칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

안녕하세요, 제 이름은 Greg McLeod입니다. 저희 연구실에서는 신경 말단의 칼슘 조절과 그것이 신경 전달에 미치는 영향을 연구하고 있습니다. 저희는 이 연구를 *Oph Melanogaster*를 통해 수행합니다.

초파리는 유전적 조작이 용이하고 신경계가 단순하며 접근성이 좋아 신경과학자들에게 매력적인 모델입니다. 이 신경계에서는 유전적으로 인코딩된 형광 지표를 통해 신경 말단의 칼슘 변화를 검출할 수 있습니다. 하지만 이러한 지표들은 칼슘에 대한 민감도가 제한적이며, 종종 비선형적인 반응을 보입니다.

합성 지시약은 신경 활동과 관련된 급격한 칼슘 변화를 측정하는 데 더 적합합니다. 여기서는 합성 칼슘 지시약을 덱스트린과 결합하여 oph lava의 살아있는 신경 말단에 주입하는 기술을 시연하겠습니다. 덱스트린 결합은 칼슘 지시약이 미토콘드리아와 같은 세포 소기관에 격리되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.

로딩 기법은 유충, 배아 및 성체에 동일하게 적용할 수 있습니다. 유리 슬라이드 위의 작은 시가 배스(cigar bath)에서 유충을 해부하겠습니다. 청색 치과용 왁스는 유리 로딩 베드를 지지하는 역할을 합니다.

혼잡하지 않은 바이알의 측면에서 star lava의 3분 1 정도를 조심스럽게 꺼냅니다. 유충을 차갑게 식힌 Schneider 용액 몇 방울 위에 놓고, 등 중앙선을 위로 하여 머리와 꼬리 부분을 핀으로 고정합니다. 날카로운 마이크로 가위를 사용하여 절개합니다.

여기 트라키아(tra) 사이에 가위의 아래쪽 날이 들어갈 수 있을 정도의 작은 절개창을 냅니다. 트라키아 사이의 등쪽 정중선을 따라 큐티클을 머리 끝까지 절개합니다. 유충을 180도 돌려 절개창을 꼬리 끝까지 연장합니다.

하단 칼날이 내장 기관에 너무 깊게 침투하지 않도록 주의하고 유충만을 절개하는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 조사하려는 근육과 신경이 손상될 수 있기 때문입니다. 대부분의 내장 기관이 절개창을 통해 밀려 올라오면, 꼬리 근처의 경로를 한 번 자르고, 아래에 있는 기관을 머리 끝까지 따라가며 모두 잘라냅니다. 반대편에서도 동일하게 반복합니다.

내장의 대부분을 절단하여 배스에서 제거합니다. 잠시 가위를 내려놓고 두 번째 포셉을 집어 듭니다. 큐티클의 절단된 가장자리를 잡아 한쪽으로 고정합니다.

반대편에서도 동일하게 반복합니다. 머리 쪽으로 4개 마디를 더 이동하여 절차를 반복합니다. 이 단계에서 남아 있는 내장 기관을 제거합니다. 모든 마디에서 근육 7, 6, 13 또는 12에 손상이 없는지 확인하십시오.

손상된 부분이 있다면 다른 유충을 해부하십시오. 이러한 손상은 필연적으로 유전적 수축을 유발하여 이후의 모든 이미징 과정을 어렵게 만들기 때문입니다. 다음 단계에서는 뇌 반구, 복측 신경절 및 분절 신경이 명확하게 나타납니다. 압력 절단된 분절 신경 끝부분을 유리 FOP 베드로 끌어당긴 후, 플라스틱 충전 필라멘트를 사용하여 노출된 신경 끝단에 칼슘 지시약을 도포합니다.

먼저, 충전 필라멘트를 제작하기 위한 충전 필라멘트 제작법 및 충전 효과를 시연하겠습니다. 노란색 결함 부위에 2단계 연신 기술을 적용하며, 플라스틱이 부드러워지고 투명해질 때까지 길이의 절반 지점을 서서히 가열합니다. 이 지점에서 가열을 중단하고 즉시 끝부분을 위로 당겨 가느다란 가닥으로 뽑아냅니다.

