Name: 측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 학습하세요 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Caenorhabditis elegans의 수명을 측정하는 고효율 프로토콜을 통해 노화 메커니즘과 수명 연장 물질을 신속하게 선별하는 방법을 배우세요.

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이 프로토콜은 원래 린다 벅의 연구실에서 Xiaolan 예와 마이클 Petrascheck에 의해 시애틀에서 프레드 허치슨 암 연구 센터에서 개발되었습니다. 위의 자세한 버전은보다 넓은 지역 사회에 사용할 수있는 모든 절차를 준비하고 있습니다. 우리는 비판적 프로토콜을 읽기위한 캐롤 테일러, 사라 르뵈프와 앤디 Tomacelli 감사드립니다. 이것은 스크립스 연구소에서 원고 # 2866입니다. Petrascheck 연구소는 노바티스 ADI 프로그램에 의해 자금입니다.

개요 : 프로토콜은 네 부분으로 나뉩니다. 파트 1은 먹이 박테리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 파트 2 웜 문화를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 3 부에서는 수명을 점수하는 방법에 대해 설명합니다. 4 부에서는 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다, 그리고 제 5 부에 필요한 솔루션을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 수명 실험을 완료하는 데 몇 주가 걸릴. 프로토콜 주간의 각 단계에 대한, 일, 그리고 하루의 시간 계획을 용이하게하기 위해 포함됩니다. L4 단계 (데이 0) 전체 프로토콜에 대한 참조 포인트로 사용됩니다. 1. 수유 박테리아의 준비 이 섹션은 먹이 박테리아의 준비에 대해 설명합니다. 특정 E. 대장균은 OP50라고 C.elegans를 공급하는 데 사용되는 변형. 다른 박테리아와 웜 문화의 교차 오염을 방지하기 위해이 프로토콜을하기 전에, OP50 변형이 Carbenicillin / 암피실린 저항 21하였습니다. 사전에 OP50 4~5일를 준비합니다. OP50과 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 일 -7 : 목요일 (주 1) : 접종 37 박 이상의 단일 OP50 식민지와 부화 ° 세균 통에 C 100 μg / ML 암피실린 및 0.1 μg / ML Amphotericin B를 포함하는 TB 5 ML. 일 -6 : 금요일 (주 1). 아침 8시 반. 문화 충분한 시간이 포화에 도달하도록 초기 접종 <ol><li> 50 μg / ML 암피실린을 포함한 300 ML의 TB에서 OP50 1:2000의 야간 문화를 희석. 채도에 도달할 때까지 37 8~12시간에 대한 세균 쉐이크 ° C의 문화를 품다. 문화 14 시간 이상 성장을 허용하지 않습니다. </li><li> 멸균, 사전에 가중치 원심 분리 관에 OP50을 전송합니다. 펠렛 테이블 톱 원심 분리기에서 3,500 RPM (2,200 XG) 10 분 원심 분리하여 OP50. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 물 속에 다시 중지 OP50 펠렛하고 다시 원심 분리하여 펠렛. 두번 세척을 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척 후, 모든 남아있는 물을 조심스럽게 제거합니다. 물도은 튜브에 남아되지 않을 것입니다. 펠렛을 포함하고있는 원심 분리 튜브를 저울질하고 펠렛의 무게를 결정하기 위해 비어있는 원심 분리 관의 무게를 뺍니다. </li><li> 철저히 100 MG / ML의 농도 S - 완료의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 아무도 대단히 짧은 시간을 둘 수 없습니다. </li><li> 100 MG / ML OP50의 농도는 2 X10 10 세균 / ML에 해당한다. ML 당 박테리아의 광학 밀도와 숫자 사이의 관계가 알려져있다면 ML 당 박테리아의 수를 결정하는 사​​진 분광계를 사용하십시오. 필요한 경우, 2 X10 10 세균 / ML에 OP50 먹이 솔루션의 농도를 조정합니다. </li><li> 4 OP50solution를 저장 °가 웜 문화에 사용되는 C까지. </li></ol> 2. 동기 웜 문화의 준비 이 섹션은 웜 문화의 준비에 대해 설명합니다. 그 목표는 벌레의 시대 - 동기 인구를 생성하는 것입니다. 5 단계에서 표백제 치료 후 C.elegans와 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 플레이트는 별도로 표시 ° C 않는 20 보관됩니다. 일 -6 : 금요일 (주 1), 오후 4 오후 : 새로운 접시에 동물을 전송 <ol><li> 웜 인구의 대다수가 굶어 죽었을 L1의 애벌레로 구성되어있는 5-10일 오래된 NGM 판을 가져가라. </li><li> 곧 알콜 램프를 통해 그것을 가열하여 금속 주걱을 소독. 그것은 식지. 