Name: 생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아의 세포 형태 변화를 실시간 공초점 이미징으로 관찰하는 방법을. GFP 표지 단백질 프로브를 활용한 이 기술은 발생생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리는 기꺼이이 프로토콜을 개발한있는 기초를 제공 에릭 Wieschaus을 인정합니다. 우리 작품은 베르나 &amp; 마스 맥린 생화학 계열 분자 생물학 시작 - 업 상, 의학 베일러 대학에서 지원됩니다.

1. 엠브료 컬렉션 컵 조립 <ol><li> 가능한 한 매끄러운로 가장자리를 만들고 레이저로 100 ML 트라이 - 옥수수 비커의 바닥을 잘라. 이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 컵, 당신은 또한 상단에서 세 모서리를 장식하는 경우 처리하기가 쉽습니다. </li><li> 와이어 메쉬 (6cm X 6cm)의 정사각형을 잘라. 미리 예열 뜨거운 접시에, 내부 퓸 후드, 레이어 강력 알루미늄 호일의 조각 위에 와이어 메쉬의 광장. 단단히 뜨거운 메쉬에 컵 컷 아래쪽 가장자리에 밀어. 몇 초 동안 잠깐 만요, 지금 첨부 메쉬와 컵 리프트. 호일도 경우엔 그냥 풀어 껍질. </li><li> 하룻밤 잔 쿨. 미세 입자 사포와의 날카로운 가장자리에서 초과 가위로 메쉬와 모래를 제거합니다. </li></ol> 2. 애플 쥬스 아가르 번호판 확인 <ol><li> 6L 플라스크에 100g BD Bacto 아가르 및 3L 증류수를 결합. 느린 배기 설정 30 분 한천을 압력솥. </li><li> 저어 바있는 2L 플라스크에 100g의 자당, 1L 사과 주스, 그리고 6g P - Hydroxybenzoic 산성이 결합되어 있습니다. 뜨거운 접시에 감동하면서 끓는 수있는 솔루션을 열. 2 개 이상 분 동안 끓여하지 마십시오. 사과 주스의 혼합물은 냉각 후 한천로 저어 바와 함께 추가할 수있게 해줍니다. 완전히 섞는다. </li><li> 60x15 mm 배양 접시에 쏟아져 전에 60 ° C 물 목욕 시원하고에 결합 솔루션을 허용합니다. 또한, 연동 펌프는 한천을 분배하는 데 사용할 수 있습니다. 접시는 최소한 4 시간 동안은 상온을 하다니 수 있습니다. 4 얜 젖은 종이 수건과 저장소의 계층 ° C.와 Rubbermaid 용기에 스택 </li></ol> 참고 : <ul><li> 가을이나 겨울에는, 그것은 한천에 물을 추가 100 ML을 추가할 필요가있을 수도 있습니다. </li><li> 배양 접시의 브랜드는 중요하다! 만이 BD 팰컨 요리 트라이 - 옥수수 비커에 맞게. 특정 주문 정보는 아래의 자료 테이블에서 찾을 수 있습니다. </li></ul> 3. 배아의 컬렉션 컵에 GFP의 파리를 추가 <ol><li> 병를 설정하여 컬렉션의 필요에 따라 GFP의 주식을 확장 이전 영상 약 이주 날아. 파리 한 병 50 여성 30 남성 최소 하나의 배아 수집 컵 채우기 위해 일반적으로 충분 그 이상입니다. 최고의 부설 들어, 파리 (이후 부화 미만 오일 IE) 새로 eclosed해야합니다. </li><li> 대략 동등한 부품 레드 스타 활성 건조 효모와 증류수와 작은 잔을 작성하여 붙여 효모를 확인하고 효모가 해산 때까지 저어. 붙여넣기가 젖어 땅콩 버터의 대략적인 일관성해야합니다. 더 많은 효모 또는 물이 일관성을 변경 추가할 수 있습니다. 효모 붙여넣는 4에서 몇 일 동안 사용할 수 있으며, 저장해야합니다, 보상 ° C. </li><li> 효모 붙여넣기가 준비되면, 4 사과 주스 플레이트를 제거 ° C 저장합니다. 사과 주스 효모 붙여넣기와 접시, 그리고 그들이 22-25에 따뜻한 있도록 리크 ° C, 달걀이 누워 권장합니다. </li><li> 다음 반으로 다시 반으로 원형 필터 종이를 접으십시오. 8~9cm 직경을 장식하고, 쿼터 서클에서 아코디언 폴드합니다. , 동그라미를 펼쳐 그것을 반전하고, 그것이 메쉬를 접촉하기 전까지 컬렉션 컵에 넣습니다. 이 가을과 파리 호감하지 않도록 종이 컵에 안전 있는지 확인합니다. 여과지는 선택 사항이지만, 짝짓기를위한 환영 환경을 제공 않으며, 컵에 습도를 유지하고 있습니다. </li><li> 재고의 이름과 날짜와 한 잔 라벨. 부드럽게 컵 위에 거꾸로 병을 흔들어하고, 즉시 준비된 사과 주스 플레이트와 컵 커버하여 병 컬렉션에서 대회에 파리를 전송합니다. 고무 밴드와 컵 접시를 고정합니다. 직접 조명과 함께 지역의 컵 메쉬 사이드를 설정합니다. 파리는 어둠 속에서 잘하다하지 않습니다 그림자가 컵에 떨어지는 일은 없을 있는지 확인합니다. </li><li> 필요에 따라 사과 주스 플레이트를 변경합니다. 두 시간 컬렉션, 상온에서, 이미지 cellularization을 위해 잘 작동합니다. </li></ol> 4. 장착 챔버 준비 <ol><li> 배아의 장착 챔버를 준비하려면, 2~3cm 긴 양면 테이프의 조각을 잘라 슬라이드에 배치, 테이프 및 슬라이드의 긴 축을 정렬. 