Name: 칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: 배우세요 Drosophila 신경 터미널에 칼슘 지표를 로딩하는 방법을. 이 기법은 신경전달에서 칼슘 역학을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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<ol><li> 어떤 fixatives에 노출되지 않은 깨끗한 절개 요리를 선택합니다. </li><li> 칼슘 2 포함 슈나이더의 Drosophila 매체에서 방황 제 3 instar Drosophila의 유충을 해부하다 +와 L - 글루타민 (모든 신경 손상이나 근육 섬유 Nos. 7, 6, 13 또는 12 깎지 않아.) </li><li> 12 마이크론 팁 (내경)과 유리 필링 - 피펫을 선택합니다. </li><li> 주사기와 튜브를 사용하면 (피펫에 부정적인 압력을 적용) 피펫 팁을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 유리 피펫의 길이를 삽입할 수 고급 플라스틱 충전 - 필라멘트를 선택합니다. </li><li> + - 표시기 플라스틱 필라멘트에 5 밀리미터 dextran - 복합 칼슘 2 ~ 1cm을 그립니다. </li><li> 모든 세그먼트 신경 컷. </li><li> 피펫 팁의 해부 유충의 복부 정중선 접근 수있는 램프에 피펫을 지원한다. </li><li> 피펫의 끝 (슈나이더의 중간의 작은 금액을 포함)으로, 신경을 곤란하게하지 않고, 제 4 세그먼트에 신경의 절단 끝을 그립니다. </li><li> 필라멘트의 끝부분이 (신경을 만지지 않도록) 신경의 절단 끝 50 미크론 이내 때까지 튜브를 제거하고 피펫으로 플라스틱 필라멘트를 삽입합니다. </li><li> 꺼내기 충분한 칼슘이 33 % (최종 농도가 &lt;2mM한다)의 슈나이더의 매체의 볼륨을 증가 종료 신경에 + - 표시. 중요 - 이것은 신경을 절단 5 분 이내에 완료해야합니다. </li><li> 상온에서 어둠의 준​​비를 놓고 신경 부하 동안. </li><li> 40 분 필라멘트를 사용하여 칼슘 2 + - 표시기를 제거한 후. </li><li> 장소에 피펫을두고 이것은 신경에 자극 펄스를 적용하는 데 사용됩니다로서, 신선한 슈나이더의 매체로 완전히 채우십시오. </li><li> 칼슘 2 + - 표시등이 최소 60 분 동안 신경 평형 수 있지만 더 이상 4보다 시간, CA 2 + 영상을 시작하기 전에. </li><li> 신선한 슈나이더의 중간 30 분 간격으로 그것이 equilibrating하는 동안과 준비를 씻어. </li><li> 이미징 전에 20 분 Hemolymph - 마찬가지로 6 번 솔루션 (; 맥레오드 ​​외​​ 2002;. 2003 HL6)와 슈나이더의 매체를 대체합니다. </li><li> L - glutamic 산성 또는 글루 탐 산염은 신경 evoked 근육 수축 방지하기 위해 postsynaptic 글루 탐 산염 수용체를 감도를 줄이다하는 7mM에서 HL6 솔루션에 추가할 수 있습니다 (맥레오드 ​​외​​를 2004;. 레이프 외가 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>L-glutamine 및 칼슘이 포함되어야 함</td></tr><tr><td>L-glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

칼슘 지표로 로딩 drosophila 신경 터미널

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

칼슘은 신경 계통에 많은 역할을 담당하고 있지만 신경 전달 물질 릴리스에 대한 트리거로보다 인상하고, 학습 및 메모리를 지원하는 시냅스 소성에 필수적인 메신저로서보다 그리하여 더 깊이 없음. 추가로 칼슘 2의 분자 토대를 명료하게하다하려면 + 종속적인 시냅스 메커니즘, 모델 시스템은 유전자 가단과 생리학에 액세스할 모두되어 있어야합니다. Drosophila melanogaster 같은 모델을 제공합니다. 이 시스템에서 유전자 인코딩 형광 표시기 신경 터미널에서 칼슘 2 + 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나 이러한 지표 칼슘 2 민감성을 제한 + 종종 비선형 응답을 보여줍니다. 합성 형광 표시기가 더 빠른 칼슘 2 + 신경 활동과 관련된 변화를 측정에 적합합니다. 여기 Drosophila의 유충에 살고 신경 터미널에 dextran - 복합 합성 칼슘 2 + 지표를로드하는 방법을 보여줍니다. 특정 강조 그러한 연장 로딩 기간 동안 준비의 건강을 유지, 절연 신경을 따라 정전기의 방전을 방지하는 방법으로 기술의 성공에 가장 중요한 프로토콜의 이러한 측면에 배치하고, 칼슘 2 제공하여 축삭의 생존을 보장합니다 + 절단 축삭의 엔딩의 씰링 추진. 낮은 친화력은 dextran - 복합 등 fluo - 4 및로드 &#39;로 + - 지표, 칼슘 2 + 최소한 역학 presynaptic 칼슘 2 방해하면서 높은 신호 대 잡음 비율을 보여주 어떤 사용할 수 있습니다. Dextran - 활용은 + 표시가 같은 mitochondria로 organelles로 압수되는 칼슘 2 방지할 수 있습니다. 로딩 기법은 애벌레, 배아와 성인을 동등하게 적용할 수 있습니다.