굶주린 벌레가 들어있는 접시에서 한천 덩어리를 잘라 냉각 주걱을 사용합니다. OP50와 신선한 10cm NGM 판에 씨앗이 덩어리 몇 가지를 전송합니다. 약 품어. 웜 인구의 대부분 gravid 성인 구성되어 ° C까지 20 65시간. 그것이 gravid 성인으로 성장하기 위해 굶어 L1 동물을위한 소요 시간은 변형의 변형에 따라 다를 수 있습니다. </li></ol> 주 -3 : 월요일 (주 2) 오전 10:00 : 동기 인구를 설정 <ol start="3"><li> 50-10 ML 멸균 물을 접시 그들을 세척하여 10cm 접시에서 벌레를 수집합니다. 15 ML 원뿔 관에 웜 / 물 솔루션을 전송합니다. </li><li> 1,200 RPM (280 XG)에서 탁상 원심 분리기 2 분 centrifuging하여 벌레를 씻으십시오. 뜨는을 취소하고 10 ML 물을 추가합니다. 반복합니다. </li><li> 뜨는 제거하고 신선한 표백 / NaOH 용액 (2.5 ML 가정용 표백제, 1 ML 10N NaOH, 6.5 ML H 2 O) 5 ML를 추가합니다. 벌레가 열려 휴식까지 RT에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 와동 모든 분하시기 바랍니다. 해부 현미경 반응의 진행 상황을 모니터링합니다. </li><li> 즉시 모든 어른 디졸브로 반응을 무력화 M9 버퍼의 5 ML를 추가합니다. </li><li> (2,500 RPM에서 2 분 centrifuging 10 ML M9 버퍼와 달걀 세 번 씻어1,100 XG). </li><li> 한번와 계란을 씻어 10 ML 2,500 RPM (1,100 XG) 2 분 centrifuging하여 S - 완료되었습니다. </li><li> 뜨는 제거를 추가, 10 ML S는 - 완전하고 신선한 50 ML 원뿔 관에 대한 해결책을 전송합니다. 40 ML의 최종 볼륨 S - 완성 30 ML을 추가합니다. 부드럽게 nutator 또는 이와 유사한 장치에 실온에서 하룻밤 튜브를 흔들. </li></ol> 일 -2 : 화요일 (주 2) 12:00 : 접시에 종자 동물 <ol start="10"><li> 해부 현미경, 벌레가 밤 동안 부화 여부를 확인하십시오. 해부 범위를 사용하여 10 μL 방울의 벌레의 수를 계산하여 S - 완벽한 솔루션에 벌레의 농도를 결정합니다. 각 샘플에 대해 적어도 10 방울을 계산합니다. </li><li> 80-100 웜 / S 완성에 ML의 농도에있는 벌레를 다시 일시 중지합니다. 0.1 μg / ML의 최종 농도 50 μg / ML과 Amphotericin B (재고 250 μg / ML)의 최종 농도 Carbenicillin을 (재고 100 MG / ML) 추가합니다. nutator 악수. 벌레의 큰 수량을 준비하면, 필터 캡과 함께 600 ML의 nunclon 플라스크를 사용합니다. </li><li> 오후 2시 반 6 MG / ML (= 1.2 X10 9 세균 / ML)의 최종 농도 1 부에서 준비한 OP50를 추가합니다. OP50 4 ° C.로 돌아가기 </li><li> 96 잘 접시의 각 우물에 worm/OP50 솔루션을 120 μL을 전송합니다. 투명한 바닥과 96 잘 접시를 사용합니다. pipetting 동안 정지에있는 벌레를 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 오염 및 증발을 방지하기 위해 테이프 실러를 사용하여 번호판을 밀봉합니다. 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 접시를 흔들 동물 L4 단계에 도달할 때까지 20 이일 ° C에 대해 숙고하다. </li></ol> 일 0 : 목요일 (주 2) 정오가 : Fluorodeoxyuridine을 추가하여 동물을 소독 (FUDR) <ol start="15"><li> 동물이 각각 잘 수있는 0.6 MM의 FUDR 주식 솔루션 30 μL를 추가 소독합니다. 이 단계는 150 μL 각 우물에 최종 볼륨을 제공 5 MG / ML (1x10 9 세균 / ML)에 6mg / ML에서 OP50의 최종 농도를 감소시킵니다. 테이프 실러스를 사용하여 번호판을 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. OP50이 일 -2에서 2시 30 분에 추가되었습니다면, 그것은 FUDR은 정오 전에 추가하는 것이 중요합니다. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li></ol> 1 일 : 금요일 (주 2) : 문화에 약물을 추가 <ol start="16"><li> 오전 9함으로써 동물의 대부분 gravid 여러 계란 각을 포함해야합니다. 누구의 영향 수명에 원하는 농도에서 테스트하는 약물을 추가합니다. DMSO에 마약을 분해하는 경우 DMSO의 최종 농도는 0.6 %가 C.elegans 수명을 단축보다 DMSO의 농도 높은 같은 0.6 %를 초과해서는 안됩니다. 약물 이외 후, 테이프 실러와 접시를 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 마약를 추가하면 때때로, 특히 물보다 용매의 다른을 사용하는 경우, 접시 당 몇몇 동물을 죽일 수 있습니다. 죽은 동물을 확인하는 거꾸로 현미경을 사용합니다. 