그들의 가장자리가 정렬되었는지 확인하고, 두 번째 2~3cm에게 양면 테이프 및 레이어 그 테이프의 다른 조각 위에 긴 조각을 잘라. </li><li> 면도날을 사용하여 슬라이드의 긴 축에 테이프와 직각의 중심에 간격이 삭감 약 3mm합니다. 채널을 만들기 위해 인하 사이의 테이프를 제거합니다. 채널에 할로 카본 27 오일의 Pipet 놓습니다. 배아가 마운트 위치를이 채널입니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 만이 ½ 인치의 스카치 양면 테이프는 배아를 수용할 수있는 권리 두께입니다. </li><li> 할로 카본 27 오일 산소 침투성이며, 배아 탈수를 방지하면서 있도록 산소 교환이 가능합니다. 의 굴절률로 인해, 할로 카본 27 오일도 준비에 이상적입니다및 이미징 배아. </li></ul> 5. Dechorionate 태아 <ol><li> 수집하고 dechorionate 배아하려면, 완전 잠수함 전체 표면을 위해 사과 쥬스 한천 플레이트에 충분히 50 %의 표백제를 부어. 배아들이 chorion에서 출시하는 등 전송 빛으로 자이스 혈구 검색 V8로, 해부 현미경을 사용하여보세요. 마자 chorion가 풀리고, 몇 배아 (30~60초)에서 출시로 셀 스트레이너에 표백제 및 배아를 부어. </li><li> 물총 병의 증류수로 즉시 적극적으로 스트레이너의 배아를 씻으십시오. 종이 타올에 DAB 거르는. 어떤 분홍색이 dabbing 후 수건에 볼 수있다면, 물을 배아 닦고 계속합니다. </li><li> 깨끗한 사과 주스 플레이트 (NO 효모 붙여넣기로)에 10-50 배아를 전송하기 위해 촉촉한 페인트를 사용하십시오. 종이 타월의 찢어진 가장자리로 물을 멀리 윅하고, 즉시 할로 카본 27 오일을 소량으로 배아를 커버. </li></ol> 참고 : <ul><li> Clorox의 표백제를 사용하지 마십시오. 대신, &lt;6 % 나트륨 차아 염소 산염이다 오스틴의 A - 1 상업용 표백제와 같은 브랜드를 사용합니다. </li><li> 오버 표백 또는 rinsing 불충분이 불규칙 cellularization와 죽이 배아 발생합니다. </li></ul> 6. 스테이지 및 마운트 태아 <ol><li> 전송 빛의과 해부 현미경을 사용하여 번호판의 배아 단계로 Bownes 20 형태학의 지침을 따르십시오. 포셉를 사용하여 장착 챔버의 채널에, Bownes 4 단계에 해당하는, 5 mitotic주기 11 또는 12 배아를 전송합니다. 아래 지느러미 및 복부 측면의 가시 성과 측면 사이드와 라인의 배아를 마련. 태아도 쉽게 혼자 기름이 방향으로 정렬됩니다. 커버 슬립 아래 적용되면 그들은 산소 자신의 이웃을 박탈하므로 군중의 배아 함께하지 마십시오. (그들 사이 배아 길이의 절반 남겨주세요.) </li><li> 채널의 한쪽에 양면 테이프에 미끄럼 25x25 mm 커버 중 하나 가장자리를 놓는다. 채널을 커버하는 커버 슬립을 놓습니다. 공기가 아래에 잡힌 경우, 커버 슬립의 가장자리에 할로 카본 27 오일의 작은 금액을 적용합니다. 모세관 현상은 채널에 기름을 끌어와 공기를 밖으로 밀어 것입니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 준비 배아에 대한 또 다른 훌륭한 자원은 다음과 같습니다 캄포스 - 오르테가, JA 및 Hartenstein, V. (1985). Drosophila melanogaster의 배아 개발. 스프링거 - Verlag, 베를린. 이 책은 더 이상 게시되지 않습니다 있지만, 사용하는 사본은 Amazon.com에 정기적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 아껴서 할로 카본 27 석유를 사용하십시오. 이것은 장착이 쉽게됩니다. 또한 다음과 같은 이미징 단계에있는 현미경 목표에 기름 흘러 우연히 방지할 수 있습니다. </li></ul> 7. 이미지 태아 <ol><li> 여기 어떻게 진행 과정이 영상되는 세포 모양의 변화, 그리고 주소되는 질문에 의해 결정됩니다. 모든 형상 변경, 중 직립하거나 거꾸로 현미경에 장착 챔버 장소 전염 빛을하여 배아를 찾아, 그리고 관심 영역에 집중할 수 공촛점 이미지로 전환합니다. 같은 니콘의 MicroscopyU (에서 논의된 것과 공촛점 현미경에 대한 모범 사례를 준수 <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). photobleaching 및 phototoxicity을 방지하기 위해, 가능한 한 작은 레이저의 파워로 생활 배아를 노출 특히 엄격한한다. </li><li> cellularization 들어, 자이스 혈구 710 레이저 스캐닝 공촛점 현미경에 이미지는 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표를 ​​사용합니다. 이 현미경은 18-20에서 ° C.