지름은 약 0.5 mm입니다. 필라멘트를 50 mm 길이로 자릅니다. 이제 필라멘트를 해부 현미경 아래에 놓고 절단 부위를 고정합니다.

손톱으로 끝부분을 잡고 다른 쪽 끝을 당겨 1cm 길이의 가는 필라멘트를 뽑아냅니다. 필라멘트가 뭉쳐지지 않도록 티슈 페이퍼 위에서 새 면도날로 절단하여 충전 준비를 마칩니다. 필라멘트가 없는 얇은 벽의 모세관으로 시작하십시오.

펫 풀러(pet puller)를 사용하여 끝이 가늘고 뾰족하게 만들어줍니다. 이렇게 준비된 팁을 해부 현미경으로 옮겨 테이퍼진 부분에 사포로 흠집을 냅니다. 흠집이 난 쪽의 반대 방향으로 팁의 원위부를 밀어 팁이 수직으로 깔끔하게 부러지도록 합니다.

파열 부위의 내경은 외경보다 커야 합니다. 충전 필라멘트의 끝부분에서 마이크로 포지를 사용하여 파열된 부분이 유리 내부로 열수축되어 내경이 약 12 microns가 될 때까지 가열하십시오. 벙크스 버너(Bumps and burner)를 사용하여 전극의 뭉툭한 끝부분을 연마하십시오.

딱 맞게 끼워진 셀틱 튜브(Celtic tube)를 뻣뻣한 폴리라인 튜브 및 주사기와 연결하여 효과기의 뭉툭한 끝부분에 음압을 가할 수 있습니다. 동일한 튜브와 주사기를 사용하여 필라멘트에서 칼슘 지시약을 흡입하고 배출합니다. 칼슘 지시약은 증류수에 녹여 5mM 농도로 조제해야 합니다.

이 용액을 5 µL씩 분주합니다. 이를 4 °C에서 보관하십시오. 필요할 때까지 얼지 않도록 이 분주액들을 냉동하지 마십시오.

이제 칼슘 지시약을 필라멘트에 1~2cm 정도 흡입하면, 이 로딩 기술에서 가장 중요한 단계로 넘어갈 준비가 된 것입니다. 가위와 핀셋을 사용하여 가장 앞쪽의 분절 신경들을 복측 신경절에 가깝게 개별적으로 절단하십시오. 복측 신경절로부터 가장 앞쪽의 분절 신경 다발을 절단합니다.

모든 잔해물을 잘라내십시오. 충전용 필라멘트를 치과용 왁스 경사면에 배치하고 팁을 유충의 중심에 둡니다. 숄라스틱 튜브와 시린지를 연결하십시오.

Schneider 용액을 피펫 팁으로 흡입합니다. 이제 신경의 끝부분을 팁 안으로 끌어당깁니다. 이때 팁에 적절히 맞아야 하며, 너무 꽉 끼지 않도록 주의하십시오.

Schneiders가 보호 구역으로 더 이상 진입하지 못하도록 차단해야 합니다. 일반적으로 scholastic 튜브와 시린지를 제거하고 이를 F 필라멘트에 부착합니다. 정전기를 방전시키기 위해 필라멘트의 측면을 배스 내의 Schneiders에 접촉시킨 후, 신경 절단 부위에 실제로 닿지 않도록 주의하며 즉시 필라멘트 검 gum 효과를 50 microns 이내로 삽입하십시오.

칼슘 지시약을 천천히 분사하여 슈나이더(Schneider)의 부피를 약 3분의 1 정도 늘립니다. 이렇게 하면 최종 칼슘 지시약 농도가 2mM 바로 아래가 됩니다. 조제물을 어둡고 습하며 실온인 곳에 약 40분 동안 둡니다. 여기서 두 가지 중요한 점을 말씀드리고자 합니다.

먼저, 칼슘 지표를 희석하기 위해 팁 내에 생리식염수가 들어 있어야 합니다. 칼슘 지표는 증류수에만 용해되었기 때문입니다. 축삭 밀봉(axon sealing)은 칼슘 의존적 과정이며, 신경 말단의 건강을 유지하는 데 필수적이므로, 생리식염수는 수 밀리몰(millimolar) 농도의 칼슘을 함유해야 합니다.