일반적으로, 96 잘 접시 당 미만 10 죽은 동물이 있어야합니다. 20 ° C 배양기로 번호판을 반환합니다. </li></ol> 일 4 : 월요일 (주 3) : 변경 실러스 <ol start="18"><li> 실러를 제거 문화를 입력 신선한 산소를 허용하려면, 일분 후에 접시를 봉인. microtiter 접시 쉐이크에 2-3분에 대한 번호판을 흔들어. 매주 한 번 반복합니다. </li></ol> 제 5 일 : 화요일 (주 3) : 기아를 방지하기 위해 새로운 OP50 추가 <ol start="19"><li> 기아를 방지하기 위해 96 우물의 각 부분 1 준비했습니다 100 MG / ML OP50 솔루션의 5 μL를 추가합니다. </li></ol> 3. 수명의 점수. 이 섹션은 동물들이 죽을때까지 제 2의 동기 웜 인구의 생존을 감시하는 방법을 설명합니다. 96 잘 접시에있는 동물을 관찰하려면, 2X 또는 2.5x 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 기록 생존 데이터를 일주일에 세 번, 월요일, 수요일, 금요일. 동물이 살아 있거나 죽어있는지를 확인하기 위해 움직임을 사용합니다. 강한 빛, 특히 푸른 불빛이 이동하는 동물을 유도. 분석에서 죽은 동물을 제거하지 마십시오. 때로는 움직이지 않았고 앞의 수가 죽은 결정 동물은 나중에 이동 할 수도 있습니다. <ol><li> 일 0에, 실험의 시작 부분에 각 우물에 벌레의 총 수를 계산합니다. 이 우물의 동물로 분석에서 이상의 18 동물을 포함 우물을 검열 충분 OP50이되지 않으며식이 제한의 효과를 보여줍니다. </li><li> 동물 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 96 접시를 잘 흔들어 이동하는 기회를 증가하기 위하여. 전에 계산. </li><li> 각 계수 세션 기록 날짜 및 동물의 수가 어느살아있는 동물로 이동합니다. 액체의 운동은 단단한 미디어에보다 쉽게​​하고 강한 조명에 의해 유도된 수 있습니다. 높은 배율의 사용은 인두의 끝을 분들처럼 매우 미묘한 움직임을 탐지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미묘한 움직임은 종종 아주 오래된 동물 관찰 유일한 운동입니다. </li><li> 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 2-4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 대표 결과. 이 섹션에서는이 분석과 몇 가지 대표적인 결과에 의해 생성되는 수명 데이터의 기록을 유지하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 그림 1A는이 분석하는 동안 수명 데이터를 기록하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 엑셀 시트는 생존 각 우물에 인구를 추적하는 데 사용됩니다. 각 잘 들어 그것이 몇달이 좌표의, 스트레인, 마약, 약물의 농도와 일 0에 살아있는 동물의 총 개수는 (X0) 실험의 시작 부분에 기록됩니다. 기록 날짜뿐만 아니라 생활과 죽은 동물의 수를 세 번 각각 잘의 다양한 인구의 생존을 수행하기 위해 주. 그래프 결과를 위해, 매일 매일 살아있는 동물의 분율을 계산하고 일 시간의 함수로 플롯. P - 값은 스타타 또는 이와 유사한 소프트웨어와 같은 통계 패키지를 사용하여 계산해야합니다. C.elegans의 매체 수명은 온도에 따라 달라집니다. 그림 1B는 수명의 온도 종속 변경 사항이 정확하게 수명 분석 22 기반 microtiter에 의해 복제되는 보여줍니다. 마찬가지로, microtiter 플레이트 분석 야생 타입 N2 동물 23-24 25 (그림 1C)에서 다를 lifespans을보고 돌연변이에서 수명의 변화를 재현한. 분석은 또한 더 많은 양적 진술을하기 위해 사용할 수 있습니다. Fig1D의 의미에서 수명이 Mirtazepine 농도 7 기능으로 꾸몄다 있습니다. 각 데이터 포인트는 7-12 인구의 평균 수명, 잘 다른 각 생활을 나타냅니다. 잘마다 동물의 숫자 (5-15 동물) 비교적 낮은 경우에도 오차 막대에서 볼 수 있듯이 잘 - 투 - 잘 편차는 상대적으로 작다. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 수명 분석을 기반으로 microtiter 플레이트 정확하게 수명의 변화에 문헌에 보고된를 재현한. (A) 샘플 데이터는 Excel 스프레드 시트에서 수집했습니다. 각 계수 세션 날짜 동안 잘의 좌표와 살고 죽은 동물의 숫자를 기록했다. 실험의 시작 부분에서, 각 우물에 동물의 총 개수가 결정되었습니다. (B) 야생 유형의 생존 곡선 (N2) 동물 20 성장 ° C와 25 ° C. 수명에 영향을 변이를 들고 종자의 (C) 서바이벌 곡선. 네개의 변종은 20 ° C.에 병렬로 assayed되었습니다 Mirtazepine 취급 N2 동물 (D) 선량 반응 곡선. 평균 수명은 Mirtazepine 농도의 함수로 꾸몄다 있습니다. 오류 막대는 조건 1 일 8 웰스의 SEM을 나타냅니다. 5. 