100 µL의 트립신 용액을 첨가하고 플레이트를 흔들어 용액이 완전히 도포되도록 하여 수행합니다.

그런 다음 잔류 트립신을 즉시 흡입하여 제거합니다. 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM 1.5 milliliters로 세포를 재부유시켜 남은 트립신을 중화합니다. 세포를 혼합 집단으로 또는 대조군으로서 개별적으로 플레이트에 분주합니다. 커버슬립이 들어 있는 6-웰 플레이트의 경우, 세포 배양 인큐베이터에서 12시간 동안 세포를 회복시킵니다.

트랜스펙션 방법과 관계없이, hetero carry infusion을 생성하는 절차는 동일합니다. 트랜스펙션 후, 웰에서 배양액을 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 다음으로, 추가적인 단백질 합성을 억제하기 위해 cyclo heide로 세포를 처리하는 것이 권장됩니다.

배양액에 100 µg/mL 농도의 cycloheximide를 첨가하여 세포를 덮고, 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS로 2회 세척합니다. 융합을 유도하기 위해, serum-free DMEM에 50% polyethylene glycol 1000이 포함된 용액으로 세포를 덮고 125초 동안 배양합니다.

실온에서 PEG 용액을 제거하고, 잔류 PEG를 없애기 위해 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 37 °C로 가온한 10% FBS가 포함된 DMEM 2 mL를 첨가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 18~24시간 동안 배양합니다.

18~24시간 동안 배양한 후, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 세포를 PBS로 2회 세척합니다. 다음으로 각 웰에 PBS에 희석된 4% paraform aldehyde 1 mL를 피펫으로 넣고 15분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.

배양하는 동안, dpi가 포함된 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨려 사용할 현미경 슬라이드를 준비합니다. 그다음 고정된 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 작은 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 조직 조각으로 잔류 PBS를 닦아낸 후, tappi가 함유된 마운팅 용액이 있는 현미경 슬라이드 위에 세포 면이 아래로 향하도록 놓습니다.

티슈 페이퍼를 사용하여 슬라이드에서 과도한 봉입제를 제거하고 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 매니큐어를 사용하여 밀봉하면, 이제 공초점 또는 에피 형광 현미경으로 세포를 관찰할 수 있습니다. 이 흐름도에서는 단백질의 세포 유형 특이적 국소화 분석을 위한 hetero 방법이 세 가지 기본 단계로 나타나 있습니다.

폴리에틸렌 글리콜 1000을 이용한 형광 표지 단백질 발현 플라스미드의 세포 융합 형질전환 및 형광 현미경 이미징 결과, 이러한 에피 형광 이미지에서 볼 수 있듯이, GFP가 표지된 chicken anemia virus VP3 단백질을 발현하는 일차 포피 섬유아세포의 자체 융합 대조군과 비소세포폐암 세포주 H1299에서는 단백질이 주로 세포질에 국소화됨이 나타납니다. 동일한 VP3 단백질이 DsRED로 표지된 자체 융합 대조군에서는 주로 핵 내 국소화가 관찰됩니다. 일차 포피 섬유아세포와 H1299 세포의 이종 세포 융합은 변형된 세포 물질이 일차 포피 섬유아세포로 도입되게 하며, 이로 인해 일차 세포 유래 GFP 표지 VP3의 국소화가 핵으로 변화하게 됩니다.

이 절차를 수행할 때, 성공 여부는 사용되는 특정 세포 유형의 형질전환 효율과 해당 세포에 최적화된 융합 조건에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 국소화 역동성의 실시간 분석과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 flip 및 frap과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 표지 단백질을 도입하고 세포 융합을 생성함으로써 세포 유형 특이적 단백질 국소화를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.