를 이르는 온도, 온도 제어 방 안에 보관되어 있습니다 온도 제어가 절대적으로 필요하지 않다지만, 그것은 현미경에보다되며 이미지가 더 일관성 수 있습니다. 배아의 중앙 근처에 하나의 비행기로 우리는 정기적으로 이미지, 단면의 플라즈마 막 invaginations (그림 2)를 수행합니다. 단순히 invagination 역학에 따라 들어, 30~60초 간격은 시간이 오래 경과 이미징을위한 충분한 있으며, 태아는 산소 부족이라는 명백한 증거와 함께&gt; 90 분간 영상을 견딜해야합니다. </li><li> 이미지를 인수 후, 그들은 ImageJ (라고 국립 보건원에서 프리웨어를 포함하여 이미지 분석 패키지의 임의의 숫자를 사용 분석할 수 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij을</a> ). 데이터는 다음 영화 (영화 1), 시퀀스 (그림 2) 또는 kymographs 21로 제시하실 수 있습니다. </li></ol> 참고 : <ul><li> 물이 침수 C - 고차 색지움 40x/1.2 W 코어의 목표는 배아 근처 이미징 수성 샘플 깊은 조직 이미징에 대한 aberrations을 제한 높은 개구로 인해 중간 섹션에 적합하고, 높은 해상도와 높은 형광 신호를 제공합니다. 또한,이 목표매우 긴 작동 거리 (220 μm의)을하고 있습니다. 그러나, 다른 물 또는 글리세린 침지 목표는 관심의 세포 모양의 변화는 배아의 표면 근처에 몇 군데 있습니다 특히면, 잘 수행합니다. </li></ul> 8. 다른 방법 : "배아 - 접착제"로 마운트 태아 <ol><li> cellularization 이외의 이미지 셀 모양 변경하려면, 그것은 쉽게 혼자 기름에 유지되지 않는 특정 방향으로 배아를 마운트 할 수 있습니다. 이렇게하려면, 이전에 설명한 것과 다른 장착 방법을 사용합니다. 섬광의 약병에 헵탄 250 μL와 양면 테이프 20cm를 결합하여 "배아 - glue"를함으로써 시작합니다. 섬광 nutator에 유리병이나 회전 플랫폼을 장소, 하룻밤 섞는다. </li><li> 배아 접착제에 노란색 피펫 팁을 찍어, 그리고 접착제의 흔적을 떠나, 슬라이드 따라 팁을 추적. 헵탄가 증발하는 동안, 당신은 한천의 블록에 필요한 방향으로 배아를 개최 맞춥니다. (몇 군데로 배아 표면 한천 직면한다 기억하십시오. 예를 들어, 복부 고랑 형성하는 동안 이미지 셀 모양 변경하려면, 한천을 향한 그들의 복부 측면과 배아를 탑재합니다.) </li><li> 접착제로 슬라이드를 반전하고, 부드럽게 한천 블록에있는 태아에 대한 접착제의 흔적을 누르십시오. 이제 다시 슬라이드를 반전. 배아는 해당 방향에 갇혀 것입니다. 배아의 양쪽에 양면 테이프 두 레이어를 추가, 할로 카본 27 기름을 커버하고 coverslip을 적용합니다. 위에서 설명한대로 이미지와 함께 진행합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 태아가 건강하고 이미징 최적있다면, cellularization은 50-60분을해야하고, 플라즈마 막 invaginations은 진입 약 40 미크론을해야합니다. 배아는 이상 - 표백, 산소 phototoxicity에 의해 박탈되거나 손상된 경우에는, 다음 invagination도 특히 몇 군데 지역에서 느리거나 중단됩니다. 배아 건강 악화는 종종 그러한 변경 개발, 애벌레로 부화에 실패 결과. 따라서, 영상 후 분석 배아 건강에 엄격한 테스트에, humidified 챔버에 슬라이드를 유지하고 다음날 부화 살펴보십시오. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 배아 컬렉션에서 이미지로 워크플로우. 프로토콜의 흐름은 네 가지 주요 단계로 세분 수 있습니다. 첫 단계에서 모든 개인 용품 및 구성 요소가 준비하고 있으며, 다음 배아 수집 컵, 사과 주스 한천 플레이트와 GFP 파리는 배아 부설 환경을 만들어 함께 부착 할 것입니다. 두 번째 단계에서 사과 주스 한천 플레이트에 누워있는 계란과 배아가 수집됩니다. 세 번째 단계에서 배아가 플레이트에서 제거됩니다, 공연 및 장착 챔버로 이송. 네 번째 단계에서는, 탑재 배아는 공촛점 현미경에 몇 군데 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 데이터입니다. 태아는 지느러미 (D)와 명확하게 보이는 복부 (V) 측면과 함께 탑재하고 있으며, 단면의 플라즈마 막 invaginations를 수행하기 위해 중간 몇 군데 있습니다. 여기에 표시된 배아는 표현 GFP - 마이 오신 - 2 플라즈마 막 invaginations의 끝을 집중 탐사 6. 따라서 시간이 지남에 따라이 프런트의 ingression를 추적하면 플라즈마 막이 invaginates 속도를 제공합니다. 0시 분 시점은 cellularization의 발병에 해당합니다. 곧 56:00 분 시점 이후 gastrulation은 배아의 복부 측면에 시작합니다. 