자료. M9 버퍼, 1000 ML <ul><li> 6g 나 2 HPO 4 </li><li> 3g KH 2 PO 4 </li><li> 5g NaCl </li><li> 0.25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> Potassiumphosphate 버퍼 산도 6.0 1000 ML <ul><li> 136g KH 2 PO 4 </li><li> 900 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> 추적 금속 솔루션 <ul><li> 1.86 g 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 0.69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0.29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥과 어둠 속에 저장합니다. </li></ul> S - 기초 중간, 1000 ML <ul><li> 5.9 g NaCl </li><li> 1M 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 50 ML </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥 </li><li> 5mg / ML 콜레스테롤 (잇 - OH에 용해) 1 ML을 추가합니다 다음 솔루션은 식지합니다. </li></ul> 칼륨 구연 산염의 1M 1000 ML <ul><li> 268.8 g의 tripotassium의 구연 산염 </li><li> 26.3 구연산 산성 일수화물 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> S - 완료 중간, 1000 ML <ul><li> 977 ML S - 기저 </li><li> 10 ML 1M 칼륨의 구연 산염의 산도 6 (살균) </li><li> 10 ML 트레이스 금속 용액 (살균) </li><li> 3 ML 1M CaCl 2 (살균) </li><li> 3 ML 1M MgSO 4 (살균) </li></ul> NGM의 한천 <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2.5G Pepton(카제인에서 췌장 소화) </li><li> 17g 아가르 </li><li> 탈이온수 975 ML과 감동 바 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 1M CaCl 2 (멸균)의 0.5 ML </li><li> 에탄올의 5mg / ML 콜레스테롤 1 ML </li><li> 1M MgSO 4 (멸균) 1 ML </li><li> 25 ML의 Potassiumphosphate 버퍼, 산도 6.0 (멸균) </li></ul></li></ul> TB 1000 ML <ul><li> 12g Bacto Tryptone </li><li> 24g의 효모 추출 </li><li> 4 ML의 글리세롤 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 100 ML을 추가 </li></ul></li></ul> 0.6 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR, 시그마 고양이 # F0503), 1000 ML <ul><li> 100 MG FUDR </li><li> S - 완전 무균 670 ML에 용해, 10 ML 45 ML aliquots합니다. </li><li> -20 ° C.에 저장 </li></ul> 100 MG / ML Carbenicillin, 10 ML <ul><li> 1g Carbenicillin </li><li> 10 ML 무균 탈이온수 </li><li> 무균 여과액 및 나누어지는 </li><li> -20 ° C.에 저장 </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul> 250ug / ML Amphotericin B, 4 ML <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 ML 잇 - OH </li><li> -20 ° C에서 보관 </li><li> 0.1 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제시 프로토콜 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명의 측정을하실 수 있습니다. 으로 대표 결과에 표시된 섹션은 안정적으로 이전 결과를 복제 및 양적 정보를 제공합니다. 이 분석을 사용 우리는 성공적으로 C.elegans 수명에 대한 그들의 영향에 대한 89,000 분자 이상 검사를했습니다. 약물 검사의 목적을 위해, 96 잘 microtiter 플레이트 형식의 수명을 측정하는 것은 전통적인 고체 미디어 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 그것은 미디어 준비, 보육 공간, 그리고 필요한 약물의 양을에 필요한 노동을 줄일 수 있습니다. 96 - 웰 형식과 현미경 설정은 높은 처리량 검사에 대한 전체 분석의 자동화를 허용합니다. 분석의 개발 기간 동안 각 변수와 조합에 대해 여러 개의 값이 그에 C.elegans 수명에 미치는 영향에 대해 테스트되었습니다. 