측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

이 실험 절차의 전반적인 목적은 관심 약물을 처리한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선충의 먹이로 사용되는 박테리아 균주인 OP 50를 준비합니다. 그 다음, 연령이 동기화된 선충 집단을 생성하여 먹이 박테리아인 OP 50와 함께 96-웰 플레이트에 분주합니다.

다음 이틀 동안 벌레는 L4 유충 단계까지 성장하며, 번식을 방지하기 위해 FUDR 약물을 첨가합니다. 다음 날 벌레가 성체에 도달하면 각각의 웰에 연구 대상 약물을 첨가합니다. 이 시점부터 모든 벌레가 죽을 때까지 2~3일마다 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수를 측정합니다.

도립 현미경을 사용하여 관찰을 수행하며, 각 세션마다 죽은 벌레와 살아있는 벌레의 수를 기록합니다. 안녕하세요, 저는 Scripps Research Institute 화학 생리학과의 Petro Lab에 소속된 Greg Solis입니다.

오늘은 벌레(worm)를 동기화하고 이를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 분주하는 방법을 보여드리겠습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 C. elegans의 수명을 연장하는 분자를 빠르게 식별할 수 있다는 점입니다. 그럼 시작하겠습니다.

C. elegans의 먹이용 박테리아를 준비하려면, -7일째에 100 µg/mL의 carbenicillin과 0.1 µg/mL의 gentamicin B가 함유된 TB 5 mL에 단일 OP50 콜로니를 접종하는 것으로 시작합니다. 박테리아 쉐이커를 사용하여 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 이른 아침, 하룻밤 배양한 OP50 배양액을 50 µg/mL의 ampicillin이 함유된 TB 300 mL에 희석합니다. 포화 상태에 도달할 때까지 박테리아 쉐이커에서 37 °C로 8~12시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 14시간을 초과하지 않도록 주의하십시오.

OP 50를 미리 무게를 측정한 멸균 원심분리 튜브로 옮깁니다. 탁상형 원심분리기를 사용하여 3,500 RPM 또는 2,200 ×g에서 10분간 원심분리하여 OP 50 펠릿을 형성합니다. 상층액을 제거한 후, OP 50 펠릿을 증류수로 재현탁하고 다시 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.

조심스럽게 세척하고 남아 있는 모든 물을 완전히 제거합니다. 펠릿이 들어 있는 원심분리 튜브의 무게를 측정하고, 여기서 빈 원심분리 튜브의 무게를 빼서 펠릿의 무게를 결정합니다. 다음으로, 펠릿을 S Complete에 100 mg/mL 농도가 되도록 완전히 재부유시킵니다.

덩어리가 남지 않아야 합니다. 100 mg/mL 농도의 OP 50은 2 × 10¹⁰ bacteria/mL에 해당해야 합니다. 광학 밀도와 mL당 박테리아 수 사이의 관계를 알고 있는 경우, 분광광도계를 사용하여 mL당 박테리아 수를 결정하십시오.

필요한 경우, OP 50 먹이 용액의 농도를 ml당 2×10¹⁰ 마리 수준으로 조정하십시오. 마지막으로, 연령 동기화된 벌레 집단을 생성하기 위한 벌레 배양에 사용할 때까지 OP 50 용액을 4°C에서 보관하십시오. 벌레 집단이 주로 굶주린 L1 유충으로 구성된 5~10일 된 NGM 플레이트를 사용하여 -6일째 늦은 오후부터 시작하십시오.

금속 스패튤라를 분젠 버너 위에서 짧게 가열하여 멸균합니다. 이를 식힌 후, 식은 스패튤라를 사용하여 굶주린 벌레가 포함된 플레이트에서 한천 조각을 잘라냅니다.

이 조각들 중 몇 개를 OP 50이 도말된 새로운 10 centimeter NGM 플레이트로 옮깁니다. 벌레 인구의 대부분이 grave adult가 될 때까지 약 20 degrees Celsius에서 약 65시간 동안 배양합니다. 굶주린 L1 개체가 grave adult로 성장하는 데 걸리는 시간은 균주마다 다를 수 있습니다.