바 40 미크론이다. 영화 1. cellularization 시간 - 저속 영상의 대표 영화.이 영화는 2 그림에 해당합니다. cellularization의 전체 과정을 기록하기 위해 영상은 pseudocleavage 퍼로우 회귀를 캡처, 이전 mitotic주기 13에서 시작하고, gastrulation 운동은 태아의 복부 측면에서 볼 때까지 계속되었습니다. 이미지는 한 분 간격으로 수집되었다. 농도는 쉽게 gastrulation의 움직임을 볼 수 있도록 포스트 인수를 증가했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">동영상을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> <table border="1"><tbody><tr><td> 발달 행사 및 타이밍 * </td><td> 관련 셀 모양 변경 </td><td> 질병이나 인간의 건강에 대한 링크 </td><td> 라이브 영상과 함께 최근 참고 문헌 </td></tr><tr><td> 의사 - 절단의 고랑 형성 (4; 90분 PF) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidy 및 암 진행 1 </td><td> Mavrakis 외. 2009 8 카오 외. 2010 년 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5; 130분의 PF) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidy 및 암 진행 1 </td><td> 카오 외., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus 2008 11 </td></tr><tr><td> 복부 고랑 형성, Mesoderm의 invagination (6; 180분 PF) </td><td> 혀끝의 수축, 상피 - mesenchymal 전환 </td><td> 암 전이 2 </td><td> 폭스 &amp; Peifer, 2007 12 마틴 외. 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband 확장 (7; 195분의 PF) </td><td> 수렴 확장 </td><td> 신경 튜브 결함 3 </td><td> Bertet 외., 2004 14 블렝큰쉽 외., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320분의 PF) </td><td> 상피 튜브 형성 및 분기 </td><td> Angiogenesis 4 </td><td> Caussinus 외., 2008 16 제바 이스 &amp; 카사노바, 2010 17 </td></tr><tr><td> 도설 폐쇄 (14; 620분 PF) </td><td> 혀끝의 수축 </td><td> 상처 치유 5 </td><td> Gorfinkiel 외. 2009 18 솔론 외. 2009 19 </td></tr></tbody></table> 세포 모양 변화 표 1. 예로는 생활 플라이 배아에서 몇 군데 * Bownes 단계 번호와 시간 이후의 수정 (PF), 각 이벤트가 시작될 때, 캄포스 - 오르테가, 1985에 따라 나열되어 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 주식 플라이 </td><td> 레이블 </td><td> 원본 참조 </td></tr><tr><td> 스파이더맨 GFP (95-1) </td><td> 플라즈마 막 </td><td> 모항 외., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille - GFP (117-2) </td><td> 플라즈마 막 </td><td> 모항 외., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43 - 비너스 </td><td> 플라즈마 막 </td><td> Mavrakis 외. 2009 8 </td></tr><tr><td> 스파게티 스쿼시 - GFP (Sqh - GFP) </td><td> 마이 오신 - 2 </td><td> Royou 외., 2002 6 </td></tr><tr><td> E - cadherin - GFP (Ecad - GFP) </td><td> 셀 - 셀 분기점 </td><td> 오다 외., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP - Moesin </td><td> F - 굴지 </td><td> Kiehart 외., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin - 비너스 (Utro - 비너스) </td><td> F - 굴지 </td><td> Sokac 외., 발표되지 않은 결과 </td></tr></tbody></table> 파리 배아의 이미징 세포 모양의 변화에 대한 표 2. 유용 주식