이 테스트는 3에서 10에 이르기까지 다양한 OP50 농도를 포함 MG / ML (3, 4, 6, 8, 10 MG / ML), 7에서 45 (7, 10, 15, 22, 45에 이르기까지 잘 따라 웜의 다른 번호 웜 / 음), 40에서 150 잘마다 μL (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), 그리고 버퍼 구성의 변화에​​ 이르기까지 다양한 문화 볼륨. 먹은 경우 Carbenicillin 방지 OP50와 농도에 Carbenicillin이나 Amphotericin B도가 표시가 C.elegans 수명에 영향을 찾았습니다. 접시의 지속적인 완만한 떨고, 자주 C.elegans 액체 문화에 추천합니다,이 분석에 사용되는 작은 볼륨 소모품 발견되었습니다. 큰 우물과 microtiter 접시가 사용할 수있다면 부드러운 흔들림는하지만 필요합니다. 값은이 프로토콜에 신중하게 테스트를 다양한 조건의 통계 비교에 따라 선택되어 지적했다. 이 분석의 가장 놀라운 특징은 아마 C.elegans은 테이프로 봉인된 96 잘 접시에 보관 수있다는 사실이다. 나란히 비교는 비닐 실러와 함께 밀폐 접시, 또는 공기의 교환을 허용 실러스와 밀폐 접시에 unsealed 접시에 교양 동물의 수명에 차이를 공개하지 않았다. 세 조건에서 동물 L1에서 65시간 이내 gravid 어른 매우 homogenously 개발하고 매우 유사한 lifespans을 보여주었다. NGM에 병렬로 성장 동물이 약간 더 빠른 개발,하지만이 차이는 실러의 부재 또는 존재 독립했다. 제시 프로토콜은 라이브 세균을 기반으로하지만, 죽은 박테리아에 대한 적응하실 수 있습니다. 그러나, 액체 분석에서 하나의 생존 박테리아는 빠르게 증식하고 문화를 다시 채웁니다. 우리 손에, 그들은 액체 문화 사용할 수있는 범위 내에서 세균을 죽일 수있는 유일한 안정적인 방법은 감마 방사선으로 박테리아의 연장 치료를하는 것입니다. 수명 실험의 계획에 고려해야 할 한 가지 중요한 포인트는 감지의 능력이 있습니다. 효과의 크기에 따라, 관심있는 약물의 영향은 여러 우물에서 테스트해야합니다. 전형적인 분석 4 약물 치료 4 제어 우물, 해당 대략하기 40-50 각 동물에서 실험 이상의 95%의 수명에서 3​​0 % 증가를 감지하기 위해 충분해야합니다. 14 % 증가는 사건의 60 %에 감지하고 따라서 더 많은 복제 우물을 필요로하고 있습니다. 이 분석에 의해 생성된 수명 데이터의 풍부한는 실험을 개발하거나 특정 parametrical Gompertz 모델 1 변형하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 Gompertz 모델은 검색의 힘을 확인하고 대규모 스크린에 대한 잘못된 반응과 네거티브 필름의 수를 추정하는 데 유용합니다. 우리는 장님이 실험에서 이러한 모델의 예측을 검증하고 대형 스크린에서 거짓 네거티브 필름의 숫자 (게시되지 않은 결과를) 측정에 사용. 요약, 우리는 제시 분석은 C.elegans의 수명을 연장하고 기본 메커니즘을 연구하는 작은 분자를 식별하는 큰 도움이 될 것으로 예상.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Fungizone라고도 함</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR는 열에 의해 불활성화되므로 찬물에서 해동할 것</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>최종 농도 50&amp;#x03BC;M에서 양성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>최종 농도 10 &amp;#x03BC;M에서 대체 양성 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>Sealing Tape</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>폴리에스터, 비멸균</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>비처리, 투명, 멸균 개별 포장, 폴리스티렌</td></tr><tr><td>Nunclon flask</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>대용량용으로 사용</td></tr></tbody></table>

측정 caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 microtiter> 수명

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