배양 후, 5~10 mL의 멸균수를 사용하여 10 cm 플레이트에서 벌레를 씻어내어 수집합니다. 벌레가 포함된 수용액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 탁상용 원심분리기를 사용하여 1,200 RPM 또는 280 ×g에서 2분간 원심분리하여 벌레를 세척합니다. 상층액을 제거하고 10 mL의 물을 추가합니다.

세척 단계를 반복하고, SUP 상층액을 제거한 뒤 갓 제조한 bleach(차아염소산나트륨) 용액 5 mL를 첨가합니다. 수산화나트륨 용액 상태에서 벌레의 몸체가 파열될 때까지 RT에서 5분 동안 배양합니다. 매분 부드럽게 vortexing하는 것을 잊지 마십시오.

모든 성체가 용해되는 즉시 해부 현미경으로 반응 진행 상황을 관찰하십시오. 반응을 중화시키기 위해 M nine buffer 5 mL를 첨가합니다. 2,500 RPM 또는 1,100 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 M nine buffer 10 mL로 알을 3회 세척하십시오. 그런 다음 2,500 RPM 또는 1,100 ×g에서 2분 동안 원심분리하여 S complete 10 mL로 알을 1회 세척하십시오. 상층액을 제거하십시오.

S complete 10 milliliters를 넣고 용액을 새로운 50 milliliters 원추형 튜브로 옮깁니다. S complete 30 milliliters를 추가하여 최종 부피를 40 milliliters로 맞춥니다. 다음 날 정오쯤 동물 플레이트에 접종할 수 있도록, 튜브를 mutator 또는 유사한 장치에 넣고 실온에서 밤새 부드럽게 흔들어 줍니다.

해부 현미경을 사용하여 밤 사이 벌레가 부화했는지 확인하십시오. 10 µL 방울 내의 벌레 수를 세어 S 완전 용액 내 벌레의 농도를 결정하십시오. 해부 현미경을 사용하여 각 샘플당 최소 10방울을 측정하십시오.Resus.

밀리리터당 80~100마리의 농도로 벌레를 현탁합니다. S 완전 배지에 carbenicillin을 최종 농도 50 µg/mL, amphotericin B를 최종 농도 0.1 µg/mL가 되도록 첨가합니다. mutator에서 흔들어 섞어줍니다.

더 많은 양의 벌레를 준비하는 경우, 필터 캡이 있는 600 milliliter 논클론 플라스크를 사용하십시오. 오후 2:30에 1부에서 준비한 OP 50을 최종 농도가 6 mg/mL가 되도록 추가하십시오. OP 50을 4 °C로 되돌립니다. 벌레 OP 50 용액 120 µL를 투명 바닥의 96웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오.

피펫팅 하는 동안 벌레와 현탁액을 계속 섞어주고, 오염과 증발을 방지하기 위해 테이프 실러로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로타이터 플레이트 쉐이커에서 플레이트를 2분 동안 흔들어준 후, 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 20 °C에서 이틀 동안 배양하십시오. 다음으로 동물을 멸균하기 위해 각 웰에 0.6 mM FUDR 스톡 용액 30 µL를 추가하십시오.

이 단계에서 각 웰의 최종 부피는 150 µL가 되며, OP 50의 최종 농도는 6 mg/mL에서 5 mg/mL로 감소합니다. 테이프 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉하고 마이크로티트 플레이트 쉐이커에서 2~3분 동안 흔들어 줍니다. OP 50을 2일 전 오후 2시 30분에 첨가했다면, 정오 이전에 FUDR을 첨가하는 것이 중요합니다. 다음 날 오전 9시까지 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오.