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜은 여기에 개발 비행의 배아에서 세포 모양의 변화 다수의 라이브, 공촛점 이미징을 허용합니다 설명했다. 이미지에 대한 GFP 주식은 개별 연구소 (표 2)에 의해 준비하지만, 많은 이러한 주식은 인디애나 대학 (블루밍턴에서 같은 Drosophila 증권 센터로 센터에서 공개적으로 사용할 수있는 수 <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> )과 파리통 예일 대학 (앳 증권 센터 <a href="http://flytrap.med.yale.edu">http://flytrap.med.yale.edu</a> ). 일단 획득이 라이브 영상 데이터는 철저하게 해당 드라이브 세포 모양의 변화와 조직 morphogenesis 단백질 기능, 하위 세포 활동, biophysical 매개 변수를 정의하는 정량 분석​​와 결합 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>슬라이드 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>세척병 (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>소형 피펫용 벌브, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>캡 포함 신틸레이션 바이알</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Corn 비커, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 페트리 접시 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 셀 스트레이너</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>노란색 피펫 팁</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스강 메쉬, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>유리제 5&amp;#190; 인치 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4 거름종이</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>고무줄</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 양면 테이프, &amp;frac12; 인치</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression 페인트 브러시 E85 라운드 #2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋 High Precision Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon Oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxybenzoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star 활성 건조 효모</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월, C-fold</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고강도 알루미늄 호일</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 사과 주스</td><td>Ocean Spray 또는 Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