두 번째 주의 사항은 신경을 절단한 후 신경의 절단단에 염료를 도포하기까지 5분 이상이 경과해서는 안 된다는 점입니다. 5분이 지나면 축삭의 천장단(ceiling ends)이 분자량이 10,000인 덱스트린 결합 칼슘 지표의 유입을 차단하게 됩니다. 이 시간 제한을 맞추기 위해서는 어느 정도의 숙련이 필요합니다.

칼슘 수치를 낮춰 축삭 천장을 지연시키려고 시도하지 마십시오. 이는 신경 손상의 향후 생리학적 기능을 저하시킬 뿐입니다. 40분간의 배양 후, 슈나이더 배지(Schneiders)에 담긴 표본을 욕조의 충전 필라멘트 측면에 접촉시킨 후 다시 삽입하여 팁과 스타터에서 칼슘 지시약 용액의 대부분을 제거하십시오. 다시 필라멘트를 사용하여 욕조에서 신선한 슈나이더 배지를 빨아들여 침강물을 슈나이더 배지로 완전히 채우십시오.

Schneider 용액이 배양액과 절연된 전도체 중 하나로 작용하므로 베드 내에 기포가 없어야 합니다. 자극을 받은 신경의 pet glass를 처리한 후, 다시 시료를 어두운 곳에 최소 60분에서 최대 4시간까지 보관하십시오. 배양하는 동안 30분마다 신선한 Schneider 용액으로 헹궈주십시오. 칼슘 지표가 하단으로 이동합니다. 시료를 관찰하기 20분 전에 축삭 말단에 농축시키십시오. HL six 용액으로 헹궈냅니다.

글루탐산 또는 L-글루탐산(L glutamic acid)을 7 mM 농도로 HL6에 첨가하여 신경 유발 근육 수축을 억제하고, 칼슘 농도가 약 0.4 mM 이상일 경우 이를 원하는 수준으로 조절하십시오. Schneider 용액은 이미 고농도의 글루탐산과 칼슘을 포함하고 있어 칼슘 이미징에는 적합하지 않습니다. 이러한 농도는 필요에 따라 조정해야 합니다.

Tate 또한 존재하므로, 로딩 중에 calcium 농도가 최소 2 million으로 유지된다면 Schneider의 자가형광 로딩 및 이미징을 HL six에서 수행할 수 있습니다. 이미징을 위해 화합물 현미경 위에 시료를 설정할 때, 다시 한번 모든 정전기를 방전시키십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 배스 내의 용액과 대물렌즈를 모두 터치하십시오.

침수 렌즈를 사용하는 경우, 렌즈를 용액까지 내린 다음 베이스를 일시적으로 접지하거나, 하나를 용액에 넣고 다른 하나를 삽입하십시오. 3 V 미만의 전압과 300 µs의 지속 시간을 갖는 DC 펄스를 가하면 신경에서 활동 전위가 안정적으로 유도됩니다. 여기서는 GFP의 세포질 발현을 통해 근육 6번과 7번 사이의 틈새에 있는 두 세트의 신경 말단이 가시화된 것을 볼 수 있습니다. 또한 이들은 GFP와는 서로 다른 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 칼슘 지시제인 Rod Dextrin으로 전방 충전되었습니다.

이 시야에는 여전히 신경 말단이 포함되어 있지만, Rod Rin은 칼슘에 대한 친화도가 낮아 신경이 정지 상태일 때는 거의 보이지 않습니다. 그러나 단일 활동 전위나 2초간의 짧은 자극 열 동안 말단으로 유입되는 칼슘에는 매우 민감하게 반응합니다. 앞서 보여드린 좁은 간격의 80 hertz 자극에 대한 형광 분석에서 알 수 있듯이, type one S 말단에서의 반응은 일반적으로 type one B 말단에서의 반응보다 더 크게 나타납니다.

Rod dextrin 및 flu와 같은 저친화도 칼슘 지시약. Rod dextrin은 10에서 80 hertz 범위의 신경 자극 빈도에 대해 이들 말단에서 거의 선형적인 반응을 보였습니다. 여기에 제시된 예시는 Rod dextrin이 로딩된 4번 근육의 신경 말단에서 얻은 결과입니다.