수명은 몇 가지 유전자 경로에 의해 규제 생물 학적 과정이다. 노화의 생물을 조사하는 한 가지 전략은 동물을 연구하는 것입니다 나이 규제 경로의 구성 요소에 항구 변이. 이러한 변이를 교란 연령 규제 통로의 기능을하기 때문에 전체 유기체의 수명을 변경하는 경우, 그들은 중요한 기계론의 통찰력은 1-3 제공합니다. 수명의 규정을 조사하기 위해 또 다른 전략은 교란 연령 규제 경로에 작은 분자를 사용하는 것입니다. 지금까지 분자의 숫자는 다양한 모델 생물의 수명을 연장하는 것으로 알려져 있으며, 노화 4-16의 생물학을 연구하는 도구로 사용됩니다. 식별 분자의 수는 지금까지 노화의 생물학을 연구에 사용할 수있는 유전자 &quot;도구 모음&quot;에 비해 작습니다. Caenorhabditis 엘레간스 때문에 우수한 유전 3 주동안 짧은 수명의 노화 연구에 사용되는 주요 모델 중 하나입니다. 최근 C.elegans 때문에 작은 크기와 microtiter 플레이트 성장하는 기능 표현형 기반 약물 화면 5,7,16-20를위한 모델 생물로 등장했다. 여기 우리는 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명을 측정하는 분석을 제시한다. 분석은 개발하고 성공적으로 C.elegans 수명 7 연장 분자 대형 라이브러리를 화면으로 사용되었습니다. 분석의 신뢰성은 여러 시험에서 평가되었다 : 첫째, 서로 다른 온도에서 성장 야생 유형 동물의 수명을 측정하여, 두 번째 변경 lifespans과 돌연변이의 수명을 측정하여, 셋째, 서로 다른 농도에 대한 응답으로 수명의 변화를 측정하여 약은 Mirtazepine니다. Mirtazepine 이전 C.elegans 7 수명을 연장하기 위해 표시되었습니다. 이 테스트의 결과는 분석이 다른 assays에서 이전 결과를 복제 할 수 있으며, 양적는 것을 보여줍니다. microtiter 형식은 자동 액체 처리 시스템이 수명 분석 호환 차종과 자동 플랫폼에 통합이 가능합니다.

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을 제시<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em96 잘 microtiter 접시에&gt; 수명.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

수명은 여러 유전적 경로에 의해 조절되는 생물학적 과정입니다. 노화의 생물학적 기전을 연구하기 위한 한 가지 전략은 ...을 보유한 동물을 연구하는 것입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목적은 관심 약물을 처리한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선충의 먹이로 사용되는 박테리아 균주인 OP 50를 준비합니다. 그 다음, 연령이 동기화된 선충 집단을 생성하여 먹이 박테리아인 OP 50와 함께 96-웰 플레이트에 분주합니다.다음 이틀 동안 벌레는 L4 유충 단계까지 성장하며, 번식을 방지하기 위해 FUDR 약물을 첨가합니다. 다음 날 벌레가 성체에 도달하면 각각의 웰에 연구 대상 약물을 첨가합니다. 이 시점부터 모든 벌레가 죽을 때까지 2~3일마다 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수를 측정합니다.도립 현미경을 사용하여 관찰을 수행하며, 각 세션마다 죽은 벌레와 살아있는 벌레의 수를 기록합니다. 안녕하세요, 저는 Scripps Research Institute 화학 생리학과의 Petro Lab에 소속된 Greg Solis입니다.오늘은 벌레(worm)를 동기화하고 이를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 분주하는 방법을 보여드리겠습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 C. elegans의 수명을 연장하는 분자를 빠르게 식별할 수 있다는 점입니다. 그럼 시작하겠습니다.C. elegans의 먹이용 박테리아를 준비하려면, -7일째에 100 µg/mL의 carbenicillin과 0.1 µg/mL의 gentamicin B가 함유된 TB 5 mL에 단일 OP50 콜로니를 접종하는 것으로 시작합니다. 박테리아 쉐이커를 사용하여 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 이른 아침, 하룻밤 배양한 OP50 배양액을 50 µg/mL의 ampicillin이 함유된 TB 300 mL에 희석합니다. 포화 상태에 도달할 때까지 박테리아 쉐이커에서 37 °C로 8~12시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 14시간을 초과하지 않도록 주의하십시오.OP 50를 미리 무게를 측정한 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 탁상형 원심분리기를 사용하여 3,500 RPM 또는 2,200 ×g에서 10분간 원심분리하여 OP 50 펠릿을 형성합니다. 상층액을 제거한 후, OP 50 펠릿을 증류수로 재현탁하고 다시 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.조심스럽게 세척하고 남아 있는 모든 물을 완전히 제거합니다. 펠릿이 들어 있는 원심분리 튜브의 무게를 측정하고, 여기서 빈 원심분리 튜브의 무게를 빼서 펠릿의 무게를 결정합니다. 다음으로, 펠릿을 S Complete에 100 mg/mL 농도가 되도록 완전히 재부유시킵니다.덩어리가 남지 않아야 합니다. 100 mg/mL 농도의 OP 50은 2 × 10¹⁰ bacteria/mL에 해당해야 합니다. 