생활의 이미징 셀 모양 변경 drosophila 태아

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

개발 Drosophila melanogaster의 배아는 공촛점 이미징 살고 매우 의무가 아르 셀 모양 변경 번호를 겪습. 파리에서 셀 모양 변경은 더 높은 유기체에있는 사람들에게 유사하며, 그들은 조직 morphogenesis 운전. 그래서, 많은 경우에 그들의 연구는 인간의 질병 (표 1) 1-5 이해에 대한 직접적인 의미가 있습니다. 하위 세포 규모에서 이러한 세포 형태의 변화는 유전자 발현의 신호 전달, 세포 극성, cytoskeletal 개조 및 멤브레인 인신 매매에 이르기까지 활동의 제품입니다. 따라서 Drosophila의 배아들은 조직 morphogenesis 관련된으로 세포 모양의 변화를 평가할 수있는 상황뿐만 아니라를 제공뿐만 아니라 모양 세포 그 하위 세포 활동을 연구하기 위해 완전히 생리 환경을 제공합니다. 프로토콜 이미지 cellularization라는 특정 세포 모양의 변화를 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. Cellularization는 극적인 플라즈마 막 성장의 과정이며, 그것은 궁극적으로 세포 배반엽에 syncytial 배아를 변환합니다. mitotic주기 14 계면에서 즉, 플라즈마 막 동시에 기본 상피 세포의 시트를 생성하기 위해 ~ 6000 cortically 고정 핵의 각 주위 invaginates. 이전 제안을 카운터, cellularization는 마이 오신 - 2 수축성 6 주도 아니지만, 대신에 주로 내부 매장 7 막의 exocytosis에 의해 연료입니다. 따라서 cellularization는 cytokinesis 또는 가로 - 가느다란 관 (T - 가느다란 관) 근육의 morphogenesis로 플라즈마 막 invagination 또는 확장을 필요로 세포 모양의 변화 동안 멤브레인 인신 매매를 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다. 이 프로토콜은 쉽게 파리 배아의 다른 세포 형태 변경의 이미지에 적용하고, 그러한 배아 컬렉션의 무대를 변경하거나, 특정 방향 (테이블에있는 배아를 탑재 &quot;배아 접착제&quot;를 사용하는 것과 약간의 adaptations을 필요로됩니다 1) 8-19. 모든 경우에 흐름은 기본적으로 (그림 1)과 동일합니다. 복제 및 Drosophila transgenesis에 대한 표준 방법은 그린 형광 단백질 (GFP) 또는 그 변종에 융합, 관심의 단백질을 표현 안정적인 비행 주식을 준비하는 데,이 파리들은 배아의 재생 소스를 제공하고 있습니다. 또는 형광 단백질 / 프로브 직접 간단 마이크로 사출 기술을 통해 90-10 플라이 배아에 도입하고 있습니다. 그런 다음, 발달 행사 및 몇 군데으로 세포 모양의 변화에​​ 따라 태아가 수집되고 해부 현미경의 형태로 개최하고, 마지막으로 위치 및 공촛점 현미경에서 시간 저속 영상에 대한 마운트.

