모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

본 실험의 전반적인 목표는 곤충 신경계로부터 후각 반응을 쉽게 기록하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 살아있는 나방을 고정하고 더듬이나 개별 뉴런에 전극을 연결하여 후각 자극으로 유도된 반응을 기록함으로써 달성됩니다. 첫 번째 단계로, 접지로 사용하기 위해 식염수가 채워진 유리 전극을 눈에 삽입하며, 두 번째 단계로 고정된 나방의 더듬이에 식염수가 채워진 유리 전극을 삽입하여 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 단위 반응을 기록하기 위한 안테나그램 형태의 전기적 반응 기록을 수행합니다.

기록 전극을 더듬이 기부에 삽입합니다. 다음으로, 안테나 신호를 증폭하여 아날로그-디지털 변환기로 전달함으로써 신호를 기록하고 저장합니다. 기록된 전기 신호를 EAG 신호 또는 스파이크 형태로 분석하여, 농도 의존적이며 후각 유발적인 반응 결과가 도출됩니다.

우리는 고정된 네이블 오렌지(Naval orange) 나방의 엔테로그램(Enterogram)을 기록하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술의 주요 장점은 준비된 상태가 오래 지속된다는 것이며, 동일한 나방을 여러 번 사용하여 다중 반응을 기록할 수 있고, 동일한 나방으로 촉각의 개별 센서로부터 단일 단위 반응을 기록할 수도 있다는 점입니다. 캘리포니아에서 중요한 농업적 위치를 차지하고 있기 때문에 우리는 네이블 오렌지 나방에 집중했습니다.

하지만 이 방법은 다른 나비목 곤충에게도 적용 가능하며, 기본 기능에 대한 근본적인 질문을 해결할 뿐만 아니라 새로운 유인제 개발에도 활용될 수 있습니다. 본 나방 후각 체계 연구에서는 네이블 오렌지 웜(naval orange worm), *Ullo Ella*를 사용합니다.

곤충 군집은 약 28°C의 온도, 약 75%의 상대 습도, 그리고 16시간 명기 및 8시간 암기로 구성된 광주기 조건의 환경 챔버 내에서 밀기브랜 식단을 통해 유지됩니다. 플라스틱 상자에 물에 적신 종이 타월을 최대 10겹으로 쌓아 갓 우화한 나방을 위한 용기를 만듭니다. 매일 우화하는 나방을 수집하여 성별을 구분한 후 플라스틱 상자로 옮깁니다. 전기생리학적 기록 준비를 위해 공기가 순환될 수 있도록 상자를 구멍이 뚫린 덮개로 덮습니다.

먼저, 200 µL 피펫 팁을 잘라 팁의 직경이 약 2 mm가 되도록 하여 나방 고정 장치를 만듭니다. EAG 또는 SSR의 경우, 우화 후 2~4일 된 나방을 선택합니다. 습윤 티슈 페이퍼 스텁을 사용하여 나방을 팁 반대쪽 끝에서 피펫 내부로 넣고, 나방을 피펫 팁 쪽으로 조심스럽게 밀어 넣습니다.

더듬이와 머리 일부가 끝단으로 돌출될 때까지 나방을 계속 밀어 넣으십시오. 건조되지 않는 점토로 머리를 덮어 노출된 머리를 고정하되, 한쪽 눈의 일부분과 두 개의 더듬이는 노출된 상태로 둡니다. 팁 직경이 1 µm 미만인 유리 전극을 사용하여, 나방 표본을 두 전극 홀더 사이의 전기도표 마이크로 조작기 플랫폼 위에 놓으십시오. 전극을 centum limb ringer로 다시 채웁니다.

현미경으로 관찰하면서 눈의 노출된 부위에 전극 하나를 삽입합니다. 이것이 기준 전극 역할을 합니다. 다음 단계는 안테나에 기록 전극을 배치하는 것입니다.

수컷 해군오렌지벌레나방(naval orangeworm moth)의 촉각은 여러 개의 마디로 구성되어 있으며, 각 마디에는 다수의 털 모양 구조가 달려 있습니다. illa의 경우, 삽입도는 촉각에서의 기록을 용이하게 하기 위해 illa의 세부 모습을 보여주는 주사 전자 현미경 사진입니다. 촉각의 원위부 마디 1~2개를 절단하십시오.

다음으로, 두 더듬이를 모두 기록 전극에 삽입합니다. 또는, 단일 감각기 기록을 위해 감각기의 기부에 기록 전극을 삽입합니다. 감각기에서 발생하는 활동 전위는 고임피던스 전치 증폭기에 의해 증폭되며, USB 지능형 디지털-아날로그 변환기로 전송되어 autos spike 소프트웨어를 통해 오프라인으로 분석됩니다.

다음 단계는 네이벌 오렌지 웜(naval orange worm)의 암컷 페로몬 혼합물의 주요 성분인 ZZ 1113 HEXA deca Now를 사용하여 화학적 자극제를 준비하는 것입니다. 해당 화학 물질을 헥산(hexane)으로 희석하여 DIC 희석액을 만듭니다. 10 µL의 자극제 용액을 왓맨(Watman) 여과지에 로드합니다. 10초 동안 가볍게 흔들어 용매를 증발시킵니다.

흄 후드 아래에서, 스트립을 5 mL 폴리프로필렌 주사기에 넣고, 헥산 단독 주사기와 빈 주사기를 사용하여 준비 과정을 제어합니다. EAG 또는 SSR은 자극 제어기에 의해 초당 20 mL로 공급되는 가습 공기 흐름 속에 유지됩니다. 화학 자극제가 들어 있는 주사기를 공기 흐름 제어기에 연결합니다.

2초 동안 기저 전기 신호를 기록합니다. 그런 다음 Airstream에 4 mL/s의 자극 펄스를 500 ms 동안 가합니다. 이후 8초 동안 전기 신호 기록을 계속합니다.

자극 사이에 최소 1분의 간격을 둡니다. 이 수치는 고정된 수컷 나방의 촉수에서 나타나는 강력한 용량 의존적 반응을 보여줍니다. 암컷 페로몬 성분인 CZ 1113 hexaco로 자극하였습니다.

헥산에 대한 반응입니다. 매개체 대조군은 파란색 선으로 연속적으로 표시되어 있습니다. 페로몬의 용량이 커질수록 전기도표 기록의 크기가 연속적으로 증가합니다.

이 그림은 암컷 페로몬 성분 자극에 반응하는 tric andum의 세포외 단일 단위 기록을 보여줍니다. 이러한 기록은 용량 의존적인 흥분 반응을 나타냅니다. 숙련된다면, 이 기술은 제대로 수행했을 때 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 방법을 사용할 때는 오염을 방지하고 가능한 한 순도가 높은 화학 물질을 사용하십시오.