광학 밀도와 mL당 박테리아 수 사이의 관계를 알고 있는 경우, 분광광도계를 사용하여 mL당 박테리아 수를 결정하십시오.필요한 경우, OP 50 먹이 용액의 농도를 ml당 2×10¹⁰ 마리 수준으로 조정하십시오. 마지막으로, 연령 동기화된 벌레 집단을 생성하기 위한 벌레 배양에 사용할 때까지 OP 50 용액을 4°C에서 보관하십시오. 벌레 집단이 주로 굶주린 L1 유충으로 구성된 5~10일 된 NGM 플레이트를 사용하여 -6일째 늦은 오후부터 시작하십시오.금속 스패튤라를 분젠 버너 위에서 짧게 가열하여 멸균합니다. 이를 식힌 후, 식은 스패튤라를 사용하여 굶주린 벌레가 포함된 플레이트에서 한천 조각을 잘라냅니다.이 조각들 중 몇 개를 OP 50이 도말된 새로운 10 centimeter NGM 플레이트로 옮깁니다. 벌레 인구의 대부분이 grave adult가 될 때까지 약 20 degrees Celsius에서 약 65시간 동안 배양합니다. 굶주린 L1 개체가 grave adult로 성장하는 데 걸리는 시간은 균주마다 다를 수 있습니다.배양 후, 5~10 mL의 멸균수를 사용하여 10 cm 플레이트에서 벌레를 씻어내어 수집합니다. 벌레가 포함된 수용액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 탁상용 원심분리기를 사용하여 1,200 RPM 또는 280 ×g에서 2분간 원심분리하여 벌레를 세척합니다. 상층액을 제거하고 10 mL의 물을 추가합니다.세척 단계를 반복하고, SUP 상층액을 제거한 뒤 갓 제조한 bleach(차아염소산나트륨) 용액 5 mL를 첨가합니다. 수산화나트륨 용액 상태에서 벌레의 몸체가 파열될 때까지 RT에서 5분 동안 배양합니다. 매분 부드럽게 vortexing하는 것을 잊지 마십시오.모든 성체가 용해되는 즉시 해부 현미경으로 반응 진행 상황을 관찰하십시오. 반응을 중화시키기 위해 M nine buffer 5 mL를 첨가합니다. 2,500 RPM 또는 1,100 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 M nine buffer 10 mL로 알을 3회 세척하십시오. 그런 다음 2,500 RPM 또는 1,100 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 S complete 10 mL로 알을 1회 세척하십시오. 상층액을 제거하십시오.S complete 10 milliliters를 넣고 용액을 새로운 50 milliliters 원추형 튜브로 옮깁니다. S complete 30 milliliters를 추가하여 최종 부피를 40 milliliters로 맞춥니다. 다음 날 정오쯤 동물 플레이트에 접종할 수 있도록, 튜브를 mutator 또는 유사한 장치에 넣고 실온에서 밤새 부드럽게 흔들어 줍니다.해부 현미경을 사용하여 밤 사이 벌레가 부화했는지 확인하십시오. 10 µL 방울 내의 벌레 수를 세어 S 완전 용액 내 벌레의 농도를 결정하십시오. 해부 현미경을 사용하여 각 샘플당 최소 10방울을 측정하십시오.Resus.밀리리터당 80~100마리의 농도로 벌레를 현탁합니다. S 완전 배지에 carbenicillin을 최종 농도 50 µg/mL, amphotericin B를 최종 농도 0.1 µg/mL가 되도록 첨가합니다. mutator에서 흔들어 섞어줍니다.더 많은 양의 벌레를 준비하는 경우, 필터 캡이 있는 600 milliliter 논클론 플라스크를 사용하십시오. 오후 2:30에 1부에서 준비한 OP 50을 최종 농도가 6 mg/mL가 되도록 추가하십시오. OP 50을 4 °C로 되돌립니다. 벌레 OP 50 용액 120 µL를 투명 바닥의 96웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오.피펫팅 하는 동안 벌레와 현탁액을 계속 섞어주고, 오염과 증발을 방지하기 위해 테이프 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로타이터 플레이트 쉐이커에서 플레이트를 2분 동안 흔들어준 후, 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 20 °C에서 이틀 동안 배양하십시오. 다음으로 동물을 멸균하기 위해 각 웰에 0.6 mM FUDR 스톡 용액 30 µL를 추가하십시오.이 단계에서 각 웰의 최종 부피는 150 µL가 되며, OP 50의 최종 농도는 6 mg/mL에서 5 mg/mL로 감소합니다. 테이프 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 마이크로티트 플레이트 쉐이커에서 2~3분 동안 흔들어 줍니다. OP 50을 2일 전 오후 2시 30분에 첨가했다면, 정오 이전에 FUDR을 첨가하는 것이 중요합니다. 다음 날 오전 9시까지 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오.대부분의 동물은 성체여야 하며 여러 개의 알을 포함하고 있어야 합니다. 수명에 미치는 영향을 테스트하려는 각 약물을 원하는 농도로 첨가합니다. DMSO에 약물을 용해하는 경우, DMSO의 최종 농도는 0.6%를 초과해서는 안 됩니다. 0.6%보다 높은 DMSO 농도는 약물 첨가 후 C. elegans의 수명을 단축시키기 때문입니다.