과일 파리, Drosophila melanogaster의 조기 개발이 잘 이미징 방식에 적합 세포 모양의 변화의 숫자에 의해 특징입니다. 이 문서 Drosophila의 배아 라이브 공촛점 이미징에 필요한 기본적인 도구와 방법을 설명하며, cellularization라는 세포 모양의 변화에​​ 초점을 맞출 것이다.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

발달 중인 초파리(Drosophila melanogaster) 배아는 라이브 공초점 이미징(live confocal imaging)에 매우 적합한 다수의 세포 형태 변화를 겪습니다. 세포 형태...

본 절차의 전반적인 목적은 살아있는 초파리(drosophila) 배아의 세포 모양 변화를 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 GFP가 태그된 단백질 프로브를 발현하는 형질전환 파리 계통을 생성하고 확장함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이 파리들을 배아 수집 컵으로 옮기는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 배아를 수집하는 것입니다. 네 번째 단계는 배아를 코팅하고 마운팅하는 것입니다. 최종적으로, 마운팅된 배아의 타임랩스 공초점 이미징을 통해 세포 모양 변화와 같은 결과를 얻을 수 있습니다.고정 조직 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 배아의 맥락에서 세포 형태 변화의 동적인 측면을 포착할 수 있다는 점입니다. 여기에 설명된 방법은 식도 형성(esophagusization)에 맞게 조정되었지만, 배측 홈 형성(ventral furrow formation), 배아대 신장(germ band extension), 기관 형성(tracheagenesis) 및 등쪽 폐쇄(dorsal closure)와 같이 초파리 초기 발생 과정에 수반되는 다른 세포 형태 변화에도 응용 및 적용될 수 있습니다. 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 흔히 해부 현미경 하에서 배아를 조작하고 고정하는 과정에 어려움을 겪습니다.제 지도 교수인 Anna Marie Soki 교수님과 제가 이 절차를 시연하겠습니다. 이 절차는 먼저 배아 수집용 컵을 만드는 것으로 시작합니다. 면도날을 사용하여 100 milliliter tricorn 비커의 바닥을 잘라내고, 절단면을 최대한 매끄럽게 만듭니다. 컵을 다루기 쉽게 하기 위해 상단의 세 모서리를 잘라냅니다.다음으로, 흄 후드 내에서 6 cm × 6 cm 크기의 와이어 메쉬 정사각형을 자릅니다. 미리 예열된 핫플레이트 위에 고강도 알루미늄 호일을 올리고, 그 위에 와이어 메쉬 정사각형을 배치합니다. 컵의 잘린 하단 가장자리를 가열된 메쉬 위에 단단히 누릅니다.몇 초간 기다린 후 망이 부착된 컵을 들어 올립니다. 포일이 함께 붙어 있는 경우 이를 벗겨냅니다. 다음 날까지 컵을 하룻밤 동안 보관하십시오.가위로 과도한 메쉬를 제거하고, 고운 사포로 날카로운 모서리를 갈아냅니다. 다음 단계는 암컷 초파리의 배아 생산을 촉진하기 위한 효모 페이스트를 만드는 것입니다. 작은 컵에 Red Star 활성 건조 효모와 증류수를 거의 동일한 비율로 채우고, 효모가 녹을 때까지 젓습니다.페이스트는 젖은 땅콩버터와 비슷한 농도가 되어야 합니다. 효모 페이스트가 준비되면, 4 °C 보관소에서 사과즙 한천 배지를 꺼내십시오. 사과즙 한천 배지 제조 방법에 대한 설명은 동반된 원고의 스트리크(streak) 섹션에 기술되어 있습니다.사과 주스로 플레이트를 코팅한 후, 효모 페이스트를 도포하고 플레이트가 실온으로 따뜻해질 때까지 최소 1시간 동안 기다립니다. 원형 여과지를 반으로 접습니다. 그다음 다시 한번 반으로 접습니다.종이를 지름 8~9cm 크기로 자릅니다. 4분원 모양으로 아코디언 접기를 합니다. 접은 원을 다시 펴서 뒤집은 다음, 메쉬에 닿을 때까지 수집 컵에 넣습니다.종이가 컵 안에 단단히 고정되어 아래로 떨어지면서 초파리를 압사시키지 않도록 확인하십시오. 이제 초파리를 옮길 차례입니다. 2주 동안 번식시킨 초파리 스톡 병을 준비하십시오. 이 병에는 배아 수집 컵 하나를 채우기에 충분한 양의 초파리, 즉 최소 암컷 50마리와 수컷 30마리 이상이 들어 있어야 합니다.최적의 산란을 위해 부화 후 5일이 지나지 않은 파리를 사용하십시오. 수집 컵에 계통 이름과 날짜를 기입하십시오. 파리가 든 병을 뒤집어 수집 컵 위에서 가볍게 흔들어 파리를 옮긴 후, 즉시 준비된 사과 즙 플레이트로 컵을 덮으십시오.고무줄을 사용하여 플레이트를 컵에 고정하십시오. 컵의 메쉬 덮개를 씌운 후, 직사광선이 닿는 상온의 구역에 두십시오. 초파리는 어두운 곳에서 산란을 잘 하지 않으므로 컵에 그림자가 지지 않도록 주의하십시오. 2시간 후, 사과 즙 플레이트를 새 플레이트로 교체하여 배아를 수집하고 상온에서 보관하십시오.세포 이미징에 적합합니다. 다음으로, 배아를 위한 마운팅 챔버를 준비합니다. 이를 위해 2~3cm 길이의 양면테이프 조각을 잘라 슬라이드 글라스 위에 놓고, 테이프와 슬라이드의 장축을 나란히 맞춥니다.2~3 cm 길이의 양면테이프 조각을 하나 더 잘라, 가장자리가 일치하도록 하여 기존 테이프 조각 위에 겹쳐 붙입니다. 면도날을 사용하여 테이프 중앙에 슬라이드의 장축과 수직 방향으로 약 3 mm 간격의 절개선을 두 군데 만듭니다. 절개선 사이의 테이프를 제거하여 채널을 만들고, 해당 채널에 halo carbon 27 오일을 피펫으로 떨어뜨립니다.이 채널은 배아를 고정하는 곳입니다. 사과 주스 플레이트를 50% bleach로 30~60초 동안 덮어 배아를 코팅합니다. 배아를 세포 체(cell strainer)로 수집하고 분무기에 담긴 증류수로 세게 세척합니다.거름망을 종이 타월로 가볍게 두드려 닦습니다. 젖은 페인트 붓을 사용하여 코팅된 배아 10~50개를 효모 페이스트가 없는 깨끗한 사과 주스 플레이트로 옮깁니다. 종이 타월의 찢어진 모서리로 물기를 제거하고, 즉시 소량의 halo carbon 27 오일로 배아를 덮어줍니다.투과광을 사용하는 해부 현미경으로 사과 주스 플레이트를 옮깁니다. 경계 형태학적 가이드라인에 따라 배아의 단계를 설정합니다. 