모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

다음 실험의 전체적인 목표는 곤충 신경계로부터 후각 반응을 기록하는 방법이 용이함을 입증하는 것입니다. 이는 살아있는 나방을 고정하고 더듬이나 개별 뉴런에 전극을 연결하여 후각 자극에 의해 유도된 반응을 기록함으로써 이루어집니다. 첫 번째 단계로, 접지 전극으로서 생리식염수가 채워진 유리 전극을 눈에 삽입합니다. 두 번째 단계로, 고정된 나방의 더듬이에 생리식염수가 채워진 유리 전극을 삽입하여 안테나그램(antenna gram) 형태의 전기적 반응을 기록하거나, 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 단위 반응(single unit responses)을 기록합니다.

기록 전극을 더듬이 기부에 삽입합니다. 다음으로, 안테나 신호를 증폭하여 아날로그-디지털 변환기로 보내 신호를 기록하고 저장합니다. 기록된 전기 신호인 EAG 신호 또는 스파이크 형태를 통해, 농도 의존적인 후각 유발 반응 결과가 도출됩니다.

우리는 고정된 네이벌 오렌지(Naval orange) 나방의 엔테로그램(Enterogram)을 기록하는 새로운 방법을 개발하였습니다. 이 기술의 주요 장점은 준비된 상태가 오래 지속된다는 것이며, 동일한 나방을 여러 번 사용하여 다수의 반응을 기록할 수 있고, 또한 동일한 나방을 통해 촉각의 개별 센서로부터 단일 단위 반응을 기록할 수 있다는 점입니다. 네이벌 오렌지는 캘리포니아의 중요한 농작물이기 때문에 연구 대상으로 선정하였습니다.

그러나 이 방법은 근본적인 후각 기능 문제를 해결하는 것뿐만 아니라 새로운 유인제 개발을 위해서도 다른나비목 곤충에 적용될 수 있습니다. 본 나방 후각 체계 연구에서는 네이블 오렌지 웜(Ullo Ella)을 사용합니다.

곤충 군집은 약 28°C의 온도, 약 75%의 상대 습도, 그리고 16시간 명기 및 8시간 암기로 구성된 광주기 조건의 환경 챔버 내에서 밀기브랜 식단으로 유지합니다. 플라스틱 상자에 물에 적신 종이 타월을 최대 10겹으로 깔아 갓 우화한 나방을 위한 용기를 준비합니다. 매일 우화하는 나방을 수집하여 성별을 구분한 다음, 플라스틱 상자로 옮깁니다. 전기생리학적 기록 준비를 위해 공기가 순환될 수 있도록 상자를 타공 덮개로 덮습니다.

먼저 200 µL 피펫 팁을 잘라 팁 직경이 약 2 mm가 되도록 하여 나방 고정대를 만듭니다. EAG 또는 SSR의 경우, 우화 후 2~4일 된 나방을 선택합니다. 가습된 티슈 페이퍼 조각을 사용하여 나방을 팁 반대쪽 끝에서 피펫 안으로 넣고, 나방을 피펫 팁 쪽으로 조심스럽게 밉니다.

더듬이와 머리의 일부가 끝부분에서 돌출될 때까지 나방을 계속 밀어 넣으십시오. 노출된 머리 부분을 건조되지 않는 점토로 덮어 고정하되, 한쪽 눈의 일부와 두 개의 더듬이는 노출된 상태로 둡니다. 팁 직경이 1 µm 미만인 유리 전극을 사용하여 나방 표본을 두 전극 홀더 사이의 electrogram microm manipulator 플랫폼 위에 배치하십시오. 전극을 centum limb ringer로 다시 채우십시오.

현미경을 통해 관찰하면서 전극 하나로 눈의 노출된 부위를 찌릅니다. 이것이 기준 전극 역할을 합니다. 다음 단계는 안테나에 기록 전극을 배치하는 것입니다.

수컷 해군 오렌지웜 나방(naval orangeworm moth)의 촉각은 여러 개의 마디로 이루어져 있으며, 각 마디에는 수많은 털 모양의 구조물이 달려 있습니다. illa, 삽입도는 촉각으로부터의 기록을 용이하게 하기 위해 illa의 상세 모습을 보여주는 주사전자현미경 사진입니다. 말단의 촉각 마디 1~2개를 절단하십시오.

다음으로, 두 촉각각(antennae)을 모두 기록 전극에 삽입합니다. 또는, 단일 감각모(sens) 기록의 경우, 감각모 기저부에 기록 전극을 삽입합니다. 감각모에서 발생한 활동 전위는 고임피던스 전치 증폭기에 의해 증폭되며, USB 지능형 디지털 아날로그 변환기로 전송되어 autos spike 소프트웨어를 통해 오프라인으로 분석됩니다.

다음 단계는 naval orange worm의 암컷 페로몬 혼합물의 주요 성분인 ZZ 1113 HEXA deca Now를 사용하여 화학적 자극제를 준비하는 것입니다. 이 화학 물질을 헥산으로 희석하여 DIC 희석액을 만듭니다. 10 µL의 자극제 용액을 watman 여과지에 로드합니다. 10초 동안 가볍게 흔들어 용매를 증발시킵니다.

흄 후드 아래에서, 스트립을 5 mL 폴리프로필렌 주사기에 넣고, 헥산만 넣은 빈 주사기를 사용하여 준비 과정을 대조군으로 설정합니다. EAG 또는 SSR은 자극 컨트롤러에 의해 초당 20 mL의 속도로 공급되는 가습된 공기 흐름 속에 유지됩니다. 화학 자극제가 들어 있는 주사기를 공기 흐름 컨트롤러에 연결합니다.

2초 동안 기저 전기 신호를 기록합니다. 그 다음 Airstream에 4 mL/s의 자극 펄스를 500 ms 동안 가합니다. 이후 8초 동안 전기 신호를 계속 기록합니다.

자극 사이에 최소 1분의 간격을 둡니다. 이 그림은 구속된 수컷 나방의 더듬이에서 나타나는 강력한 용량 의존적 반응을 보여줍니다. 암컷 페로몬 성분인 CZ 1113 hexaco로 자극하였습니다.

헥산에 대한 반응입니다. 파란색 선은 연속적인 용매 대조군을 나타냅니다. 페로몬의 용량이 증가함에 따라 전기도표 기록의 크기가 점차적으로 커집니다.

이 그림은 암컷 페로몬 성분의 자극에 반응하는 trichordum의 세포외 단일 유닛 기록을 보여줍니다. 이러한 기록은 용량 의존적인 흥분성 반응을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행했을 때 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 방법을 사용할 때는 오염을 방지하고 가능한 한 순도가 높은 화학 물질을 사용하십시오.