대부분의 동물은 성체여야 하며 여러 개의 알을 포함하고 있어야 합니다. 수명에 미치는 영향을 테스트하려는 각 약물을 원하는 농도로 첨가합니다. DMSO에 약물을 용해하는 경우, DMSO의 최종 농도는 0.6%를 초과해서는 안 됩니다. 0.6%보다 높은 DMSO 농도는 약물 첨가 후 C. elegans의 수명을 단축시키기 때문입니다.

테이프 실러로 플레이트를 밀봉하고 마이크로타이터 플레이트 셰이커에서 2~3분 동안 흔들어 줍니다. 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 약물을 추가하면 특히 물 이외의 용매를 사용하는 경우 플레이트당 소수의 개체가 폐사할 수 있습니다.

도립 현미경을 사용하여 죽은 개체가 있는지 확인합니다. 일반적으로 96-well 플레이트당 죽은 개체 수가 10마리 미만이어야 합니다. 배양액에 신선한 산소가 공급될 수 있도록 플레이트를 20 °C 인큐베이터에 넣고 이틀 동안 보관합니다. 실러를 제거합니다.

1분간 기다린 후 플레이트를 다시 밀봉합니다. 마이크로타이터 플레이트 셰이커(microtighter plate shaker)에서 2~3분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 성체 수명 기간 중 5일차마다 일주일에 한 번씩 이 과정을 반복하며, 기아 상태를 방지하기 위해 이전에 준비한 100 mg/mL OP 50 용액 5 µL를 96개 웰 각각에 첨가합니다. 벌레의 수명은 실험 시작부터 사망할 때까지 일주일에 세 번 움직임 여부를 통해 측정합니다.

실험 시작일인 0일 차에 2배 또는 2.5배 대물렌즈가 장착된 도립현미경을 사용하여 96웰 플레이트 내의 벌레를 관찰하십시오. 각 웰에 있는 벌레의 총 마릿수를 측정하십시오.

분석 결과 18마리 이상의 동물이 포함된 센서 웰은 해당 웰의 동물들에게 OP 50이 충분히 공급되지 않아 각 계수 세션에서 식이 제한 효과가 나타날 수 있으므로 제외하십시오. 살아있는 동물로 이동하는 동물의 날짜와 수를 기록하십시오. 액체에서의 이동은 고체 배지보다 훨씬 쉬우며 강한 빛에 의해 유도될 수 있습니다.

더 높은 배율을 사용하면 인두 끝부분에서 나타나는 것과 같이 매우 미세한 움직임을 포착하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미세한 움직임은 매우 고령인 동물에서 관찰되는 유일한 움직임인 경우가 많습니다. 플레이트를 20 °C 인큐베이터로 다시 옮깁니다.

모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 계수 세션을 반복합니다. 이것은 각 웰의 수명 데이터를 기록하기 위한 Excel 시트 설계입니다. 플레이트 내 좌표, 균주, 약물 농도, 그리고 실험 시작 시점인 0일 차의 총 생존 동물 수가 기록됩니다.

각 웰 내 다양한 개체군의 생존 상태를 추적하기 위해 일주일에 세 번 생존 동물 및 사망 동물의 수를 날짜와 함께 기록하십시오. 이 그림은 20 °C와 25 °C에서 기록된 sea elegance의 수명 곡선 결과를 보여줍니다. 마이크로타이터 기반 수명 분석법은 온도에 따른 수명 변화를 정확하게 재현합니다.

이와 유사하게, 여기에서 보여주는 것처럼, 마이크로타이터 플레이트 분석법은 야생형 N2 동물과 수명이 다른 것으로 보고된 변이체들의 수명 변화를 재현합니다. 이 그림은 mirtazapine의 용량을 증가시킴에 따라 C. elegans의 평균 수명이 어떻게 영향을 받는지 보여줍니다. 마이크로타이터 플레이트 분석법으로 얻은 데이터는 용량 반응 관계를 결정할 수 있을 만큼 충분히 정량적입니다. 이 기술을 숙달하면, C. elegans의 수명을 연장하는 분자를 찾기 위해 대규모 화학 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.