핀셋을 사용하여 경계 4단계에 해당하는 mitotic cycle 11 또는 12 배아 5개를 마운팅 챔버의 채널로 옮깁니다.배아의 등쪽과 배쪽이 보이고 측면이 아래로 향하도록 일렬로 배열합니다. 오일만 사용하면 배아를 이 방향으로 쉽게 배열할 수 있습니다. 배아들이 서로 밀집되는 것을 방지하기 위해, 배아 사이에 최소한 배아 길이의 절반 정도의 간격을 둡니다.25 by 25 밀리미터 커버슬립의 한쪽 가장자리를 채널의 한쪽에 부착된 양면 테이프 위에 놓고, 커버슬립의 한쪽 가장자리를 테이프의 한쪽 가장자리에 맞춥니다. 커버슬립을 내려 채널을 덮습니다. 커버슬립 아래에 공기가 갇힌 경우, 커버의 가장자리에 소량의 오일을 도포합니다.모세관 현상에 의해 오일이 채널 내부로 유입되면서 공기가 밀려 나옵니다. 마운팅 챔버를 공초점 현미경 위에 올리고 투과광을 이용해 배아를 찾습니다. 그 다음, 공초점 이미징 모드로 전환하여 배아 중앙 부근의 단일 평면에서 세포 이미지를 얻기 위한 관심 영역에 초점을 맞춥니다.함입 역학을 추적하려면, 타임랩스 이미징을 위해 30에서 62번째 구간을 사용하십시오. 이미지를 획득한 후, NIH의 프리웨어 패키지인 image J와 같은 이미지 분석 패키지를 사용하여 분석하십시오. 이후 데이터는 동영상, 시퀀스 또는 CH 그래프로 제시할 수 있습니다. 세포 외의 다른 세포 형태 변화를 이미징하려면, 오일만으로는 유지하기 어려운 특정 방향으로 배아를 마운트해야 할 수도 있습니다.이를 위해, 이전에 설명한 방법과는 다른 대체 마운팅 방법을 사용하십시오. 먼저 20 centimeters의 양면 테이프와 250 microliters의 heptane을 vial에 넣어 배아용 접착제를 만듭니다. 이 vial을 교반기 또는 회전 플랫폼에 올리고 하룻밤 동안 혼합하십시오.다음 날, 노란색 피펫 팁을 배아 접착제(embryo glue)에 담근 후, 접착제 속의 헵탄(heptane)이 증발하는 동안 슬라이드를 따라 피펫 팁을 움직여 접착제 자국을 남깁니다. 영상화하려는 배아의 표면이 한천(agar) 블록을 향하도록 하여 배아들을 정렬합니다. 예를 들어, 세포 형태 변화를 영상화하려는 경우와 같이 배치합니다.패로우(farrow) 형성 과정에서, 배아의 복측이 한천을 향하도록 고정하십시오. 배아 접착제가 도포된 슬라이드를 뒤집어, 한천 블록 위의 배아에 접착제 라인이 가볍게 눌리도록 하십시오. 그런 다음 슬라이드를 다시 뒤집으십시오.대부분의 배아는 적절한 방향으로 슬라이드에 고정되어야 합니다. 다음으로, 배아의 양쪽에 양면테이프를 두 겹으로 부착합니다. 그 위를 halo carbon 27 오일로 덮은 후 커버 슬립을 씌웁니다.이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 이 사진들은 세포화된 배아가 배측(dorsal)과 복측(ventral)이 명확하게 보이도록 고정되어 중앙 부근이 이미징된 타임랩스 영상을 보여줍니다. 횡단면에서 세포막의 함입(invagination)을 관찰하기 위해, 여기에 제시된 배아는 세포막 함입의 끝부분에 집중되는 GFP myosin two 프로브를 발현하고 있습니다. 시간 경과에 따라 이 전면의 함입(ingression)을 추적하면 세포막이 함입되는 속도를 알 수 있습니다. 0분 시점은 세포화가 시작된 직후에 해당하며, 56분 시점 이후에는 배아의 복측에서 원장(gastrulation)이 시작됩니다.이 세포 타임랩스 영상은 이전의有糸分裂 주기인 13회차부터 시작되었으며, 가성 분열(pseudo cleavage)과 고랑 퇴행(furrow regression)을 포착하고 배아의 복측에서 위장관 운동이 관찰될 때까지 계속되었습니다. 숙달되면 적절하게 수행했을 때 마운팅과 이미징을 60~90분 내에 완료할 수 있습니다. 물론 배아 수집에는 추가 시간이 소요되며, 마운팅 및 이미징 일정과 조정되어야 합니다.이 절차를 수행하는 동안 배아의 건강 상태를 양호하게 유지하기 위해 가능한 모든 조치를 취하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 배아를 과하게 표백하지 말고, 본 절차에 따른 이미징 과정에서 레이저 노출을 제한하십시오. 특정 세포 모양 변화에 수반되는 세포 골격 및 막 역동성은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 광표백(photo bleaching) 및 광전환(photo switching)과 같은 더 정교한 이미징 기술을 사용할 수 있습니다.

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연구

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생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

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이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

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여기에서는 초파리 위장 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 설명합니다. 이를 통해 초기 발달과 관련된 정점 수축을 더 잘 이해하고 조직 구조 변형 중 세포 움직임을 제어하는 메커니즘을 더 자세히 분석할 수 있었습니다.

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.

살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

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여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

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배우세요 Drosophila 태아의 세포 형태 변화를 실시간 공초점 이미징으로 관찰하는 방법을. GFP 표지 단백질 프로브를 활용한 이 기술은 발생생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

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