칼슘은 시냅스 강도 신경 전달 물질 릴리스 및 변경 실행을위한 필수적인 신경 시스템에 유비 쿼터스 메신저입니다. 여기 + - 지표 Drosophila 신경 터미널에 칼슘이 로딩을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 또한 필요한 장치의 제조를 설명하고 기술의 성공을위한 중요한 포인트를 강조.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

칼슘은 신경계에서 많은 역할을 하지만, 신경전달물질 방출의 트리거로서 그보다 더 인상적인 역할은 없으며, ...로서 그보다 더 심오한 역할 또한 없습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Greg McLeod입니다. 저희 연구실에서는 신경 말단의 칼슘 조절과 그것이 신경 전달에 미치는 영향을 연구하고 있습니다. 저희는 이 연구를 *Oph Melanogaster*를 통해 수행합니다.초파리는 유전적 조작이 용이하고 신경계가 단순하며 접근성이 좋아 신경과학자들에게 매력적인 모델입니다. 이 신경계에서는 유전적으로 인코딩된 형광 지표를 통해 신경 말단의 칼슘 변화를 검출할 수 있습니다. 하지만 이러한 지표들은 칼슘에 대한 민감도가 제한적이며, 종종 비선형적인 반응을 보입니다.합성 지시약은 신경 활동과 관련된 급격한 칼슘 변화를 측정하는 데 더 적합합니다. 여기서는 합성 칼슘 지시약을 덱스트린과 결합하여 oph lava의 살아있는 신경 말단에 주입하는 기술을 시연하겠습니다. 덱스트린 결합은 칼슘 지시약이 미토콘드리아와 같은 세포 소기관에 격리되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.로딩 기법은 유충, 배아 및 성체에 동일하게 적용할 수 있습니다. 유리 슬라이드 위의 작은 시가 배스(cigar bath)에서 유충을 해부하겠습니다. 청색 치과용 왁스는 유리 로딩 베드를 지지하는 역할을 합니다.혼잡하지 않은 바이알의 측면에서 star lava의 3분 1 정도를 조심스럽게 꺼냅니다. 유충을 차갑게 식힌 Schneider 용액 몇 방울 위에 놓고, 등 중앙선을 위로 하여 머리와 꼬리 부분을 핀으로 고정합니다. 날카로운 마이크로 가위를 사용하여 절개합니다.여기 트라키아(tra) 사이에 가위의 아래쪽 날이 들어갈 수 있을 정도의 작은 절개창을 냅니다. 트라키아 사이의 등쪽 정중선을 따라 큐티클을 머리 끝까지 절개합니다. 유충을 180도 돌려 절개창을 꼬리 끝까지 연장합니다.하단 칼날이 내장 기관에 너무 깊게 침투하지 않도록 주의하고 유충만을 절개하는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 조사하려는 근육과 신경이 손상될 수 있기 때문입니다. 대부분의 내장 기관이 절개창을 통해 밀려 올라오면, 꼬리 근처의 경로를 한 번 자르고, 아래에 있는 기관을 머리 끝까지 따라가며 모두 잘라냅니다. 반대편에서도 동일하게 반복합니다.내장의 대부분을 절단하여 배스에서 제거합니다. 잠시 가위를 내려놓고 두 번째 포셉을 집어 듭니다. 큐티클의 절단된 가장자리를 잡아 한쪽으로 고정합니다.반대편에서도 동일하게 반복합니다. 머리 쪽으로 4개 마디를 더 이동하여 절차를 반복합니다. 이 단계에서 남아 있는 내장 기관을 제거합니다. 모든

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 리간드 결합 및 형광 이미징을 사용하여 초파리에서 감각 뉴런 반응을 감지하는 방법을 보여줍니다. 리간드는 뉴런 수용체에 결합하여 칼슘 유입을 일으킵니다. 칼슘은 지표 복합체에 결합하여 형광 방출을 유발하여 리간드에 대한 신경 반응을 확인합니다.

Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

이 비디오에서 초파리 유충 신경 섬유는 세포막 지질에 결합하는 FM 염료에 잠겨 있습니다. 흡입 미세전극 및 전기 펄스는 세포내이입 과정을 자극하여 FM 염료를 새로 형성된 세포내포에 통합합니다. 신경 전달의 시냅스 전 단계를 시각화하는 이 방법은 시냅스 기능과 신경전달물질 방출을 연구하는 데 유용합니다.

Microelectrode-Mediated FM Dye loading and unloading in Drosophila 유충 신경 세포의 검출기

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

이 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 도구를 사용하여 Drosophila melanogaster 유충의 중추신경계에서 정의된 신경 파트너 간의 기능적 시냅스 활동을 생체 내에서 평가합니다. CsChrimson 매개 광유전학적 자극은 시냅스 전 감각 신경세포 cIVda 신경세포를 유발하여 시냅스 후 분지 4 중간뉴런에서 CaMPARI의 칼슘 의존적 광변환을 유도합니다.

CaMPARI를 이용한 초파리 유충 중추신경계에서 개별 시냅스 전후 파트너의 기능적 특성 분석

배우세요 Drosophila 신경 터미널에 칼슘 지표를 로딩하는 방법을. 이 기법은 신경전달에서 칼슘 역학을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

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