테이프 실러로 플레이트를 밀봉하고 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 2~3분 동안 흔들어 줍니다. 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 약물을 추가하면 특히 물 이외의 용매를 사용하는 경우 플레이트당 소수의 개체가 폐사할 수 있습니다.도립 현미경을 사용하여 죽은 개체가 있는지 확인합니다. 일반적으로 96-well 플레이트당 죽은 개체 수가 10마리 미만이어야 합니다. 배양액에 신선한 산소가 공급될 수 있도록 플레이트를 20 °C 인큐베이터에 넣고 이틀 동안 보관합니다. 실러를 제거합니다.1분간 기다린 후 플레이트를 다시 밀봉합니다. 마이크로타이터 플레이트 셰이커(microtighter plate shaker)에서 2~3분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 성체 수명 기간 중 5일차마다 일주일에 한 번씩 이 과정을 반복하며, 기아 상태를 방지하기 위해 이전에 준비한 100 mg/mL OP 50 용액 5 µL를 96개 웰 각각에 첨가합니다. 벌레의 수명은 실험 시작부터 사망할 때까지 일주일에 세 번 움직임 여부를 통해 측정합니다.실험 시작일인 0일 차에 2배 또는 2.5배 대물렌즈가 장착된 도립현미경을 사용하여 96웰 플레이트 내의 벌레를 관찰하십시오. 각 웰에 있는 벌레의 총 마릿수를 측정하십시오.분석 결과 18마리 이상의 동물이 포함된 센서 웰은 해당 웰의 동물들에게 OP 50이 충분히 공급되지 않아 각 계수 세션에서 식이 제한 효과가 나타날 수 있으므로 제외하십시오. 살아있는 동물로 이동하는 동물의 날짜와 수를 기록하십시오. 액체에서의 이동은 고체 배지보다 훨씬 쉬우며 강한 빛에 의해 유도될 수 있습니다.더 높은 배율을 사용하면 인두 끝부분에서 나타나는 것과 같이 매우 미세한 움직임을 포착하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미세한 움직임은 매우 고령인 동물에서 관찰되는 유일한 움직임인 경우가 많습니다. 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다.모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 계수 세션을 반복합니다. 이것은 각 웰의 수명 데이터를 기록하기 위한 Excel 시트 설계입니다. 플레이트 내 좌표, 균주, 약물 농도, 그리고 실험 시작 시점인 0일 차의 총 생존 동물 수가 기록됩니다.각 웰 내 다양한 개체군의 생존 상태를 추적하기 위해 일주일에 세 번 생존 동물 및 사망 동물의 수를 날짜와 함께 기록하십시오. 이 그림은 20 °C와 25 °C에서 기록된 sea elegance의 수명 곡선 결과를 보여줍니다. 마이크로타이터 기반 수명 분석법은 온도에 따른 수명 변화를 정확하게 재현합니다.이와 유사하게, 여기에서 보여주는 것처럼, 마이크로타이터 플레이트 분석법은 야생형 N2 동물과 수명이 다른 것으로 보고된 변이체들의 수명 변화를 재현합니다. 이 그림은 mirtazapine의 용량을 증가시킴에 따라 C. elegans의 평균 수명이 어떻게 영향을 받는지 보여줍니다. 마이크로타이터 플레이트 분석법으로 얻은 데이터는 용량 반응 관계를 결정할 수 있을 만큼 충분히 정량적입니다. 이 기술을 숙달하면, C. elegans의 수명을 연장하는 분자를 찾기 위해 대규모 화학 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 전통적인 플레이트 기반 방법을 설명합니다. 예시 프로토콜은 RNAi로 처리된 기생충의 수명을 측정합니다.

수명 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans) 수명 측정

C. elegans는 산화 스트레스 저항성과 관련된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 매력적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 96개의 웰 플레이트에서 여러 산화제를 사용하여 액상에서 C. elegans 동물의 산화 스트레스 저항성을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

모델 동물, 꼬마 선 충, 화학 물질의 독성을 평가 하는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 방법은 편리 하 고 다양 한 환경 오염 물질의 위험 평가 관해서는 뿐만 아니라 의약품의 개발에 유용 합니다.

성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

학습하세요 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Caenorhabditis elegans의 수명을 측정하는 고효율 프로토콜을 통해 노화 메커니즘과 수명 연장 물질을 신속하게 선별하는 방법을 배우세요.

측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

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